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요약

이 프로토콜은 조영제 강화 초음파 영상 및 마이크로버블 매개 약물 전달을 연구하기 위해 생체 내 모델로 5-8일 된 닭 배아와 융모막(CAM)을 획득하고 사용하는 방법에 대한 세 가지 방법을 설명합니다.

초록

닭 배아와 혈관이 풍부한 융모막(CAM)은 생의학 과정, 새로운 초음파 펄스 방식 또는 조영제 강화 초음파 영상 및 마이크로버블 매개 약물 전달을 위한 새로운 변환기를 조사하는 데 유용한 생체 내 모델입니다. 그 이유는 CAM의 배아 및 혈관 네트워크의 접근성과 모델의 저렴한 비용 때문입니다. 배아 및 CAM 혈관에 접근하는 중요한 단계는 달걀 껍질에서 난자 내용물을 꺼내는 것입니다. 이 프로토콜에서는 배양 5 일에서 8 일 사이에 달걀 껍질에서 내용물을 꺼내는 세 가지 방법이 설명되어 있으므로 배아가 달걀 껍질 내부에서 오늘날까지 발달 할 수 있습니다. 설명 된 방법은 간단한 도구와 장비 만 필요하며 ex ovo 배양 배아 (~ 50 %)에 비해 5 일 동안 90 %, 6 일 동안 75 %, 7 일 동안 50 %, 8 일 된 배양 알의 경우 60 %의 더 높은 생존 성공률을 산출합니다. 이 프로토콜은 또한 마이크로 버블과 같은 캐비테이션 핵을 CAM 혈관 시스템에 주입하는 방법, 광학적으로 투명한 연구를 위해 배아와 CAM을 포함하는 막을 나머지 계란 함량과 분리하는 방법, 다양한 단기 초음파 실험에서 닭 배아와 CAM을 사용하는 방법을 설명합니다. 생체 내 닭 배아 및 CAM 모델은 조영제 강화 초음파 영상을 위한 새로운 영상 프로토콜, 초음파 조영제 및 초음파 펄스 방식을 조사하고 초음파 매개 약물 전달 메커니즘을 밝히는 데 매우 관련이 있습니다.

서문

Ex ovo 닭 배아와 혈관이 풍부한 융모막 (CAM)은 배아 발생, 종양학 및 약물 전달 1,2,3,4와 같은 다양한 생물학적 및 생물 의학적 과정을 조사하는 데 적합한 모델로 입증되었습니다. 초음파는 배아 심장 발달 4,5의 이미징 및 혈관 약물 전달 6,7을 위해 마이크로 버블과 같은 주사시 캐비테이션 핵을 활성화하는 데 사용되었습니다. 닭 배아는 저렴하고 인프라와 장비가 덜 필요하며 다른 동물 모델에 비해 덜 엄격한 법률을 가지고 있습니다8. 닭 배아와 CAM 혈관은 난자를 연 후 쉽게 접근할 수 있는 반면 포유류 배아와 혈관에서는 훨씬 더 어려운 것으로 판명되었습니다. 이 외에도 닭 배아와 CAM 혈관은 심장 박동과 맥동 혈류를 제공합니다. CAM은 포유류와의 혈관 해부학에서 유사성을 나타내며 약물 스크리닝 8,9,10에 사용될 수 있습니다. 이러한 특성으로 인해 CAM 용기는 조영제 강화 초음파 영상(CEUS)11,12,13,14,15,16을 조사하는 데 적합한 모델임이 입증되었습니다. 또한이 모델은 초고속 카메라를 사용하여 초음파 분야에서 초음파 조영제의 거동과 약물 7,17,18,19의 추진, 결합 및 혈관 외 유출에 대한 음향 방사력의 영향을 광학적으로 조사하는 데 사용할 수 있습니다. 닭 배아와 CAM은 장기 실험에는 적합하지 않지만 단기 생체 내 실험에는 도움이 될 수 있습니다.

실험 동안 닭 배아 및 CAM에 대한 가시성 및 제어 가능성을 높이려면, 달걀 껍질18에서 배아 및 CAM을 포함하는 계란 함량을 취하는 것이 중요하다. 초음파 조영제를 사용한 이전의 닭 배아 연구는 5-6 일 된 배아 7,11,12,17,19 및 14-18 일 된 배아 13,14,15,16을 사용했습니다. 껍질 18,20,21에서 계란 함량을 제거하기 위해 여러 가지 접근법이 자세히 설명되었습니다. 그러나 우리가 아는 한, 이전에 발표 된 접근법은 3 일간의 배양 후 (즉, Hamburger & Hamilton (HH) 단계 19-2022) 달걀 껍질에서 난자 함량을 꺼내고 배양을 계속하는 데 중점을 둡니다. 이 exovo 배양 접근법은 배양 중 사망 위험 증가(~50%)1,18, 항생제 사용 18,20, 난소 성장에 비해 총 혈관 길이 감소 23을 포함하여 여러 가지 단점이 있습니다. 달걀 껍질 내에서 배아를 배양하는 것이 가장 자연스러운 환경을 제공하기 때문에 실험 당일까지 달걀 껍질 내에서 배아를 배양하는 것이 가장 쉽습니다. 이러한 이유로 배양 5-8 일에 달걀 껍질에서 난자 내용물을 꺼내는 접근법은 특히 5-8 일 된 배아에 대한 실험에 유용합니다.

이 프로토콜에서는 배아가 발달 5-8일(HH 26-3522)에 있을 때 달걀 껍질에서 난자 내용물을 꺼내 실험 당일까지 달걀 껍질 내에서 배아가 발달할 수 있도록 하는 세 가지 방법을 설명합니다. CAM 용기 크기는 8 일 된 배아 24의 작은 모세 혈관에서 직경 10-15 μm에서 6 일 및 8 일 된 배아24,25의 더 큰 혈관에서 직경 115-136 μm까지 다양합니다. 설명 된 세 가지 방법은 기본 실험실 도구 만 필요하며 실험이 시작되기 전에 합병증의 위험을 줄여 불필요한 비용과 노동력을 줄입니다. 또한 배아와 CAM이 포함된 막을 노른자 자루에서 분리하여 현미경 연구를 위해 CAM을 광학적으로 투명하게 만드는 방법을 자세히 설명합니다. 배아 및 CAM을 함유하는 막이 예를 들어 음향 막이 있는 홀더 상에 고정될 수 있기 때문에, 셋업은 또한 음향적으로 투명하게 만들어질 수 있다(26), 광 경로가 노른자에 의해 영향을 받을 때 현미경 및 초음파 연구의 조합을 허용한다. 마지막으로 초음파 또는 CEUS 이미징에 사용할 수 있는 몇 가지 다른 초음파 설정에 대해 설명합니다.

