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Resumen

Este protocolo describe tres métodos sobre cómo obtener y utilizar embriones de pollo de 5 a 8 días de edad y su membrana corioalantoidea (CAM) como modelo in vivo para estudiar imágenes de ultrasonido con contraste y administración de fármacos mediada por microburbujas.

Resumen

El embrión de pollo y la membrana corioalantoidea rica en vasos sanguíneos (CAM) es un valioso modelo in vivo para investigar procesos biomédicos, nuevos esquemas de pulsos de ultrasonido o nuevos transductores para imágenes de ultrasonido con contraste y administración de fármacos mediada por microburbujas. Las razones de esto son la accesibilidad de la red de embriones y vasos del CAM, así como los bajos costos del modelo. Un paso importante para obtener acceso al embrión y a los vasos CAM es eliminar el contenido del huevo de la cáscara del huevo. En este protocolo, se describen tres métodos para extraer el contenido de la cáscara del huevo entre el día 5 y 8 de incubación, lo que permite que los embriones se desarrollen dentro de la cáscara del huevo hasta estos días. Los métodos descritos solo requieren herramientas y equipos simples y producen una mayor tasa de éxito de supervivencia del 90% para 5 días, 75% para 6 días, 50% para 7 días y 60% para huevos incubados de 8 días en comparación con embriones cultivados ex ovo (~ 50%). El protocolo también describe cómo inyectar núcleos de cavitación, como microburbujas, en el sistema vascular CAM, cómo separar la membrana que contiene el embrión y CAM del resto del contenido de huevo para estudios ópticamente transparentes, y cómo usar el embrión de pollo y CAM en una variedad de experimentos de ultrasonido a corto plazo. El embrión de pollo in vivo y el modelo CAM son extremadamente relevantes para investigar nuevos protocolos de imágenes, agentes de contraste de ultrasonido y esquemas de pulsos de ultrasonido para imágenes de ultrasonido con contraste mejorado, y para desentrañar los mecanismos de administración de fármacos mediados por ultrasonido.

Introducción

Los embriones de pollo ex ovo y la membrana corioalantoidea (CAM) rica en vasos sanguíneos han demostrado ser un modelo adecuado para investigar diversos procesos biológicos y biomédicos como la embriogénesis, la oncología y la administración de fármacos 1,2,3,4. El ultrasonido se ha utilizado para la obtención de imágenes del desarrollo embrionario del corazón 4,5 y para activar los núcleos de cavitación después de la inyección, como las microburbujas, para la administración de fármacosvasculares 6,7. Los embriones de pollo son baratos, requieren menos infraestructura y equipo, y tienen una legislación menos estricta en comparación con otros modelos animales8. El embrión de pollo y los vasos CAM son fácilmente accesibles después de abrir el huevo, mientras que esto resulta ser mucho más difícil con embriones y vasos de mamíferos. Además de esto, el embrión de pollo y los vasos CAM proporcionan un latido cardíaco y un flujo sanguíneo pulsante. El CAM muestra similitudes en la anatomía de los vasos con los mamíferos y puede ser utilizado para el cribado de drogas 8,9,10. Debido a estas características, los vasos CAM también han demostrado ser un modelo adecuado para investigar la imagen de ultrasonido con contraste (CEUS)11,12,13,14,15,16. Además, el modelo puede ser utilizado para investigar ópticamente el comportamiento de los agentes de contraste de ultrasonido en un campo de ultrasonido utilizando una cámara de ultra alta velocidad y el efecto de la fuerza de radiación acústica en la propulsión, unión y extravasación de fármacos 7,17,18,19. Aunque el embrión de pollo y CAM son menos adecuados para experimentos a largo plazo, pueden ser beneficiosos para experimentos in vivo a corto plazo.

Para aumentar la visibilidad y la capacidad de control sobre el embrión de pollo y CAM durante los experimentos, es importante sacar el contenido de huevo que contiene el embrión y CAM de la cáscara de huevo18. Los estudios previos de embriones de pollo con agentes de contraste de ultrasonido utilizaron embriones de 5 a 6 días de edad 7,11,12,17,19 y embriones de 14 a 18 días13,14,15,16. Se han descrito múltiples enfoques en detalle para eliminar el contenido de huevo de la cáscara 18,20,21. Sin embargo, hasta donde sabemos, los enfoques publicados anteriormente se centran en eliminar el contenido de huevo de la cáscara del huevo después de 3 días de incubación (es decir, Hamburger & Hamilton (HH) etapa 19-2022), y continuar el cultivo ex ovo. Este enfoque de cultivo ex ovo tiene múltiples desventajas, incluyendo un mayor riesgo de muertes durante el cultivo (~50%)1,18, el uso de antibióticos 18,20 y la disminución de la longitud total del vaso en comparación con el crecimiento in ovo 23. Dado que cultivar el embrión dentro de la cáscara del huevo proporciona el entorno más natural, es más fácil incubar el embrión dentro de la cáscara del huevo hasta el día del experimento. Por esta razón, un enfoque en el que el contenido de huevo se saque de la cáscara del huevo a los 5 a 8 días de incubación sería beneficioso especialmente para experimentos en embriones de 5 a 8 días de edad.

En este protocolo, describimos tres métodos para extraer el contenido del huevo de la cáscara del huevo cuando el embrión está en el día 5 al 8 de desarrollo (HH 26-3522) permitiendo que el embrión se desarrolle dentro de la cáscara del huevo hasta el día del experimento. El tamaño del vaso CAM varía de 10-15 μm de diámetro, en los capilares más pequeños de un embrión de 8 días de edad 24, a 115-136 μm de diámetro en el vaso más grande de embriones de 6 y 8 días de edad24,25. Los tres métodos descritos solo requieren herramientas básicas de laboratorio y reducen el riesgo de complicaciones antes de que el experimento haya comenzado, reduciendo así los costos y la mano de obra innecesarios. También detallamos un método para separar la membrana que contiene el embrión y la CAM del saco vitelino haciendo que la CAM sea ópticamente transparente para estudios de microscopía. Debido a que la membrana que contiene el embrión y la CAM se puede fijar, por ejemplo, en un soporte con una membrana acústica, la configuración también se puede hacer acústicamente transparente26, lo que permite la combinación de estudios de microscopía y ultrasonido cuando la trayectoria de la luz se verá afectada por la yema. Finalmente, describimos varias otras configuraciones de ultrasonido que se pueden usar para imágenes de ultrasonido o CEUS.

Protocolo

Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de conformidad con la Ley de Experimentos con Animales de los Países Bajos y de conformidad con el Consejo Europeo (2010/63/UE) sobre la protección del uso de los animales con fines científicos.