프로토콜

모든 동물 실험은 네덜란드 동물 실험법 및 과학적 목적을위한 동물 사용 보호에 관한 유럽 이사회 (2010 / 63 / EU)에 따라 수행되었습니다.

1 . 배아 준비 프로토콜

  1. 수정 된 닭고기 알의 부화
    1. 갓 수정한 닭고기 달걀을 15°C에서 최대 1주일 동안 보관하십시오.
    2. 수정란을 배양하려면 뾰족한 면이 아래로 향하도록 수직으로 37°C의 가습 인큐베이터에 넣습니다. 부화 중에 알을 돌리는 것은 필요하지 않습니다.
      참고 : 영구 마커를 사용하여 계란 상단의 배양 시작 날짜를 작성하십시오.
  2. 최대 5일(120시간) 된 배아 준비(HH 단계 26-28)22
    1. 작업 영역 준비
      1. 가열판을 37°C로 예열합니다.
      2. 금속 계란 홀더(그림 1A,B), 금속 계량 보트 홀더(그림 1C,D) 및 PBS로 채워진 10mL 삼각을 가열판에 놓습니다.
      3. 계량 보트(85mm × 85mm × 25mm)에 10mm 층의 초음파 젤을 채우고 채워진 계량 보트를 예열된 금속 계량 보트 홀더에 놓습니다.
        알림: 계량 보트에 초음파 젤을 채우면 배아와 CAM이 올라갑니다. 이것은 배아와 CAM의 주입 또는 이미징에 도움이 될 수 있지만 달걀 껍질에서 배아와 CAM을 꺼내는 데는 필요하지 않습니다.
      4. 더 이상 달라붙지 않도록 한쪽 끝의 일부를 뒤로 접은 상태에서 테이프 몇 장(길이 약 3cm)을 준비합니다.
    2. 달걀 껍질에서 계란 함량 꺼내기
      1. 5 일 된 배양 된 수정란을 미리 데운 금속 알 홀더로 옮깁니다 (그림 1A, B). 계란을 같은 방향(즉, 위에 날짜)으로 유지하십시오.
        알림: 공기 주머니와 배아 및 CAM을 계란 상단의 동일한 위치에 유지하려면 계란을 같은 방향으로 유지하는 것이 중요합니다.
      2. 핀셋의 뾰족한 뒷면 (또는 이와 유사한; 그림 1E) 계란의 맨 위 (날짜가 쓰여진 곳)에 작은 들여 쓰기를 만듭니다 (그림 2A).
      3. 핀셋의 뾰족한 뒷면을 사용하여 계란 아래쪽의 약 2/3 측면에 두 번째 움푹 들어간 곳을 만듭니다(그림 2B).
        참고: 들여쓰기를 너무 크게 만들고 구멍을 만들지 않도록 주의하십시오. 실수로 구멍이 생기면 테이프로 구멍을 밀봉하고 다른 들여 쓰기를하지 마십시오.
      4. 더 큰 핀셋(그림 1E)을 사용하여 계란 상단의 움푹 들어간 부분(날짜 기재)에서 작은 달걀 껍질 조각을 꺼냅니다. 달걀 껍질 상단의 공기 주머니가 계란 외부의 공기와 접촉하는지 확인하되 껍질이 너무 깊숙이 침투하지 않도록하십시오.
        알림: 상단 움푹 들어간 곳을 만들 때 껍질이 너무 깊숙이 침투하면 배아와 CAM이 손상될 수 있으며 배아는 껍질에서 제거해도 살아남지 못합니다. 상단의 작은 구멍이 계란의 내부와 외부 사이에 공기 접촉을 만드는 것이 중요합니다. 이것이 완료되지 않으면 절차의 다음 단계에서 진공이 생성되어 큰 기포가 CAM 아래에 갇혀 배아와 CAM을 쓸모 없게 만듭니다. 계란 내부의 공기 주머니의 위치를 확인하기 위해 광원의 위치가 항상 정확히 맨 위에있는 것은 아니며 측면에있을 수도 있기 때문에 광원을 사용할 수 있습니다.
      5. 5mL 주사기와 19G 바늘을 사용하여 측면의 두 번째 움푹 들어간 곳을 통해 껍질을 관통하여 계란 아래로 2/3 아래로 이동하고 ~2mL의 달걀 흰자를 빼냅니다(그림 2C).
        알림: 배아와 CAM이 손상될 가능성을 방지하기 위해 바늘이 난자 바닥을 향하고 있는지 확인하십시오. 이 단계는 계란 내용물을 제거하는 데 필요한 계란 상단에 더 큰 공기 주머니를 만듭니다. 1.2.2.3 단계에서 들여 쓰기 대신 실수로 구멍이 생기면 달걀 흰자를 빼내기 위해 바늘로 테이프를 뚫습니다. 다른 테이프로 구멍을 다시 밀봉하십시오.
      6. 바늘을 꺼내고 테이프를 사용하여 측면의 틈을 막습니다(그림 2D).
        알림: 달걀 흰자가 달걀 밖으로 새는 것을 방지하기 위해 바늘을 빼기 전에 손가락을 사용하여 상단 구멍을 닫을 수 있습니다. 테이프가 이미 붙은 상태에서 달걀 흰자가 계속 새어 나오면 먼저 티슈로 달걀 흰자를 제거하여 테이프가 제대로 붙어 있는지 확인하십시오.
      7. 계란 흰자를 계량 보트에 추가하여 주사기를 비우십시오.
      8. 큰 핀셋 (그림 1E)을 사용하여 계란 상단의 작은 구멍을 확대합니다 (그림 2E). 상단의 구멍을 통해 계란 내부를 보면 배아와 CAM이 보입니다. 가능한 한 많은 달걀 껍질을 제거하면서 배아와 CAM을 계속 찾습니다(그림 2F).
        알림: 껍질 내부의 배아와 CAM의 위치를 최대한 볼 수 있도록 난자를 계속 움직입니다. 쉘의 개구부 가장자리가 CAM보다 낮지 않은지 확인하십시오. 이 외에도 내부 멤브레인을 관통하지 말고 날카로운 모서리를 방지하십시오.
      9. 개구부를 만든 후 계란을 180° 돌리고 계란 상단에 생성된 구멍이 이제 바닥을 향하도록 계란을 계란 홀더에 다시 넣습니다. 배아는 떠오르고 바닥에서 보이지 않게 됩니다(그림 2G) 1-2분이 걸립니다. 다음 단계로 진행하기 전에 전체 배아와 CAM (모든 혈관 포함)이 사라지고 노른자 만 보이는지 확인하십시오 (그림 2H).
        알림: 2분 후에도 배아가 바닥에서 여전히 보이면 계란을 시계 방향으로 1-2분 동안 돌립니다. 이것은 배아와 CAM이 떠오르는 데 도움이 될 것입니다.
      10. 측면 개구부에서 테이프를 제거합니다. 계란의 내부가 이제 바닥 구멍에서 튀어 나오는지 확인하십시오. 이 경우 다음 단계로 진행하십시오. 그렇지 않은 경우 주사기의 바늘을 사용하여 측면의 구멍을 한 번 더 뚫어 계란의 진공을 해제하십시오. 노른자 자루에 구멍이 뚫릴 가능성을 방지하기 위해 바늘로 위쪽을 가리키십시오. 계란이 바닥 구멍에서 튀어 나올 때까지 계속하십시오.
      11. 금속 계량 보트 홀더(그림 1C,D)의 계량 보트에 가깝게 계란 바닥을 잡고 작은 핀셋의 날카로운 지점 중 하나를 사용하여 개구부의 전체 너비에 걸쳐 멤브레인에 부드럽지만 빠르게 수평으로 긁고(그림 1F) 계란 내용물을 계량 보트에 부드럽게 떨어뜨립니다(그림 2I).
        알림: 계란 함량이 나오지 않으면 주사기의 바늘을 사용하여 바늘이 위쪽을 향하도록 측면 개구부를 다시 뚫습니다.
      12. 배아가 계량 보트에 옆으로 있으면 보통 저절로 올라갑니다. 이것이 발생하지 않으면 티슈 페이퍼를 사용하여 배아의 위치를 변경하십시오. 티슈 페이퍼의 한쪽면을 배아에 놓고 티슈 페이퍼를 다른 쪽 끝으로 드래그 한 다음 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 ~ 30 μL의 PBS (37 ° C) 몇 방울로 티슈 페이퍼를 방출합니다.
      13. 심장 박동이 여전히 존재하는지, CAM 혈관이 손상되지 않고 출혈이없는지, 노른자가 누출되지 않았는지 확인하여 배아가 살아 있는지 육안으로 확인하십시오. 이러한 것들 중 하나가 정확하지 않으면 배아와 CAM이 실행 가능하지 않으므로 폐기하십시오.
      14. 배아와 CAM이 37 ° C에서 유지되고 CAM 혈관이 악화되어 결국 배아가 죽을 수 있으므로 건조하지 않도록하십시오. 이를 방지하려면 정기적으로 배아와 CAM에 ~37°C PBS의 ~30μL를 소량 떨어뜨립니다.
  3. 6-7일(144-168시간) 된 배아 준비(HH 단계 28-32)22
    1. 작업 영역 준비
      1. 섹션 1.2.1에 설명된 대로 스테이지를 준비합니다.
    2. 달걀 껍질에서 계란 함량 꺼내기
      1. 실험 2시간 전에 6-7일된 배양 난자를 가져다가 인큐베이터 내부에서 알을 180° 회전시켜 알의 상단이 바닥을 향하도록 합니다. 1시간 후 계란을 원래 위치로 다시 돌리고 1시간 더 그대로 둡니다.
        알림: 실험 2시간 전에 계란을 회전하면 껍질에서 계란 내용물을 더 쉽게 꺼낼 수 있습니다.
      2. 회전 후 인큐베이터에서 알을 꺼내십시오.
      3. 1.2.2.4단계까지 1.2.2.2단계를 수행합니다.
      4. 5mL 주사기와 19G 바늘을 사용하여 측면의 두 번째 움푹 들어간 곳을 통해 껍질을 관통하여 계란 아래로 2/3 아래로 이동하고 5-6mL의 달걀 흰자를 빼냅니다. 바늘이 계란의 바닥을 향하고 있는지 확인하십시오.
        알림: 우리가 사용한 5mL 주사기를 사용하면 최대 6mL까지 인출할 수 있으므로 한 번만 삽입하면 됩니다.
      5. 바늘을 꺼내고 테이프를 사용하여 측면의 틈을 막습니다(그림 2D).
      6. 계량 보트의 초음파 젤에 달걀 흰자를 추가하여 주사기를 비우십시오.
      7. 큰 핀셋 (그림 1E)을 사용하여 계란 상단의 작은 구멍을 확대합니다 (그림 2E). 개구부를 가능한 한 크게 만들되 쉘의 개구부 가장자리가 CAM보다 낮아지지 않도록하십시오. 이 외에도 내부 멤브레인을 관통하지 말고 날카로운 모서리를 방지하십시오.
      8. 1.3.2.4단계 동안 인출된 부피보다 ~1mL 더 많은 37°C PBS로 주사기를 채웁니다.
      9. 측면 틈새에서 테이프를 떼어 내고 채워진 주사기로 틈새를 관통하여 쉘에 비우십시오. 바늘이 계란의 바닥을 향하고 있는지 확인하십시오.
        참고: 달걀 흰자는 PBS(~1cP)보다 점도(~160cP)27가 높기 때문에 달걀 흰자를 PBS로 대체하면 껍질에서 난자 함량을 제거하면서 배아와 CAM에 가해지는 긴장과 스트레스가 모두 감소합니다.
      10. 바늘을 꺼내고 테이프로 틈을 빠르게 다시 밀봉하십시오 (그림 2D).
      11. 계란을 180° 돌리고 계란 상단에 생성된 구멍이 이제 바닥을 향하도록 계란을 계란 홀더에 다시 넣습니다. 전체 배아와 CAM (모든 혈관 포함)이 사라지고 노른자 만 보일 때까지 계란을 시계 방향으로 돌립니다.
      12. 1.2.2.14단계까지 1.2.2.10단계를 수행합니다.
  4. 8일(192시간) 된 배아 준비(HH 단계 32-35)22
    1. 작업 영역 준비
      1. 가열판을 37°C로 예열합니다.
      2. 금속 칭량 보트 홀더(그림 1C,D)와 PBS로 채워진 10mL 삼각을 가열판 위에 놓습니다.
      3. 170 x 110 x 70 mm 또는 이와 유사한 얕은 용기를 취하고, 용기를 37°C PBS의 1 L로 채운다.
      4. 계량 보트(85 × 85 × 25mm)를 직경 90mm 페트리 접시에 넣습니다. 페트리 접시와 계량 보트를 컨테이너 바닥에 놓고 완전히 잠겼는지 확인하십시오.
    2. 달걀 껍질에서 계란 함량 꺼내기
      1. 실험 2 시간 전에 8 일 된 배양 된 알을 가져 와서 알의 상단이 바닥을 향하도록 인큐베이터 내부에서 알을 180 ° 회전시킵니다. 1시간 후 계란을 원래 위치로 다시 돌리고 1시간 더 그대로 둡니다.
        알림: 실험 2시간 전에 계란을 회전하면 껍질에서 계란 내용물을 더 쉽게 꺼낼 수 있습니다.
      2. 인큐베이터에서 8 일 된 배양 된 알을 가져 가십시오.
      3. 계란을 수평으로 잡고 큰 핀셋의 뾰족한 뒷면(그림 1E)을 사용하여 계란 아래로 1/2 작은 움푹 들어간 곳을 만듭니다. 달걀 껍질 주위에 360 ° 둥근 고리 패턴으로 작은 움푹 들어간 곳을 계속 만듭니다. 들여쓰기 사이에 ~10mm의 간격을 사용합니다.
        참고: 이 절차 중에 들여쓰기 사이에 작은 균열이 형성되기 시작할 수 있습니다.
      4. 쉘 주위에 작은 움푹 들어간 곳을 만든 후 큰 핀셋의 뾰족한 뒷면을 사용하여 두 개의 작은 움푹 들어간 곳 사이에 쉘을 깨뜨려 더 큰 구멍을 하나 만듭니다.
      5. 계란을 37°C PBS에 완전히 담그고 5분 동안 담가 둡니다. 5분 후, 계란을 용기 내부의 계량 보트 가까이에 두십시오. 두 엄지 손가락의 상단을 큰 구멍에 넣고 계란을 부드럽게여십시오. 계란은 작은 들여 쓰기를 따라 깨질 것입니다.
      6. 달걀 껍질 주위에 균열이 생기면 두 달걀 껍질 조각을 부드럽게 떼어 내고 달걀 내용물이 껍질에서 분리 될 때까지 두 조각을 앞뒤로 부드럽게 움직입니다. 그런 다음 계란 내용물을 계량 보트에 부드럽게 떨어 뜨립니다.
        알림: 두 개의 달걀 껍질을 앞뒤로 움직이면 더 많은 PBS가 달걀 껍질로 흘러 들어가 껍질에서 달걀 내용물을 분리하는 데 도움이 됩니다. 때로는 약간의 달걀 흰자가 달걀 껍질 안쪽에 달라붙습니다. 이런 일이 발생하면 핀셋을 사용하여 달걀 흰자를 껍질에서 분리하십시오.
      7. PBS의 계량 보트와 계란 함량이 들어 있는 페트리 접시를 천천히 올립니다. PBS에서 나올 때 계량 보트를 약간 기울여 초과 PBS를 제거합니다.
      8. 계란 함량이 포함된 계량 보트를 금속 계량 보트 홀더에 넣고 원하는 실험 설정으로 이동합니다.