1 . Protocolo de preparación embrionaria

  1. Incubación de los huevos de gallina fertilizados
    1. Guarde los huevos de gallina recién fertilizados a 15 °C durante un máximo de una semana.
    2. Para incubar los huevos fertilizados, colóquelos verticalmente con el lado puntiagudo hacia abajo en una incubadora humidificada a 37 °C. No es necesario girar los huevos durante la incubación.
      NOTA: Escriba la fecha de inicio de la incubación de la parte superior del huevo utilizando un marcador permanente.
  2. Preparación de embriones de hasta 5 días (120 h) de edad (HH etapa 26-28)22
    1. Preparación del área de trabajo
      1. Calentar una placa calefactora a 37 °C.
      2. Coloque un soporte de huevos metálico (Figura 1A, B), un soporte para bote de pesaje de metal (Figura 1C, D) y un erlenmeyer de 10 ml lleno de PBS en la placa calefactora.
      3. Llene un bote de pesaje (85 mm × 85 mm × 25 mm) con una capa de 10 mm de gel de ultrasonido y coloque el bote de pesaje lleno en el soporte para pesaje de metal precalentado.
        NOTA: Llenar el bote de pesaje con gel de ultrasonido elevará el embrión y la CAM. Esto puede ser beneficioso para la inyección o la obtención de imágenes del embrión y la CAM, pero no es necesario para sacar el embrión y la CAM de la cáscara del huevo.
      4. Prepara unos trozos de cinta (alrededor de 3 cm de longitud) con parte de un extremo doblado hacia atrás para que no se pegue más.
    2. Sacar el contenido del huevo de la cáscara del huevo
      1. Tome un huevo fertilizado incubado de 5 días de edad y transfiéralo al soporte de huevos metálico precalentado (Figura 1A, B). Asegúrese de mantener el huevo en la misma orientación (es decir, la fecha en la parte superior).
        NOTA: Es importante mantener el óvulo en la misma orientación para mantener el saco de aire y el embrión y la CAM en la misma posición en la parte superior del huevo.
      2. Use la parte posterior puntiaguda de una pinza (o similar; Figura 1E) para hacer una pequeña sangría en la parte superior del huevo (donde está escrita la fecha) (Figura 2A).
      3. Use la parte posterior puntiaguda de las pinzas para hacer una segunda sangría en el lado del huevo alrededor de 2/3 hacia abajo del huevo (Figura 2B).
        NOTA: Tenga cuidado de no hacer la sangría demasiado grande y crear un agujero. Si por accidente se crea un agujero, selle el agujero con cinta adhesiva y no haga otra sangría.
      4. Usando las pinzas más grandes (Figura 1E), saque un pequeño trozo de cáscara de huevo del área dentada en la parte superior del huevo (con fecha escrita). Asegúrese de que el saco de aire en la parte superior de la cáscara del huevo haga contacto con el aire fuera del huevo, pero no penetre demasiado profundamente en la cáscara.
        NOTA: Si la cáscara se penetra demasiado profundo al hacer la sangría superior, el embrión y la CAM podrían dañarse y el embrión no sobrevivirá a la eliminación de la cáscara. Es importante que el pequeño orificio en la parte superior cree contacto de aire entre el interior y el exterior del huevo. Si esto no se hace, se creará un vacío en los siguientes pasos del procedimiento que dará como resultado grandes burbujas de aire atrapadas debajo de la CAM haciendo que el embrión y la CAM sean inútiles. Para verificar la posición del saco de aire dentro del huevo, se puede usar una fuente de luz ya que su posición no siempre está exactamente en la parte superior y también puede estar más hacia un lado.
      5. Use una jeringa de 5 ml y una aguja de 19 g para penetrar la cáscara a través de la segunda sangría en el lado 2/3 hacia abajo del huevo y extraer ~ 2 ml de clara de huevo (Figura 2C).
        NOTA: Asegúrese de que la aguja apunte hacia abajo hacia la parte inferior del huevo para evitar la posibilidad de dañar el embrión y la CAM. Este paso crea una bolsa de aire más grande en la parte superior del huevo necesaria para eliminar el contenido del huevo. Si accidentalmente se crea un orificio en lugar de una sangría en el paso 1.2.2.3, perfore la cinta con la aguja para extraer la clara de huevo. Vuelva a sellar el pinchazo con otro trozo de cinta.
      6. Saque la aguja y use cinta adhesiva para sellar el espacio lateral (Figura 2D).
        NOTA: Para evitar que la clara de huevo se escape del huevo, el orificio superior se puede cerrar con un dedo antes de sacar la aguja. Si la clara de huevo sigue goteando con la cinta ya en su lugar, primero retire la clara de huevo con un trozo de pañuelo de papel para asegurarse de que la cinta se pegue correctamente.
      7. Vacíe la jeringa añadiendo la clara de huevo al bote de pesaje.
      8. Use las pinzas grandes (Figura 1E) para agrandar la pequeña abertura en la parte superior del huevo (Figura 2E). Al mirar dentro del huevo a través de la abertura en la parte superior, el embrión y CAM son visibles. Siga localizando el embrión y la CAM mientras retira la mayor cantidad posible de cáscara de huevo (Figura 2F).
        NOTA: Siga moviendo el huevo para mantener la máxima visibilidad sobre la posición del embrión y CAM dentro de la cáscara. Asegúrese de que el borde de la abertura en la carcasa no baje más abajo que la CAM. Además de esto, no penetre en la membrana interna y evite bordes afilados.
      9. Después de crear la abertura, gire el huevo 180 ° y vuelva a colocarlo en el soporte del huevo de tal manera que la abertura creada en la parte superior del huevo ahora esté orientada hacia la parte inferior. El embrión flotará hacia arriba y se volverá invisible desde la parte inferior (Figura 2G) que tarda 1-2 min. Asegúrese de que todo el embrión y la CAM (incluidos todos los vasos) hayan desaparecido y que solo la yema sea visible antes de continuar con el siguiente paso (Figura 2H).
        NOTA: Si el embrión todavía es visible desde la parte inferior después de 2 minutos, gire el huevo en el sentido de las agujas del reloj durante 1-2 minutos. Esto ayudará al embrión y a la CAM a flotar.
      10. Retire la cinta de la abertura lateral. Mire si el interior del huevo ahora sobresale de la abertura inferior. Si este es el caso, continúe con el siguiente paso. Si no es así, use la aguja de la jeringa para perforar la abertura lateral una vez más para liberar el vacío en el huevo. Asegúrese de apuntar hacia arriba con la aguja para evitar la posibilidad de perforar el saco vitelino. Continúe hasta que el huevo sobresalga de la abertura inferior.
      11. Mientras sostiene el fondo del huevo cerca del bote de pesaje en el soporte metálico del bote de pesaje (Figura 1C, D), rasque suave pero rápidamente la membrana en todo el ancho de la abertura utilizando uno de los puntos afilados de la pinza pequeña (Figura 1F) y deje caer suavemente el contenido del huevo en el bote de pesaje (Figura 2I).
        NOTA: Si el contenido de huevo no sale, use la aguja de la jeringa para perforar la abertura lateral nuevamente con la aguja apuntando hacia arriba.
      12. Si el embrión está en el bote de pesaje hacia los lados, generalmente subirá solo. Si esto no sucede, use un pedazo de papel de seda para reposicionar el embrión. Coloque un lado del papel de seda sobre el embrión, arrastre el papel de seda al otro extremo y suelte el papel de seda con unas gotas de ~ 30 μL de PBS (37 ° C) con una pipeta de plástico Pasteur.
      13. Verifique visualmente si el embrión está vivo asegurándose de que el latido del corazón todavía esté presente, que los vasos CAM estén intactos y que no haya sangrado, y que no haya fugas de yema. Si una de estas cosas no es correcta, descarte el embrión y la CAM porque no será viable.
      14. Asegúrese de que el embrión y la CAM se mantengan a 37 °C y no se sequen porque esto hará que los vasos CAM se deterioren y, finalmente, el embrión muera. Para evitar esto, aplique regularmente pequeñas gotas de ~ 30 μL de PBS a 37 ° C en el embrión y CAM.
  3. Preparación de embriones de 6 a 7 días (144-168 h) (estadio HH 28-32)22
    1. Preparación del área de trabajo
      1. Preparar la etapa como se describe en la sección 1.2.1.
    2. Sacar el contenido del huevo de la cáscara del huevo
      1. Dos horas antes del experimento, tome un huevo incubado de 6 a 7 días de edad y gire el huevo 180 ° dentro de la incubadora para que la parte superior del huevo esté orientada hacia la parte inferior. Después de 1 h, gire el huevo a su posición original y déjelo durante otra 1 h.
        NOTA: Rotar el huevo 2 h antes del experimento hará que sea más fácil sacar el contenido del huevo de la cáscara.
      2. Después de rotar, tome el huevo de la incubadora.
      3. Realice el paso 1.2.2.2 hasta el paso 1.2.2.4.
      4. Use una jeringa de 5 ml y una aguja de 19 g para penetrar la cáscara a través de la segunda hendidura en el lado 2/3 hacia abajo del huevo y retire entre 5-6 ml de clara de huevo. Asegúrese de que la aguja apunte hacia abajo hacia el fondo del huevo.
        NOTA: Con la jeringa de 5 ml que utilizamos, es posible extraer hasta 6 ml, por lo que solo se necesita una penetración.
      5. Saque la aguja y use un trozo de cinta adhesiva para sellar el espacio lateral (Figura 2D).
      6. Vacíe la jeringa agregando la clara de huevo al gel de ultrasonido en el bote de pesaje.
      7. Use las pinzas grandes (Figura 1E) para agrandar la pequeña abertura en la parte superior del huevo (Figura 2E). Trate de hacer la abertura lo más grande posible, pero asegúrese de que el borde de la abertura en la carcasa no baje más abajo que la CAM. Además de esto, no penetre en la membrana interna y trate de evitar bordes afilados.
      8. Llene una jeringa con ~1 ml más de PBS a 37 °C que el volumen extraído durante el paso 1.3.2.4.
      9. Retire la cinta del espacio lateral, penetre el espacio con la jeringa llena y vacíela en la carcasa. Asegúrese de que la aguja apunte hacia abajo hacia el fondo del huevo.
        NOTA: Dado que la clara de huevo tiene una viscosidad más alta (~ 160 cP)27 que PBS (~ 1 cP), la sustitución de la clara de huevo con PBS reduce tanto la tensión como el estrés en el embrión y CAM mientras se elimina el contenido de huevo de la cáscara.
      10. Saque la aguja y vuelva a sellar rápidamente el espacio con un trozo de cinta adhesiva (Figura 2D).
      11. Gire el huevo 180 ° y vuelva a colocarlo en el soporte de huevos de tal manera que la abertura creada en la parte superior del huevo ahora esté orientada hacia la parte inferior. Gire el huevo en el sentido de las agujas del reloj hasta que todo el embrión y la CAM (incluidos todos los vasos) hayan desaparecido y solo la yema sea visible.
      12. Realice el paso 1.2.2.10 hasta el paso 1.2.2.14.
  4. Preparación de embriones de 8 días (192 h) (HH estadio 32-35)22
    1. Preparación del área de trabajo
      1. Calentar una placa calefactora a 37 °C.
      2. Coloque un soporte para bote de pesaje de metal (Figura 1C, D) y un erlenmeyer de 10 ml lleno de PBS en la placa calefactora.
      3. Tome un recipiente poco profundo de 170 x 110 x 70 mm, o similar, y llene el recipiente con 1 L de PBS a 37 °C.
      4. Colocar un pesador (85 × 85 × 25 mm) en una placa de Petri de 90 mm de diámetro. Coloque la placa de Petri y el bote de pesaje en el fondo del recipiente y asegúrese de que estén completamente sumergidos.
    2. Sacar el contenido del huevo de la cáscara del huevo
      1. Dos horas antes del experimento, tome un huevo incubado de 8 días y gire el huevo 180 ° dentro de la incubadora para que la parte superior del huevo esté orientada hacia la parte inferior. Después de 1 h, gire el huevo a su posición original y déjelo durante otra 1 h.
        NOTA: Rotar el huevo 2 h antes del experimento hará que sea más fácil sacar el contenido del huevo de la cáscara.
      2. Tome un huevo incubado de 8 días de la incubadora.
      3. Sostenga el huevo horizontalmente y use la parte posterior puntiaguda de la pinza grande (Figura 1E) para hacer una pequeña hendidura 1/2 abajo del huevo. Continúe haciendo pequeñas hendiduras en un patrón de anillo de 360 ° alrededor de la cáscara del huevo. Utilice un espacio de ~10 mm entre las sangrías.
        NOTA: Durante este procedimiento, pueden comenzar a formarse pequeñas grietas entre las sangrías.
      4. Después de crear las pequeñas hendiduras alrededor de la cáscara, haga un agujero más grande agrietando la cáscara entre dos hendiduras pequeñas usando la parte posterior puntiaguda de la pinza grande.
      5. Sumergir completamente el huevo en el PBS a 37 °C y mantenerlo sumergido durante 5 min. Después de 5 minutos, mantenga el huevo cerca del bote de pesaje dentro del recipiente. Coloque la parte superior de ambos pulgares en el orificio grande y abra suavemente el huevo. El huevo se agrietará a lo largo de las pequeñas hendiduras.
      6. Cuando la grieta se forme alrededor de la cáscara del huevo, trate suavemente de separar las dos piezas de cáscara de huevo y siga moviendo suavemente las dos piezas hacia adelante y hacia atrás hasta que el contenido del huevo se separe de la cáscara. Luego, deje caer suavemente el contenido del huevo en el bote de pesaje.
        NOTA: Al mover las dos piezas de cáscara de huevo hacia adelante y hacia atrás, más PBS fluirá hacia la cáscara del huevo, lo que ayudará a separar el contenido del huevo de la cáscara. A veces, un poco de clara de huevo se pegará al interior de la cáscara del huevo. Cuando esto suceda, use las pinzas para separar la clara de huevo de la cáscara.
      7. Levante lentamente la placa de Petri que contiene el bote de pesaje y el contenido de huevos del PBS. Cuando esté fuera del PBS, incline ligeramente el bote de pesaje para eliminar el exceso de PBS.
      8. Coloque el bote de pesaje que contiene el contenido de huevo en el soporte del bote de pesaje de metal y muévase a la configuración experimental deseada.