2. 선택한 응용 프로그램

  1. 마이크로버블 및/또는 기타 용액을 CAM 용기에 주입
    1. 주입 설정 준비
      1. 마이크로 단조(그림 3A)를 사용하여 유리 모세관에서 유리 바늘을 당기거나 뽑은 유리 모세관 바늘을 구입하십시오.
      2. 유리 모세관 바늘의 끝이 비스듬하지 않은 경우 바늘 끝의 작은 부분을 떼어냅니다. 유리 바늘에 미네랄 오일을 채우고 마이크로 주입 시스템에 넣으십시오. 유리 바늘의 미네랄 오일에 기포가 없는지 확인하십시오.
        알림: 미네랄 오일은 우리가 사용한 주입 시스템 제조업체의 지침에 따라 추가됩니다.
      3. 미세 주입 시스템이 허용하는 한 당겨진 유리 모세관 바늘을 비우고 유리 바늘을 공기로 부분적으로 다시 채 웁니다.
        알림: 소량의 공기는 미네랄 오일과 주입 할 용액의 혼합을 방지합니다.
      4. 이 프로토콜 마이크로버블에 원하는 용액 10μL를 왁스 필름 조각에 넣습니다(그림 3B). 하나 이상의 용액이 필요한 경우, 피펫팅 전에 용액을 혼합할 수 있습니다7.
        알림: 바늘에 마이크로 버블을 채우기 전에 마이크로 버블이 방울 상단으로 떠서 농축되도록 마이크로 버블 방울을 왁스 필름에 ~ 1 분 동안 그대로 두십시오. F 형 맞춤형 초음파 조영제28의 경우,이 농축 단계는 주입 될 미세 기포 농도를 ~ 30 %로 증가시킵니다. 닭 배아 혈액의 주사 후 농도는 5 일 된 배아의 경우 32 x 10 3 마이크로 버블 / μL, 6 일 된 배아의 경우 19 x 103 마이크로 버블 / μL 사이입니다.
      5. 유리 바늘 끝을 왁스 필름의 방울에 위치시켜 유리 바늘에 마이크로버블 및/또는 기타 용액을 채웁니다. 마이크로 버블을 흡입 할 때 바늘 끝을 액체 방울 상단에 위치시켜 마이크로 버블이 풍부한 용액을 흡입하십시오.
        알림: 마이크로 버블을 주입하기 전에 유리 바늘 끝을 가장 높은 지점으로 올리고 ~ 2 분 동안 기다리십시오. 이렇게 하면 미세 기포가 유리 바늘 끝에 집중됩니다.
  2. CAM 혈관에 주입
    1. 주입하기 전에 실체 현미경으로 CAM을보고 주입하기에 가장 적합한 용기를 선택하십시오. 항상 배아의 정맥 중 하나에 주사하십시오. 이들은 혈류가 배아쪽으로 이동하는 혈관입니다. 정맥은 산소가 공급 된 혈액29로 인해 동맥보다 색이 밝습니다. 또한, 정맥은 주변에 동맥이없는 전방 및 후방 유리체 정맥 (즉, 그림 6A, B에서 별표로 표시된 덜 분지 된 정맥)의 두 가지 예외를 제외하고 항상 동맥 위에 있습니다.
      알림: 가지 중 하나에 주사하면 주사 중 혈류 방해가 제한됩니다. 좋은 주사 부위는 그림 6A, B에서 화살촉으로 표시되었습니다. 주입 된 물질이 배아쪽으로 흐르게하기 때문에 정맥에 주사하는 것이 중요합니다. 이 외에도 동맥에 주사하면 배아를 죽일 유리 바늘을 제거 할 때 대량 출혈이 발생합니다.
    2. 유리 바늘 끝과 선택한 정맥이 동일한 초점면과 동일한 방향선에 있도록 유리 바늘과 배아를 배치하십시오. 바늘을 선택한 정맥과 평행하게 가능한 한 수평으로 배치하십시오. 바늘 끝이 혈관벽에 닿아 야합니다.
      알림: 유리 바늘을 가능한 한 수평으로 배치하면 전체 용기를 관통 할 가능성이 낮아집니다.
    3. 포지셔닝 후 천천히 전진하여 유리 바늘로 혈관벽을 관통합니다. 침투하는 동안 CAM은 먼저 유리 바늘의 움직임에 의해 밀려납니다. 혈관벽이 관통 될 때까지 유리 바늘을 계속 전진시킵니다.
      알림: 실수로 혈관이 관통된 경우 바늘을 천천히 집어넣어 내강으로 다시 들어갑니다. 루멘 내부로 돌아 오면 바늘을 약간 들어 올리고 혈관을 따라 앞으로 이동하여 바늘의 위치를 변경합니다.
    4. 침투 후 유리 바늘을 약간 수축시켜 혈관 내강 내부의 팁을 더 잘 배치하고 유리 바늘을 옆으로 움직여 혈관 벽에 부착되지 않았는지 확인합니다. 소량의 용액을 천천히 주입하여 팁이 혈관 내강 내부에 위치하는지 확인합니다(그림 3C).
    5. 주입 된 용액이 혈류를 따르는지 확인하십시오. 그렇지 않은 경우 유리 바늘을 약간 움직이고 유리 바늘이 올바르게 위치 할 때까지 소량을 계속 주입하십시오17.
    6. 원하는 양을 주입하면 대량 출혈을 방지하기 위해 유리 바늘을 용기에 ~ 15 초 동안 그대로 두십시오. 그런 다음 유리 바늘을 옆으로, 위아래로, 앞뒤로 몇 번 움직여 유리 바늘을 부드럽게 수축시킵니다.