2. Aplicaciones seleccionadas

  1. Inyección de microburbujas y/u otras soluciones en los recipientes CAM
    1. Preparación de la configuración de la inyección
      1. Extraiga agujas de vidrio de tubos capilares de vidrio usando una microforja (Figura 3A) o compre agujas capilares de vidrio desmenuzado.
      2. En caso de que la punta de la aguja capilar de vidrio no esté biselada, rompa una pequeña parte de la punta de la aguja. Llene la aguja de vidrio con aceite mineral y colóquela en un sistema de microinyección. Asegúrese de que no haya burbujas de aire en el aceite mineral en la aguja de vidrio.
        NOTA: El aceite mineral se agrega según las instrucciones del fabricante del sistema de inyección que utilizamos.
      3. Vacíe la aguja capilar de vidrio tirado hasta donde lo permita el sistema de microinyección y rellene parcialmente la aguja de vidrio con aire.
        NOTA: El poco de aire evitará la mezcla del aceite mineral y la solución a inyectar.
      4. Poner 10 μL de la solución deseada, en este protocolo microburbujas, sobre un trozo de película cerosa (Figura 3B). Si se necesita más de una solución, se pueden mezclar las soluciones antes del pipeteo7.
        NOTA: Antes de llenar la aguja con microburbujas, deje la gota de microburbujas en la película cerosa durante ~ 1 minuto para que las microburbujas floten hasta la parte superior de la gota y se concentren. Para el agente de contraste de ultrasonido personalizadotipo F 28, este paso de concentración aumentará la concentración de microburbujas a inyectar en ~ 30%. La concentración posterior a la inyección en la sangre del embrión de pollo estará entre 32 x 103 microburbujas/μL para embriones de 5 días de edad y 19 x 103 microburbujas/μL para embriones de 6 días.
      5. Llene la aguja de vidrio con la microburbuja y/u otra solución colocando la punta de la aguja de vidrio en la gota de la película cerosa. Al aspirar microburbujas, asegúrese de colocar la punta de la aguja en la parte superior de la gota de líquido para aspirar la solución enriquecida con microburbujas.
        NOTA: Antes de inyectar microburbujas, levante la punta de la aguja de vidrio a su punto más alto y espere ~ 2 minutos. Esto asegurará que las microburbujas se concentren en la punta de la aguja de vidrio.
  2. Inyección en los recipientes CAM
    1. Antes de la inyección, mire la CAM bajo un microscopio estereoscópico y seleccione el mejor recipiente para inyectar. Siempre inyecte en una de las venas del embrión. Estos son los vasos en los que el flujo sanguíneo se mueve hacia el embrión. Las venas son de color más claro que las arterias debido a la sangre oxigenada29. Además, las venas siempre están en la parte superior de la arteria con dos excepciones, a saber, las venas vitelinas anteriores y posteriores (es decir, las venas menos ramificadas, indicadas con asteriscos en la Figura 6A, B) que no tienen una arteria en su entorno.
      NOTA: La inyección en una de las ramas limitará la obstrucción del flujo sanguíneo durante la inyección. Se han indicado buenos sitios de inyección con puntas de flecha en la figura 6A, B. Es crucial inyectar en la vena, ya que esto obligará a la sustancia inyectada a fluir hacia el embrión. Además de esto, inyectar en la arteria resultará en un sangrado masivo al retirar la aguja de vidrio que matará al embrión.
    2. Coloque la aguja de vidrio y el embrión de tal manera que la punta de la aguja de vidrio y la vena seleccionada estén en el mismo plano focal y en la misma línea de dirección. Trate de colocar la aguja lo más horizontal posible paralela a la vena seleccionada. La punta de la aguja debe tocar la pared del vaso.
      NOTA: Al colocar la aguja de vidrio lo más horizontal posible, la posibilidad de perforar todo el vaso es menor.
    3. Después del posicionamiento, avance lentamente y penetre la pared del vaso con la aguja de vidrio. Durante la penetración, la CAM primero será empujada hacia afuera por el movimiento de la aguja de vidrio. Siga avanzando la aguja de vidrio hasta que se penetre la pared del vaso.
      NOTA: Si por accidente el vaso se perfora de principio a fin, retraiga lentamente la aguja para volver a la luz. Cuando esté de vuelta dentro de la luz, levante ligeramente la aguja hacia arriba y avance a lo largo del vaso para reposicionar la aguja.
    4. Después de la penetración, retraiga ligeramente la aguja de vidrio para colocar mejor la punta dentro de la luz del vaso y mueva la aguja de vidrio hacia los lados para verificar que no esté unida a la pared del vaso. Inyecte lentamente una pequeña cantidad de la solución para confirmar que la punta está colocada dentro de la luz del vaso (Figura 3C).
    5. Asegúrese de que la solución inyectada siga el flujo sanguíneo. Si no es así, mueva ligeramente la aguja de vidrio y siga inyectando pequeñas cantidades hasta que la aguja de vidrio esté colocada correctamente17.
    6. Cuando se inyecte la cantidad deseada, deje la aguja de vidrio en el recipiente durante ~ 15 s para evitar un sangrado masivo. Luego, mueva la aguja de vidrio un poco hacia los lados, hacia arriba y hacia abajo, y hacia adelante y hacia atrás varias veces para permitir una retracción suave de la aguja de vidrio.
      NOTA: Algo de sangrado es normal. Para cada inyección, use una aguja de vidrio nueva porque la aguja de vidrio se obstruye fácilmente y se embota con la clara de huevo.
  3. Imágenes microscópicas del embrión y/o vasos CAM
    1. Soporte de preparación con membrana acústica
      1. Tome una cámara de cultivo celular que consiste en un soporte de plástico cuadrado con dos membranas paralelas de policarbonato acústicamente transparentes de 50 μmde espesor 26, también denominadas soporte con membrana acústica. Cierre ambos puertos con una tapa.
      2. Use un bisturí para eliminar una de las dos membranas del soporte con membrana acústica.
        NOTA: Para quitar la membrana, corte la membrana justo al lado de la línea de pegamento en el plástico. Tenga cuidado de no resbalarse del borde para evitar daños a la otra membrana.
      3. Prepare ~ 15 ml de agarosa al 2% en una solución de agua demi calentando entre 80-95 ° C en un vaso de precipitados de vidrio pequeño. Enfríe el vaso de precipitados de vidrio con la solución de agarosa disuelta bajo un grifo de agua fría.
        NOTA: Si la agarosa está demasiado caliente, derretirá la membrana acústica, lo que creará una superficie irregular.
      4. Cuando la solución se enfríe hasta unos 37 °C, vierta lentamente la solución en el soporte con membrana acústica hasta que llene todo el soporte. Incline ligeramente el soporte con una membrana acústica para que la capa de agarosa se distribuya uniformemente dentro del marco de plástico (Figura 4A). Asegúrese de que la capa de agarosa sea plana y deje que la agarosa se fije a temperatura ambiente.
    2. Extracción de embrión y CAM del saco vitelino y colocación en soporte con membrana acústica
      1. Extraer el contenido de huevo del huevo como se describe en las secciones 1.2, 1.3 o 1.4.
      2. Si es necesario, inyecte la MCA con microburbujas y/u otra(s) solución(es) como se describe en la sección 2.1.2.
      3. Llene una placa de Petri de 1 L con ~500 ml de PBS a 37 °C y coloque el soporte con membrana acústica con agarosa en el fondo del plato. Asegúrese de que la capa de agarosa esté hacia arriba.