      참고: 약간의 출혈은 정상입니다. 주사할 때마다 새 유리 바늘을 사용하십시오 유리 바늘은 달걀 흰자로 쉽게 막히고 무뎌지기 때문입니다.
  3. 배아 및/또는 CAM 혈관의 현미경 이미징
    1. 음향 멤브레인이있는 홀더 준비
      1. 2개의 평행한 50 μm 두께의 음향적으로 투명한 폴리카보네이트 막(26)을 갖는 사각 플라스틱 홀더로 구성된 세포 배양 챔버를 취하고, 음향 막을 갖는 홀더로 더 지칭된다. 덮개로 두 포트를 모두 닫습니다.
      2. 메스를 사용하여 음향 막이있는 홀더에서 두 멤브레인 중 하나를 제거합니다.
        참고: 멤브레인을 제거하려면 플라스틱의 접착제 라인 바로 옆에 있는 멤브레인을 자릅니다. 다른 멤브레인의 손상을 방지하기 위해 가장자리에서 미끄러지지 않도록주의하십시오.
      3. 작은 유리 비커에서 15-80°C 사이로 가열하여 데미 수용액에 ~2% 아가로오스 95mL를 준비합니다. 흐르는 냉수 탭 아래에서 용해 된 agarose 용액으로 유리 비커를 냉각하십시오.
        알림: 아가로스가 너무 뜨거우면 음향막이 녹아 표면이 고르지 않게 됩니다.
      4. 용액이 약 37°C로 냉각되면 전체 홀더가 채워질 때까지 음향막이 있는 홀더에 용액을 천천히 붓습니다. 음향막으로 홀더를 약간 기울여 아가로스 층이 플라스틱 프레임 내부에 고르게 분포되도록 합니다(그림 4A). 아가 로스 층이 평평한지 확인하고 아가 로스를 실온으로 설정하십시오.
    2. 노른자 자루에서 배아와 CAM을 제거하고 음향막이 있는 홀더에 배치
      1. 섹션 1.2, 1.3 또는 1.4에 설명된 대로 계란에서 계란 함량을 꺼냅니다.
      2. 필요한 경우 섹션 2.1.2에 설명된 대로 CAM에 마이크로버블 및/또는 기타 용액을 주입합니다.
      3. 1L 페트리 접시에 ~500mL의 37°C PBS를 채우고 접시 바닥에 아가로스가 있는 음향막이 있는 홀더를 놓습니다. 아가 로스 층이 위를 향하고 있는지 확인하십시오.
      4. 작은 가위를 사용하여 계란 함량이 계량 보트에있는 동안 전체 CAM 주위의 비텔루스 막이라고도하는 노른자 자루의 막을 빠르게 자릅니다 (그림 4B). 가위를 같은 위치에 유지하고 더 나은 정밀도와 속도를 위해 절단하는 동안 계량 보트를 회전하십시오.
        알림: 첫 번째 절단이 이루어진 순간부터 노른자가 새기 시작합니다. 이것은 배아와 CAM의 가시성을 감소시킵니다. 6-7 컷 내에서 CAM 주변을 완전히 자르십시오. 이것은 20 초보다 오래 걸리지 않아야합니다. 작은 핀셋(그림 1F)을 사용하여 비텔라인 멤브레인의 가장자리를 잡고 CAM으로 절단되는 것을 방지할 수 있습니다.
      5. 한 스푼을 사용하여 계량 보트에서 배아와 CAM이 들어 있는 잘라낸 막을 퍼냅니다. 계량 보트에서 숟가락을 천천히 들어 올리고 배아와 CAM이 들어있는 컷 아웃 막이 나머지 노른자 자루 막에 여전히 부착되어 있는지 육안으로 검사합니다. 이 경우 가위를 사용하여 추가로 자르십시오. 떠내는 동안 숟가락을 약간 기울여 가능한 한 많은 노른자를 제거하되 건조시키지 마십시오. 배아 및 CAM을 함유하는 절단된 막을 1 L 페트리 접시에 옮기고, 37°C PBS에 침수하고, 스푼을 제거한다.
      6. 배아와 CAM을 포함하는 막이 37°C PBS에 잠기면 작은 핀셋(그림 1F)을 사용하여 막의 한쪽 가장자리를 잡고 막 주위를 부드럽게 소용돌이치며 아직 붙어 있는 노른자를 제거합니다.
      7. 모든 노른자가 제거되면 작은 핀셋을 사용하여 배아와 CAM이 들어있는 막을 이동하고 음향 막이있는 홀더 위에 놓습니다.
      8. 하나의 곤충 표본 핀을 사용하여 배아와 CAM이 들어있는 막을 한쪽 모서리에 고정시킵니다. CAM의 혈관을 뚫지 말고 멤브레인만 고정하십시오.
      9. 두 번째 곤충 표본 핀을 사용하여 배아와 CAM이 들어있는 막을 대각선 반대쪽 모서리에 고정시킵니다.
      10. 배아와 CAM을 포함하는 음향막이 있는 홀더를 PBS로부터 37°C에서 천천히 들어올린다. 홀더를 약간 기울여 대부분의 PBS를 제거하십시오.
      11. 작은 핀셋(그림 1F)을 사용하여 배아와 CAM이 포함된 막을 늘어뜨려 음향막이 있는 홀더 위에 고르게 분배하고 나머지 막을 고정합니다. 배아와 CAM이 들어있는 막이 평평하도록 약간 늘어나 있는지 확인하십시오 (그림 4C).
      12. 배아와 CAM이 들어 있는 고정된 막이 있는 음향막이 있는 홀더를 37°C로 유지되는 현미경 설정에 넣습니다.
      13. 광학 시각화를 허용하기 위해 배아 또는 CAM (그림 4D)의 관심 영역 위에 커버 슬립 또는 음향 및 광학적으로 투명한 막 (원하는 목표 및 초음파 사용 여부에 따라 다름)을 놓습니다.
  4. 닭 배아 및/또는 CAM 혈관의 초음파 영상
    1. 닭 배아 및 CAM 혈관 측면에서 초음파 영상
      1. 섹션 1.2, 1.3 또는 1.4에 설명된 대로 계란 함량을 꺼냅니다. 그러나 표준 계량 보트를 사용하지 마십시오. 대신, 음향적으로 투명한 벽이 하나 있는 맞춤형 계량 보트를 사용하십시오.
        알림: 표준 계량 보트는 계량 보트의 한쪽을 절단하고 에폭시 접착제를 사용하여 함께 접착된 폴리에스터 호일 창으로 교체하여 조정되었습니다.
      2. 선호하는 초음파 변환기를 37°C 수조에 담그고 필요한 스탠드오프 거리로 원하는 지점에 위치합니다.
      3. 투명한 벽이 변환기를 향하도록 계량 보트를 수조에 놓습니다. 계량 보트가 변환기와 수평이 될 만큼 충분히 깊은지 확인하되 계량 보트에 물이 들어가지 않도록 하십시오(그림 5A).
      4. 원하는 경우 현미경이나 레이저와 같은 배아 또는 CAM 혈관 상단에 다른 설정을 추가합니다(그림 5A).
    2. 음향 간섭 없이 배아 및 CAM 혈관 상단에서 초음파 영상
      1. 2L 비커 유리를 37°C PBS로 채웁니다. 500mL 비커 유리를 2L 비커 유리 바닥에 거꾸로 놓습니다. 500mL 비커 유리 내부의 공기를 피하십시오.
        알림: 500mL 비커 유리는 계란 함량이 포함된 계량 보트를 PBS 표면에 더 가깝게 올리기 위한 것입니다. 비커를 다른 크기의 물체로 대체함으로써 변환기와 계란 함량 사이의 거리를 변경할 수 있습니다.
      2. 500mL 비커 유리와 함께 채워진 2L 비커 유리를 37°C 수조에 넣습니다.
      3. 섹션 1.2, 1.3 또는 1.4에 설명된 대로 계란 함량을 꺼냅니다.
      4. 계란 내용물을 37°C PBS로 적시고 투명한 집착 필름으로 배아를 덮습니다. 이것은 배아를 같은 위치에 유지하고 회전하거나 떠 다니는 것을 방지하기 위해 수행 할 수 있습니다.
        알림: 계란 내용물을 PBS로 적시면 끈적임이 줄어들어 투명한 집착 필름으로 계란 함량을 쉽게 덮을 수 있습니다.
      5. 계란 함량이 있는 칭량 보트를 직경 90mm의 페트리 접시에 넣고 페트리 접시를 PBS에 천천히 담그십시오(그림 5B).
        알림: 페트리 접시의 측면에 두 개의 클램프를 사용하면 서로 반대쪽에 페트리 접시를 더 쉽게 잠글 수 있습니다.
      6. 초음파 변환기를 원하는 스탠드오프 거리로 배치합니다.
    3. 이동식 변환기를 사용한 닭 배아 및 CAM 혈관의 초음파 영상
      1. 섹션 1.2, 1.3 또는 1.4에 설명된 대로 계란 함량을 꺼냅니다.
      2. 작은 유리 비커에서 용액을 80-95°C까지 가열하여 데미물에 2% 아가로스 용액을 준비합니다. 흐르는 냉수 탭 아래에서 용해 된 아가 로스 용액으로 유리 비커를 식히십시오.
      3. 아가로스 용액을 평평한 용기에 부어 약 1mm 두께의 아가로스 패드를 만듭니다. 완전히 냉각되고 설정되면 메스를 사용하여 아가 로스 패드를 원하는 크기로 자릅니다.
        알림: 초음파 변환기의 올바른 기능에 필요한 원하는 초점 거리를 얻기 위해 아가로스 패드의 두께를 변경할 수 있습니다.
      4. 아가로스 패드를 배아와 CAM 위에 놓습니다(그림 5C). 아가로스 패드의 상단에 ~37°C PBS의 ~30μL를 몇 방울 떨어뜨려 아가로스 패드와 변환기 사이에 얇은 PBS 층을 만듭니다.
        알림: PBS를 사용하면 변환기가 아가로스 패드에 달라붙는 것을 방지할 수 있습니다. 이는 예를 들어 모터를 사용하여 2차원 변환기를 기계적으로 움직여 3차원 스캔을 수행할 때 유용합니다(그림 9B)11. 변환기를 이동할 필요가 없는 경우 PBS를 초음파 젤로 대체할 수도 있습니다.
      5. 원하는 초음파 변환기를 배치합니다.