      4. Use tijeras pequeñas para cortar rápidamente la membrana del saco vitelino, también llamada membrana Vitellus, alrededor de toda la CAM mientras el contenido de huevo está en el bote de pesaje (Figura 4B). Mantenga las tijeras en la misma posición y gire el bote de pesaje mientras corta para una mejor precisión y más velocidad.
        NOTA: Desde el momento en que se realiza el primer corte, la yema comenzará a gotear. Esto reduce la visibilidad del embrión y CAM. Trate de cortar todo el camino alrededor de la CAM dentro de 6-7 cortes. Esto no debería tomar mucho más de 20 s. Las pinzas pequeñas (Figura 1F) se pueden usar para sostener el borde de la membrana vitelina y evitar el corte en la CAM.
      5. Use una cucharada para recoger la membrana recortada que contiene el embrión y la CAM del bote de pesaje. Levante lentamente la cuchara del bote de pesaje e inspeccione visualmente si la membrana recortada que contiene el embrión y la CAM todavía están unidas a la membrana restante del saco vitelino. Cuando este sea el caso, use las tijeras para hacer un corte adicional. Mientras recoge, incline ligeramente la cuchara para deshacerse de la mayor cantidad de yema posible, pero no deje que se seque. Transfiera la membrana recortada que contiene el embrión y la CAM a la placa de Petri de 1 L, sumérjala en el PBS a 37 °C y retire la cuchara.
      6. Cuando la membrana que contiene el embrión y la CAM se sumerge en el PBS de 37 °C, use las pinzas pequeñas (Figura 1F) para agarrar un borde de la membrana y gire suavemente alrededor de la membrana para deshacerse de la yema que todavía está adherida.
      7. Cuando se retire toda la yema, use las pinzas pequeñas para mover la membrana que contiene el embrión y CAM y colóquela por encima del soporte con membrana acústica.
      8. Use un alfiler de muestra de insecto para fijar la membrana que contiene el embrión y la CAM en una esquina. Evite perforar los vasos en el CAM y solo fije la membrana.
      9. Use un segundo alfiler de muestra de insecto para fijar la membrana que contiene el embrión y CAM en la esquina diagonalmente opuesta.
      10. Levante lentamente el soporte con la membrana acústica que contiene el embrión y CAM desde el PBS a 37 °C. Incline ligeramente el soporte para deshacerse de la mayor parte del PBS.
      11. Utilice las pinzas pequeñas (Figura 1F) para estirar y distribuir uniformemente la membrana que contiene el embrión y CAM sobre el soporte con membrana acústica y fijar el resto de la membrana. Asegúrese de que la membrana que contiene el embrión y la CAM esté ligeramente estirada para asegurar que sea plana (Figura 4C).
      12. Coloque el soporte con membrana acústica con la membrana fijada que contiene el embrión y la CAM en una configuración de microscopía que se mantenga a 37 °C.
      13. Coloque un cubreobjetos o una membrana acústica y ópticamente transparente (dependiendo del objetivo deseado y el uso de ultrasonido o no) sobre la región de interés en el embrión o CAM (Figura 4D) para permitir la visualización óptica.
  4. Imágenes de ultrasonido del embrión de pollo y / o vasos CAM
    1. Imágenes de ultrasonido del lado del embrión de pollo y los vasos CAM
      1. Extraer el contenido de huevo como se describe en las secciones 1.2, 1.3 o 1.4. Sin embargo, no utilice un barco de pesaje estándar. En su lugar, utilice un barco de pesaje hecho a medida con una pared acústicamente transparente.
        NOTA: El pesador estándar se ajustó cortando un lado del pesaje y reemplazándolo con una ventana de lámina de poliéster que se pegó con pegamento epoxi.
      2. Sumerja el transductor de ultrasonido preferido en un baño de agua a 37 °C y colóquelo en el lugar deseado con la distancia de separación requerida.
      3. Coloque el bote de pesaje en el baño de agua de tal manera que la pared transparente esté orientada hacia el transductor. Asegúrese de que el bote de pesaje esté lo suficientemente profundo como para estar nivelado con el transductor, pero evite que el agua entre en el bote de pesaje (figura 5A).
      4. Si lo desea, agregue otra configuración a la parte superior de los vasos embrionarios o CAM, como un microscopio o un láser (Figura 5A).
    2. Imágenes de ultrasonido desde la parte superior del embrión y los vasos CAM sin interferencia acústica
      1. Llene un vaso de precipitados de 2 L con PBS a 37 °C. Coloque un vaso de precipitados de 500 ml boca abajo en la parte inferior del vaso de precipitados de 2 L. Evite el aire dentro del vaso de precipitados de 500 ml.
        NOTA: El vaso de precipitados de 500 ml está destinado a elevar el bote de pesaje que contiene el contenido de huevo más cerca de la superficie de PBS. Al sustituir el vaso de precipitados por objetos de otros tamaños, se puede variar la distancia entre el transductor y el contenido del huevo.
      2. Coloque el vaso de precipitados de 2 L lleno con el vaso de precipitados de 500 ml en el interior en un baño maría a 37 °C.
      3. Extraer el contenido de huevo como se describe en las secciones 1.2, 1.3 o 1.4.
      4. Mojar el contenido de huevo con PBS a 37 °C y cubrir el embrión con film transparente transparente. Esto se puede hacer para mantener el embrión en la misma posición y evitar que gire o flote.
        NOTA: Al humedecer el contenido del huevo con PBS, se volverá menos pegajoso, lo que facilita cubrir el contenido del huevo con una película transparente transparente.
      5. Coloque el bote de pesaje con el contenido de huevo en una placa de Petri de 90 mm de diámetro y sumerja lentamente la placa de Petri en el PBS (Figura 5B).
        NOTA: El uso de dos abrazaderas en los lados de la placa de Petri opuestas entre sí facilita la inmersión de la placa de Petri.
      6. Coloque el transductor de ultrasonido con la distancia de separación deseada.
    3. Imágenes de ultrasonido del embrión de pollo y los vasos CAM con un transductor móvil
      1. Extraer el contenido de huevo como se describe en las secciones 1.2, 1.3 o 1.4.
      2. Preparar una solución de agarosa al 2% en agua demi calentando la solución hasta entre 80-95 °C en un vaso de precipitados de vidrio pequeño. Enfríe el vaso de precipitados de vidrio con la solución de agarosa disuelta bajo una lengüeta de agua fría.
      3. Vierta la solución de agarosa en un recipiente plano para crear una almohadilla de agarosa de aproximadamente 1 mm de espesor. Cuando esté completamente enfriado y fraguado, corte la almohadilla de agarosa al tamaño deseado con un bisturí.
        NOTA: El grosor de la almohadilla de agarosa se puede cambiar para obtener la distancia focal deseada necesaria para el correcto funcionamiento del transductor de ultrasonido.
      4. Coloque la almohadilla de agarosa encima del embrión y CAM (Figura 5C). Agregue unas gotas de ~ 30 μL de PBS a 37 °C en la parte superior de la almohadilla de agarosa para crear una capa delgada de PBS entre la almohadilla de agarosa y el transductor.
        NOTA: El uso de PBS evitará que el transductor se pegue a la almohadilla de agarosa. Esto es beneficioso cuando, por ejemplo, se utiliza un motor para mover mecánicamente un transductor bidimensional para realizar un escaneo tridimensional (Figura 9B)11. Cuando no es necesario mover el transductor, el PBS también se puede sustituir con gel de ultrasonido.
      5. Coloque el transductor de ultrasonido deseado.

Resultados

En este protocolo, describimos tres métodos para sacar el contenido del huevo de la cáscara en el día 5-8 de incubación (HH 26-3522). La figura 6 muestra el contenido de huevo en los botes de pesaje después de sacarlo de la cáscara. El embrión de 5 días de edad y la MCA (Figura 6A) se extrajeron utilizando el método descrito en la sección 1.2. Los embriones de 6 y 7 días de edad y la MCA (Figura 6B,C) se extrajeron utilizando el método descrito en la sección 1.3. El embrión de 8 días de edad y la MCA (Figura 6D) se extrajeron utilizando el método descrito en la sección 1.4. No se puede observar sangrado o daño al embrión o CAM, lo que indica que estos métodos se pueden usar para sacar de manera segura el contenido del huevo de la cáscara sin dañar el embrión o los vasos CAM. Cuando se ejecuta correctamente, el método para los embriones de 5 días de edad proporcionará un embrión viable y CAM intacto en el 90% de todos los procedimientos. La tasa de viabilidad se basa en el número total de huevos fertilizados extraídos con éxito de la cáscara del huevo. Con el segundo método, para huevos incubados de 6 y 7 días, la probabilidad de un embrión viable y CAM intacta es de alrededor del 75% para los 6 días de edad y alrededor del 50% para los de 7 días. Con el tercer método descrito para embriones de 8 días de edad, la probabilidad de un embrión viable y CAM intacto es de alrededor del 60%. Se pueden observar diferencias en las etapas de desarrollo entre los embriones de 5 y 8 días de edad, lo que coincide con Hamburger y Hamilton22. Tanto el tamaño del embrión como la complejidad de los vasos CAM aumentan durante el desarrollo (Figura 6A-D). La Figura 6C muestra un parche delgado de agarosa en la parte superior del contenido del huevo que permite obtener imágenes del embrión y la CAM utilizando la configuración de ultrasonido que se muestra en la Figura 5C. Después de que el contenido del huevo se saca de la cáscara, el latido del corazón del embrión es visible a simple vista. La frecuencia cardíaca de estos embriones ex ovo es similar a la de los embriones in ovo a 183 latidos por minuto (lpm) en el día 5 hasta ~ 208 lpm en el día 830. Cuando se mantiene humidificado y a 37 °C, el embrión mantendrá esta frecuencia cardíaca durante ~ 5 h en las configuraciones de ultrasonido experimentales.

Múltiples complicaciones pueden ocurrir durante los tres métodos descritos anteriormente. La Figura 7A muestra el aire atrapado debajo de la CAM, lo que hace que el embrión no sea adecuado para la ecografía y la presión de la(s) burbuja(s) de aire también puede dañar el embrión y/o CAM. Este problema surge cuando el saco de aire dentro de la cáscara no hace contacto con el aire fuera de la cáscara al sacar el contenido del huevo de la cáscara. La figura 7B muestra una pequeña fuga de yema del saco vitelino en la parte superior derecha de la imagen. Esto puede ocurrir al sacar el contenido del huevo de la cáscara cuando el saco vitelino se daña por los bordes afilados de la cáscara o cuando el saco vitelino es penetrado por las pinzas. La fuga de la yema puede afectar la visibilidad del embrión y los vasos CAM. La Figura 7C muestra un embrión en el que una burbuja de aire queda atrapada debajo del CAM. Esto ocurre a veces en el desarrollo embrionario. Otra complicación que puede ocurrir es el daño a los vasos. Este daño se puede crear al sacar el contenido del huevo de la cáscara o al realizar una inyección (Figura 7D). Además de esto, el embrión y los vasos también pueden secarse con el tiempo (Figura 7E). Esto ocurre cuando el contenido de huevo no se rocía con PBS. La desecación del embrión puede dar lugar a obstrucciones capilares masivas (Figura 7F) que afectan a la viabilidad del embrión. Las obstrucciones capilares masivas también pueden ocurrir durante el desarrollo o cuando el latido del corazón del embrión no es estable.