결과

이 프로토콜에서는 배양 5-8 일 (HH 26-3522)에 껍질에서 계란 함량을 제거하는 세 가지 방법을 설명합니다. 그림 6은 껍질에서 꺼낸 후 계량 보트의 계란 함량을 보여줍니다. 5일된 배아 및 CAM (도 6A)을 섹션 1.2에 기재된 방법을 사용하여 꺼내었다. 6일 및 7일 된 배아와 CAM (그림 6B, C)을 섹션 1.3에 설명된 방법을 사용하여 꺼냈습니다. 8일된 배아 및 CAM (도 6D)을 섹션 1.4에 기재된 방법을 사용하여 꺼내었다. 배아 또는 CAM에 대한 출혈이나 손상은 관찰 될 수 없으며, 이는 이러한 방법을 사용하여 배아 또는 CAM 혈관에 해를 끼치 지 않고 껍질에서 난자 내용물을 안전하게 제거 할 수 있음을 나타냅니다. 올바르게 실행되면 5 일 된 배아에 대한 방법은 모든 절차의 90 %에서 생존 가능한 배아와 손상되지 않은 CAM을 제공합니다. 생존율은 달걀 껍질에서 성공적으로 추출 된 수정란의 총 수를 기준으로합니다. 두 번째 방법을 사용하면 6일 및 7일 배양 난자의 경우 생존 가능한 배아와 온전한 CAM의 확률은 생후 6일의 경우 약 75%, 생후 7일의 경우 약 50%입니다. 8 일 된 배아에 대해 설명 된 세 번째 방법으로 생존 가능한 배아와 손상되지 않은 CAM의 가능성은 약 60 %입니다. 5 일과 8 일 된 배아 사이의 발달 단계의 차이가 관찰 될 수 있으며 이는 햄버거와 해밀턴22와 일치합니다. 배아의 크기와 CAM 혈관의 복잡성은 발달 중에 증가합니다 (그림 6A-D). 도 6C는 도 5C에 도시된 초음파 셋업을 사용하여 배아 및 CAM을 이미지화할 수 있도록 하는 난자 함량 위에 아가로스의 얇은 패치를 보여준다. 계란 내용물을 껍질에서 꺼낸 후 배아의 심장 박동을 육안으로 볼 수 있습니다. 이러한 exovo 배아의 심박수는 5 일에 분당 183 회 (bpm)에서 8 일30 일에 ~ 208bpm까지 ovo 배아에서와 유사합니다. 가습 및 37 ° C에서 유지하면 배아는 실험 초음파 설정에서 ~ 5 시간 동안이 심박수를 유지합니다.

앞서 설명한 세 가지 방법 중에 여러 가지 합병증이 발생할 수 있습니다. 도 7A 는 배아를 초음파 영상화에 부적합하게 만드는 CAM 아래에 갇힌 공기를 보여주며, 기포(들)의 압력도 배아 및/또는 CAM을 손상시킬 수 있다. 이 문제는 껍질 내부의 공기 주머니가 껍질에서 계란 내용물을 꺼낼 때 껍질 외부의 공기와 접촉하지 않을 때 발생합니다. 도 7B 는 이미지의 우측 상단에서 노른자 자루로부터의 노른자의 작은 누출을 도시한다. 이것은 노른자 자루가 껍질의 날카로운 모서리에 의해 손상되거나 노른자 자루가 핀셋에 의해 관통될 때 껍질에서 계란 내용물을 꺼내는 동안 발생할 수 있습니다. 노른자의 누출은 배아와 CAM 혈관의 가시성에 영향을 줄 수 있습니다. 도 7C 는 기포가 CAM 아래에 포획된 배아를 나타낸다. 이것은 때때로 배아 발달에서 발생합니다. 발생할 수있는 또 다른 합병증은 혈관 손상입니다. 이 손상은 껍질에서 계란 함량을 꺼내거나 주사를 수행 할 때 발생할 수 있습니다 (그림 7D). 이 외에도 배아와 혈관도 시간이 지남에 따라 건조 될 수 있습니다 (그림 7E). 이것은 계란 함량에 PBS를 뿌리지 않을 때 발생합니다. 배아의 건조는 배아의 생존력에 영향을 미치는 대규모 모세관 폐쇄(그림 7F)를 초래할 수 있습니다. 거대한 모세 혈관 폐쇄는 발달 중 또는 배아의 심장 박동이 안정적이지 않을 때도 발생할 수 있습니다.

난자 내용물을 합병증없이 껍질에서 꺼낸 후, 배아에 예를 들어 마이크로 버블과 같은 초음파 조영제를 주입 할 수 있습니다 (그림 3C). 도 8은 주사시 혈관의 내강에서 순환하는 마이크로버블을 나타낸다. 이 마이크로 버블은 혈류와 함께 운반되어 몇 시간 동안 혈액 순환에 존재합니다 (보충 비디오 1). 순환계에 이러한 마이크로 버블이 존재하면 다양한 유형의 CEUS 및 약물 전달 실험 7,11,12를 수행 할 수 있습니다. CAM은 세 가지 예를 보여주는 새로운 초음파 대비 감지 방법을 조사하는 데 이상적입니다. 도 9A는 마이크로버블 주입 전후의 B-Mode 및 CEUS에서 6일령 닭 배아의 고주파 초음파 아고조파 영상을 보여준다. 여기서, CAM 혈관에 5μL의 초음파 조영제를 주입하고 MS250 프로브(30MHz 송신 및 15MHz 수신 주파수, 10% 전력)를 구비한 전임상 동물 초음파 기계로 영상을 촬영하였다. 마이크로버블 주입 전에 B-모드 이미지에서 이미 배아 심장 내부에서 대비를 볼 수 있습니다(그림 9A-I). 이 현상은 초음파 영상 5,31에서 혈액의 대비를 증가시키는 조류 적혈구에 핵이 존재하기 때문입니다. 마이크로 버블의 첨가는 B- 모드 및 CEUS 이미징 모두에서 배아의 대비와 가시성을 증가 시켰습니다. 도 9B는 6일된 배아와 주변 혈관의 광학 및 고주파 3D 아고조파 이미지를 나타낸다. CAM에 5μL의 초음파 조영제를 주입하고 MS550s 프로브(전송 주파수 40MHz, 피크 음압~300kPa)가 있는 전임상 동물 초음파 기계로 영상을 촬영했습니다. 이러한 결과는 조영제와 결합 된 CEUS 이미징을 사용하여 고주파 3D 아 고조파 이미지를 생성하고 배아 외부의 혈관을 이미지화 할 수 있음을 보여줍니다. 도 9C는 6일된 배아의 CAM 미세혈관의 맞춤형 프로브로 만든 광학 이미지 및 초음파조화 혈관내 초음파(IVUS) 이미지를 나타낸다(26MHz 투과 및 39 및 65MHz 수신 주파수). CAM 혈관에는 4 ± 1 μL 초음파 조영제를 주입하였다. 광학 이미지 및 IVUS 이미지는 동일한 배아 및 해당 혈관 네트워크를 보여주는 동일한 관심 영역에서 나온 것입니다.