Después de sacar el contenido del huevo de la cáscara sin ninguna complicación, se puede inyectar al embrión con, por ejemplo, agentes de contraste de ultrasonido como microburbujas (Figura 3C). La figura 8 muestra microburbujas circulantes en la luz del vaso sanguíneo tras la inyección. Estas microburbujas se transportan junto con el flujo sanguíneo y permanecen presentes en la circulación sanguínea durante varias horas (Video suplementario 1). La presencia de estas microburbujas en la circulación crea la posibilidad de realizar diferentes tipos de CEUS y experimentos de administración de fármacos 7,11,12. El CAM es ideal para investigar nuevos métodos de detección de contraste por ultrasonido para los cuales mostramos tres ejemplos. La Figura 9A muestra imágenes subarmónicas de ultrasonido de alta frecuencia de un embrión de pollo de 6 días de edad en modo B y CEUS antes y después de la inyección de microburbujas. Aquí, los vasos CAM fueron inyectados con 5 μL de agente de contraste de ultrasonido y las imágenes se realizaron con una máquina de ultrasonido animal preclínico con una sonda MS250 (30 MHz de transmisión y 15 MHz de frecuencia de recepción, 10% de potencia). Antes de la inyección de microburbujas, el contraste ya se puede ver dentro del corazón embrionario en las imágenes en modo B (Figura 9A-I). Este fenómeno se debe a la presencia de un núcleo en el glóbulo rojo aviar que aumenta el contraste de sangre en la ecografía 5,31. La adición de las microburbujas aumentó el contraste y la visibilidad del embrión, tanto en el B-Mode como en la imagen CEUS. La Figura 9B muestra una imagen óptica y una imagen subarmónica 3D de alta frecuencia de un embrión de 6 días de edad y los vasos circundantes. El CAM se inyectó con 5 μL de agente de contraste de ultrasonido y las imágenes se realizaron con una máquina de ultrasonido animal preclínica con sonda MS550s (frecuencia de transmisión de 40 MHz, presión negativa máxima ~ 300 kPa). Estos resultados muestran que la imagen CEUS combinada con un agente de contraste también se puede utilizar para crear imágenes subarmónicas 3D de alta frecuencia y para obtener imágenes de los vasos sanguíneos fuera del embrión. La Figura 9C muestra una imagen óptica y una imagen de ultrasonido intravascular ultraarmónico (IVUS) realizada con una sonda personalizada de microvasos CAM de un embrión de 6 días de edad (transmisión de 26 MHz y frecuencia de recepción de 39 y 65 MHz). Los vasos CAM fueron inyectados con 4 ± 1 μL de agente de contraste de ultrasonido. La imagen óptica y la imagen IVUS son del mismo embrión y la misma región de interés que muestra las redes de vasos correspondientes.

El embrión de pollo y los vasos CAM también se pueden usar para investigar la administración de fármacos mediada por ultrasonido, para lo cual mostramos un ejemplo. Dado que la yema obstruye la trayectoria de la luz durante la obtención de imágenes, la extracción del saco vitelino es necesaria para investigar ópticamente la administración del fármaco en el embrión y los vasos CAM. Para este estudio, el embrión y la MCA se prepararon para la obtención de imágenes microscópicas como se explica en la sección 2.2 separando la membrana que contiene el embrión y la CAM del saco vitelino (Figura 4C). En estos embriones, la frecuencia cardíaca es estable alrededor de 80 lpm y los embriones permanecen vivos hasta 2 h cuando se mantienen a 37 °C7. La Figura 10 muestra un estudio de administración de fármacos mediado por ultrasonido y microburbujas en células endoteliales de los vasos CAM. Se inyectaron microburbujas recubiertas de lípidos, dirigidas a la pared del vaso utilizando anticuerpos αvβ3-3 y teñidas con el colorante fluorescente DiI7, en los vasos CAM (Figura 10A, C). Los núcleos de células endoteliales de los vasos CAM se tiñeron con Hoechst 33342 (Figura 10B) y se utilizó el fármaco modelo Propidium Iodide (PI) para visualizar la sonoporación7. Ambos colorantes se inyectaron simultáneamente con las microburbujas. Tras el tratamiento con ultrasonido (1 MHz, presión negativa máxima de 200 kPa, ráfaga única de 1000 ciclos), se observó captación de PI en los núcleos más cercanos a las microburbujas objetivo (Figura 10D). Esto muestra que las oscilaciones inducidas por ultrasonido de las microburbujas objetivo fueron capaces de crear un poro en la membrana celular endotelial.

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Figura 1. Equipo de preparación de embriones. (A-B) vista superior y lateral del portahuevos metálico y vista superior y lateral (C-D) del soporte del pesador metálico para embarcaciones. Pinzas (E-F) necesarias para sacar el contenido del huevo de la cáscara. Escala en cm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2. Procedimiento de extracción de embriones. (A) Pequeña hendidura en la parte superior del huevo, indicada por el círculo negro. (B) Pequeña sangría 2/3 abajo del huevo, indicada por el círculo negro. (C) Retirar ~2 mL de clara de huevo. (D) Espacio sellado en el lado con cinta adhesiva. (E) Agrandar la pequeña abertura en la parte superior del huevo. (F) El embrión se hace visible después de quitar parte de la cáscara. (G-H) Después de girar el óvulo 180 °, el embrión flota hacia arriba y se volverá invisible (las flechas indican la dirección de movimiento del embrión). Después de 1-2 minutos, el embrión es invisible desde el fondo. (I) Después de rascar la membrana, el contenido del huevo cae en el bote de pesaje. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3. Inyección de microburbujas en los vasos CAM. (A) Aguja capilar de vidrio. Escala en cm. ( B ) solución de yoduro de propidio (PI) (gota izquierda) y microburbujas (gota derecha) antes de la aspiración antes de la inyección. La aguja (delineada en negro) se puede ver en la esquina superior derecha (C) Inyección de microburbujas. La punta de la aguja capilar se coloca dentro de la luz de una de las venas (izquierda). Las microburbujas, la nube blanca indicada con una flecha, se inyectan y se dispersan siguiendo el torrente sanguíneo (derecha). La barra de escala representa 1 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4. Extracción de embrión y CAM del saco vitelino y colocación sobre soporte con membrana acústica. (A) Soporte con membrana acústica rellena de capa de agarosa. (B) Embrión de pollo y recipiente CAM en bote de pesaje antes del corte. La línea punteada indica la línea de corte alrededor de la CAM. (C) Embrión de pollo y CAM separados de la yema y fijados en la membrana acústica. (D ) Embrión de pollo fijado con una membrana acústica y ópticamente transparente en un soporte (azul) colocado en la parte superior de la CAM. El soporte se puede llenar con agua demi, por lo que se puede utilizar un objetivo de inmersión de agua. Todas las barras de escala representan 1 cm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 5. Diferentes configuraciones para imágenes de ultrasonido CAM y embrión de pollo. (A) Configuración para imágenes de ultrasonido desde el costado. El embrión de pollo se colocó en un bote de pesaje ajustado a medida con una pared acústicamente transparente y se colocó en un baño de agua a 37 ° C. El transductor de ultrasonido se colocó en el lado izquierdo (a) junto a la pared acústicamente transparente y el láser (b) para imágenes fotoacústicas en la parte superior. (B) Configuración para imágenes de ultrasonido desde la parte superior. El embrión y la CAM se sumergieron en un vaso de precipitados de PBS que se colocó en un baño de agua a 37 °C. El contorno discontinuo muestra el vaso de precipitados de vidrio de 2 L (a) con el vaso de precipitados de vidrio de 500 ml (b) dentro. (C) Configuración para imágenes de ultrasonido desde la parte superior con un transductor móvil. Se colocó una almohadilla delgada de agarosa (línea punteada) en la parte superior del embrión con una capa delgada de PBS como acoplamiento entre el transductor y la superficie de agarosa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 6. Contenido de huevo fuera de la cáscara. (A) Contenido de huevo sacado de la cáscara después de 5 días de incubación. La membrana corioalantoidea (CAM), el cuerpo embrionario (EB), las venas vitelinas anteriores y posteriores (*) y los sitios apropiados para la inyección (puntas de flecha) están indicados. (B) Contenido de huevo sacado de la cáscara después de 6 días de incubación. Se indican las venas vitelinas anterior y posterior (*) y los sitios apropiados para inyección (puntas de flecha). (C) Contenido de huevo sacado de la cáscara después de 7 días de incubación. Se coloca un parche de agarosa en la parte superior para permitir la ecografía. Las esquinas del parche de agarosa están indicadas con círculos negros. (D) Contenido de huevo sacado de la cáscara después de 8 días de incubación. Todas las barras de escala representan 1 cm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 7. Complicaciones que pueden ocurrir durante los procedimientos con el embrión de pollo y el modelo CAM. (A ) Burbujas de aire atrapadas debajo de la CAM al extraer el contenido de huevo de la cáscara utilizando el método 1.2 (embrión de 5 días) o 1.3 (embrión de 6 a 7 días). (B) Pequeña fuga de yema indicada con una flecha en la parte superior derecha (embrión de 6 días de edad). (C) Aire atrapado debajo del CAM, indicado por el círculo punteado negro (embrión de 7 días de edad). (D) Sangrado, indicado con las flechas negras (embrión de 5 días de edad. (E) Embrión seco y CAM (embrión de 5 días de edad). (F) Obstrucciones capilares masivas (embrión de 5 días de edad). Todas las barras de escala representan 1 cm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 8. Microburbujas en el vaso sanguíneo CAM. La pared del vaso se indica con una línea punteada y las microburbujas individuales se indican con flechas. La barra de escala representa 20 μm. La grabación de microscopía correspondiente se puede encontrar en el Video Suplementario 1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 9. Imágenes de ultrasonido con contraste en embriones de pollo y vasos CAM. (A) Proyección de máxima intensidad de imágenes en modo B (I, III) y subarmónicas en tiempo real (II, IV) (máquina de ultrasonido animal preclínica con sonda MS250, transmisión de 30 MHz y frecuencia de recepción de 15 MHz, 10% de potencia) de un embrión de 6 días con un parche de agarosa en la parte superior. Las imágenes superiores (I, II) muestran los resultados antes y en la parte inferior (III, IV) después de la inyección de un agente de contraste de ultrasonido de 5 μL. La barra de escala representa 1 mm. Esta imagen ha sido modificada con permiso de Daeichin et al. 201511(B) Imágenes ópticas (izquierda) y subarmónicas 3D (derecha) de un embrión de pollo de 6 días de edad con un parche de agarosa en la parte superior. Los vasos CAM se inyectaron con un agente de contraste de ultrasonido de 5 μL y se realizaron imágenes con una sonda de alta frecuencia (máquina de ultrasonido animal preclínica con sonda MS550s, frecuencia de transmisión de 40 MHz, presión negativa máxima ~ 300 kPa, renderizada en modo 3-D de máquina de ultrasonido animal preclínica). La barra de escala representa 5 mm. Esta imagen ha sido modificada con permiso de Daeichin et al. 201511. (C) Imagen óptica (izquierda) y proyección de intensidad media de ultrasonido intravascular ultraarmónico (IVUS) (derecha) de la microvasculatura CAM de un embrión de 6 días de edad. Los vasos CAM se inyectaron con 4 ± 1 μL de agente de contraste. Las imágenes IVUS ultraarmónicas se realizaron con una sonda IVUS personalizada (frecuencia de transmisión 35 MHz, presión negativa máxima 600 kPa). Ambas imágenes están hechas del mismo embrión y región de interés. Las flechas indican los vasos correspondientes en las dos imágenes. La barra de escala representa 1 mm. Esta imagen ha sido modificada con permiso de Maresca et al. 201412. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 

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Figura 10. Administración de fármacos a células endoteliales del vaso CAM en embriones de 6 días de edad. (A) Imagen de campo claro de seis microburbujas αvβ 3, indicadas con flechas blancas, adheridas a la pared del vaso antes del tratamiento con ultrasonido. (B) Núcleos de células endoteliales teñidos con fluorescencia antes del tratamiento ecográfico. (C) Imagen fluorescente de las microburbujas dianas teñidas, indicadas con flechas blancas, antes del tratamiento ecográfico. (D) Captación del fármaco modelo yoduro de propidio (PI) en los núcleos celulares debajo de las microburbujas objetivo después del tratamiento con ultrasonido (1 MHz, presión negativa máxima de 200 kPa, ráfaga única de 1000 ciclos). La barra de escala representa 10 μm y se aplica a todas las imágenes. Esta imagen ha sido modificada con permiso de Skachkov et al. 20147. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

ARCHIVOS COMPLEMENTARIOS

Video suplementario 1. Microburbujas en el vaso sanguíneo CAM. La barra de escala representa 20 μm. Haga clic aquí para descargar este video.

Discusión

Este protocolo describe tres métodos sobre cómo obtener y utilizar embriones de pollo de 5 a 8 días de edad y su CAM como modelo in vivo para estudiar imágenes de ultrasonido con contraste y administración de fármacos mediada por microburbujas. Los pasos más críticos para sacar de la cáscara embriones de 5 días (sección 1.2) y de 6 a 7 días (sección 1.3) son: 1) hacer que el pequeño orificio en la parte superior del huevo pase a través de toda la cáscara de huevo hacia el saco de aire antes de retirar la clara de huevo; 2) Cree bordes lisos para la gran abertura en la carcasa. Para el método para sacar embriones de 8 días de la cáscara (sección 1.4), los pasos más críticos son: 1) Hacer un número suficiente de hendiduras para crear una buena grieta a lo largo del huevo; 2) Mantenga el huevo sumergido en PBS. Para garantizar la viabilidad embrionaria de todos los métodos, es importante mantener el óvulo y su contenido a 37 °C. Además, evite inyectar en una arteria CAM. Se recomienda controlar visualmente la frecuencia cardíaca del embrión durante los estudios para garantizar la vitalidad del embrión. Para confirmar la etapa exacta de desarrollo del embrión, se puede utilizar la indicación de Hamburger & Hamilton22.

Es importante prevenir el daño al embrión, la CAM y el saco vitelino. Este daño puede afectar la viabilidad, el flujo sanguíneo y la visibilidad del embrión y la CAM. Además, el daño al saco vitelino y, en consecuencia, una baja rigidez de la membrana hace imposible una inyección en los vasos CAM. Un embrión de 5 días tiene un saco de aire relativamente pequeño, por lo que para poder hacer un orificio suficientemente grande en la cáscara a través del cual se puede extraer el contenido del huevo, se deben extraer 2 ml de clara de huevo. Como resultado, se crea más espacio entre la cáscara del huevo y el embrión. Después de retirar la clara de huevo, un trozo de cinta debe cerrar el orificio donde entró la aguja. Si la clara de huevo aún se escapa, aplique otro trozo de cinta. Además, la aplicación de cinta adhesiva en el orificio lateral crea un vacío dentro del huevo que evita que el contenido del huevo se caiga debido a su propio peso cuando se crea el orificio grande en el paso 1.2.2.8. El daño al embrión o CAM también puede ocurrir cuando el borde de la cáscara del huevo era demasiado afilado o cuando el contenido del huevo se deja caer en el bote de pesaje con demasiado rigor, por lo que la cáscara del huevo debe mantenerse muy cerca del bote de pesaje. Entre el día 5 y 6 de desarrollo, el CAM comienza a unirse a la membrana de la cáscara32. Este accesorio aumenta el riesgo de dañar el embrión y la CAM al extraer el contenido del huevo de la cáscara del huevo. Al abrir el huevo después de la inyección de PBS en él para un huevo incubado de 6 a 7 días o en un recipiente lleno de PBS como se describe para un huevo incubado de 8 días, se reduce el riesgo de daño. Con respecto a una inyección en una vena CAM: si la primera inyección falla, se puede hacer una segunda inyección aguas arriba en la misma vena si el daño fue menor o en otra vena CAM. La separación del embrión y la CAM de la yema hace que el embrión y los vasos CAM sean ópticamente transparentes. Como consecuencia, el embrión pierde su principal fuente de nutrientes33. Esta pérdida de nutrientes podría ser una explicación para la frecuencia cardíaca más baja observada de 80 lpm en comparación con ~ 190 para un embrión de 6 días de edad que todavía está en contacto con la yema30 y el tiempo de supervivencia reducido de 2 h después de este procedimiento de separación. Otro factor que puede desempeñar un papel en la reducción de la frecuencia cardíaca y el tiempo de supervivencia es el desafío de mantener el embrión separado por la yema y los vasos CAM a 37 ° C. Una incubadora de etapa de microscopio puede ser de ayuda. Además de esto, el desprendimiento de la CAM de la yema probablemente conduce a cambios mecánicos en el tejido ya que la tensión de la membrana disminuye. La tensión de la membrana inferior puede causar un aumento de la velocidad de cizallamiento del vaso interno que conduce a una frecuencia cardíaca más baja.

El embrión de pollo ex ovo y los vasos CAM tienen algunas limitaciones como modelo in vivo, incluidas solo observaciones de corto tiempo, para imágenes de ultrasonido mejoradas con contraste y estudios de administración de fármacos mediados por microburbujas. Debido al pequeño volumen sanguíneo de 100±23 μL en el día 5 y 171±23 μL en el día 634, se puede inyectar un volumen máximo de ~5 μL. En las últimas etapas de desarrollo (día 7 y mayores), la rigidez del vaso aumenta y la elasticidad de la yema disminuye. Esto puede complicar una inyección exitosa en embriones más viejos. Una vez que se inyectan las microburbujas, circulan durante horas porque el embrión de pollo no tiene un sistema inmune completamente desarrollado en esta etapa35. Por lo tanto, las microburbujas no se eliminan dentro de ~ 6 min como en humanos 36,37 lo que hace que los estudios típicos de imágenes moleculares de ultrasonido con un período de espera de 5-10 minutos para que las microburbujas dirigidas no unidas se eliminen38 no es factible. Para atacar las microburbujas, es necesario utilizar ligandos adecuados capaces de unirse a las células endoteliales aviares, como los descritos anteriormente para el marcador de angiogénesis αvβ 37. Otros aspectos a considerar para este modelo son la mayor dificultad de separar el embrión y los vasos CAM de la yema en embriones más viejos (> 8 días) y el hematocrito inferior de ~20%39 en comparación con los humanos. Este último puede afectar las oscilaciones de microburbujas porque se sabe que las oscilaciones de microburbujas se amortiguan en un ambiente más viscoso40. Las arterias CAM están menos oxigenadas que las venas CAM41,42. Esta diferencia debe tenerse en cuenta, por ejemplo, al estudiar imágenes fotoacústicas de la oxigenación de la sangre.

Los métodos descritos aquí permiten que el contenido del huevo se saque de la cáscara del huevo el día de la ecografía o del estudio de administración de fármacos, generalmente en el día 5 al 8 de la incubación. Esto es diferente a los métodos existentes en los que el contenido de huevo se saca de la cáscara después de una incubación de 3 días y se desarrolla aún más como cultivo ex ovo 18,20,21. Las ventajas son una mayor tasa de supervivencia del 90% para 5 días, 75% para 6 días, 50% para 7 días y 60% para huevos incubados de 8 días en comparación con ~ 50% para embriones de 3 días sacados de la cáscara del huevo e incubados ex ovo1,18 evitar antibióticos durante el cultivo18, 20 y gran incubadora estéril para el cultivo ex ovo. La supervivencia de los embriones de 6 a 8 días de edad es menor porque la CAM comienza a adherirse a la cáscara21, lo que deja la membrana CAM más propensa a romperse después de la extracción. La separación del embrión con la CAM de la yema también se describe haciendo que el embrión y CAM sean ópticamente transparentes.

Al colocar el contenido del huevo en diferentes configuraciones, el embrión de pollo y CAM se pueden usar para una multitud de estudios de imágenes de ultrasonido, como IVUS, fotoacústico, sin o con agentes de contraste de ultrasonido en 2D y 3D. La atención puede centrarse en el desarrollo de nuevos esquemas de pulsos de ultrasonido o en probar nuevos transductores. Además de esto, el modelo también se puede utilizar para investigar nuevos agentes de contraste de ultrasonido y su comportamiento en los vasos sanguíneos bajo flujo. Dado que el mecanismo de administración de fármacos mediada por microburbujas aún se desconoce43, el uso del modelo CAM in vivo puede ayudar a dilucidar el mecanismo mediante el estudio del comportamiento de microburbujas en relación con la respuesta celular. Finalmente, los vasos CAM han demostrado ser un sistema adecuado para investigar el trasplante tumoral de xenoinjertos44. Esto crea la posibilidad de usar el vaso CAM como modelo para investigar imágenes tumorales usando ultrasonido e investigar el flujo sanguíneo dentro del tumor usando CEUS. Los tumores se injertan típicamente en los vasos CAM de embriones de 8 o 9 días de edad 1,14,45, para los cuales el embrión se saca de la cáscara del huevo en el día 3 de incubación y se desarrolla aún más ex ovo. Los métodos descritos en este protocolo podrían utilizarse para cultivar embriones in ovo hasta el día del injerto tumoral.

Los autores confían en que este documento será útil para los investigadores que desean utilizar embriones de pollo y su membrana corioalantoidea (CAM) como modelo in vivo para aplicaciones de agentes de contraste y estudios de flujo.

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por el Applied and Engineering Sciences (TTW) (Vidi-project 17543), parte de NWO. Los autores desean agradecer a Robert Beurskens, Luxi Wei y Reza Pakdaman Zangabad del Departamento de Ingeniería Biomédica y Michiel Manten y Geert Springeling del Departamento de Instrumentación Médica Experimental por la asistencia técnica, todos del Centro Médico de la Universidad Erasmus MC de Rotterdam, Países Bajos.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
AgaroseSigma-AldrichA9539
Clamp (Kocher clamp)
Cling film
Holder with acoustic membrane (CLINIcell 25 cm2)MABIO, Tourcoing, FranceCLINIcell25-50-T FER 00106
Demi water
Disposable plastic Pasteur pipetsVWR612-1747
EggsDrost Pluimveebedrijf Loenen BV, the NetherlandsFreshly fertilized
Fridge 15 °C
Glass capillary needlesDrummond1-000-1000Inside diameter: 0.0413 inch
Heating plate 37 °C
Humidified incubator 37 °C
Insect specimen pins
Metal egg holderCustom made by Experimental Medical Instrumentation at Erasmus MC. See figure 1 A,B
Metal weighing boat holderCustom made by Experimental Medical Instrumentation at Erasmus MC. See figure 1 C,D
Microinjection systemFUJIFILM VisualSonics
Mineral oilSigma-AldrichM8410-100ML
Needle, 19 GVWR (TERUMO)613-5392
Phosphate-bufferes saline (PBS), 1xThermoFisher10010023
Petri dish, 1 LGlass
Petri dish, 90 mm diameterVWR391-0559
Preclinical animal ultrasound machine (Vevo 2100)FUJIFILM VisualSonics
Probe (MS250)FUJIFILM VisualSonics30 MHz transmit and 15 MHz receive frequency
Probe (MS550s)FUJIFILM VisualSonicstransmission frequency of 40 MHz
ScalpelVWR (SWANN-MORTON)233-5363
Scissors, smallFine Science Tools (FST)14558-09
Syringe, 5 mLVWR (TERUMO)613-0973
Table spoon
Tape (Scotch Magic tape)Scotch
Tissue paperTork
Tweezers large VWR (USBECK Laborgeräte)232-0107See figure 1E
Tweezers smallDUMONT Medical, Switzerland0103-5/45See figure 1F
Ultrasound contrast agent (custum made F-type)Produced as described by: Daeichin, V. et al. Microbubble Composition and Preparation for Imaging : In Vitro and In Vivo Evaluation. IEEE TRANSACTIONS ON ULTRASONICS. 64 (3), 555–567 (2017).
Ultrasound contrast agent (MicroMarker)FUJIFILM VisualSonics, Inc.
Ultrasound contrast agent (Definity)Lantheus medical imaging, United States
Ultrasound gelAquasonic
Waxi film (Parafilm)Parafilm
Weighing boats (85 × 85 × 24 mm)VWR611-0094

Referencias

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