닭 배아와 CAM 혈관은 또한 우리가 한 가지 예를 보여주는 초음파 매개 약물 전달을 조사하는 데 사용될 수 있습니다. 노른자는 이미징 중에 광 경로를 방해하기 때문에 배아 및 CAM 혈관에서 약물 전달을 광학적으로 조사하려면 노른자 자루를 제거해야합니다. 이 연구를 위해, 배아와 CAM은 섹션 2.2에 설명 된대로 배아와 CAM을 포함하는 막을 난황 자루로부터 분리함으로써 현미경 이미징을 위해 준비되었다 (그림 4C). 이 배아에서 심박수는 약 80bpm으로 안정적이며 배아는 37°C에서 유지될 때 최대 2시간 동안 생존합니다7. 도 10은 CAM 혈관의 내피 세포에서의 초음파 및 마이크로버블 매개 약물 전달 연구를 나타낸다. αvβ3- 항체를 사용하여 혈관벽에 표적화하고 형광 염료 DiI7로 염색 한 지질 코팅 된 마이크로 버블을 CAM 용기에 주입했습니다 (그림 10A, C). CAM 혈관 내피 세포 핵을 Hoechst 33342 (도 10B)로 염색하고, 모델 약물 프로피듐 요오드화물 (PI)을 사용하여 sonoporation7을 시각화하였다. 이 두 염료는 마이크로버블과 동시에 주입되었습니다. 초음파 처리 (1MHz, 200kPa 피크 음압, 1000 사이클의 단일 버스트)시, 표적 마이크로 버블에 가장 가까운 핵에서 PI 흡수가 관찰되었습니다 (그림 10D). 이는 표적화된 마이크로버블의 초음파 유도 진동이 내피 세포막에 기공을 생성할 수 있음을 보여준다.

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그림 1. 배아 준비 장비. (A-B) 금속 계란 홀더의 상단 및 측면도 및 금속 계량 보트 홀더의 (C-D) 상단 및 측면도. (E-F) 핀셋은 껍질에서 계란 내용물을 꺼내야했습니다. cm 단위의 축척. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 2. 배아 제거 절차. (A) 검은 색 원으로 표시된 계란 위에 작은 들여 쓰기. (B) 검은 색 원으로 표시된 계란 아래로 2/3 작은 들여 쓰기. (C) 달걀 흰자 ~2mL를 빼냅니다. (D) 테이프로 측면의 밀봉 된 틈새. (E) 계란 상단의 작은 구멍을 확대합니다. (F) 배아는 껍질의 일부를 제거한 후에 보입니다. (지에이치) 난자를 180° 회전시킨 후 배아가 떠올라 보이지 않게 됩니다(화살표는 배아의 이동 방향을 나타냄). 1-2 분 후, 배아는 바닥에서 보이지 않습니다. (I) 멤브레인을 긁은 후 계란 함량이 계량 보트에 떨어집니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 3. CAM 용기에 마이크로 버블 주입. (A) 유리 모세관 바늘. (B) 주입 전 흡인 전에 요오드화 프로피듐 (PI) 용액 (왼쪽 방울 ) 및 마이크로 버블 (오른쪽 방울). 바늘 (검은 색 윤곽선)은 오른쪽 상단 모서리 (C) 마이크로 버블 주입에서 볼 수 있습니다. 모세 혈관 바늘 끝은 정맥 중 하나의 내강 내부에 위치합니다 (왼쪽). 화살표로 표시된 흰 구름 인 마이크로 버블이 주입되어 혈류를 따라 분산됩니다 (오른쪽). 스케일 바는 1mm를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 4. 노른자 자루에서 배아와 CAM을 제거하고 음향막이있는 홀더에 놓습니다. (A) 아가로스 층으로 채워진 음향 멤브레인이 있는 홀더. (B) 절단하기 전에 계량 보트에 닭 배아와 CAM 용기. 점선은 CAM 주위의 절단선을 나타냅니다. (C) 닭 배아와 CAM을 노른자에서 분리하여 음향막에 고정시킵니다. (D ) CAM 위에 놓인 홀더(파란색)에 음향 및 광학적으로 투명한 막으로 닭 배아를 고정합니다. 홀더는 데미 물로 채울 수 있으므로 물 담그기 대물렌즈를 사용할 수 있습니다. 모든 스케일 바는 1cm를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 5. 닭 배아 및 CAM 초음파 영상을위한 다양한 설정. (A) 측면에서 초음파 이미징을 위한 설정. 닭 배아는 하나의 음향적으로 투명한 벽이 있는 맞춤형 조정식 계량 보트에 넣고 37°C 수조에 넣었습니다. 초음파 변환기는 음향적으로 투명한 벽 옆의 왼쪽(a)과 광음향 이미징을 위한 레이저(b)에 상단에 위치했습니다. (B) 상단에서 초음파 이미징을위한 설정. 배아 및 CAM을 PBS의 비이커에 침수시키고 37°C 수조에 넣었다. 점선 윤곽선은 내부에 500mL 유리 비커(b)가 있는 2L 유리 비커(a)를 보여줍니다. (C) 이동식 변환기로 상단에서 초음파 이미징을 위한 설정. 얇은 아가로스 패드(점선)를 변환기와 아가로스 표면 사이의 결합으로서 PBS의 얇은 층으로 배아 위에 놓았다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 6. 껍질 밖의 계란 함량. (A) 배양 5 일 후에 껍질에서 꺼낸 계란 함량. 융모막 막 (CAM), 배아 몸체 (EB), 전방 및 후방 유리체 정맥 (*) 및 적절한 주사 부위 (화살촉)가 표시됩니다. (B) 배양 6 일 후 껍질에서 꺼낸 계란 함량. 전방 및 후방 유리정맥(*)과 적절한 주사 부위(화살촉)가 표시됩니다. (C) 7 일 배양 후 껍질에서 꺼낸 계란 함량. 초음파 이미징을 허용하기 위해 아가 로스 패치가 위에 배치됩니다. 아가 로스 패치의 모서리는 검은 색 원으로 표시됩니다. (D) 배양 8 일 후 껍질에서 꺼낸 계란 함량. 모든 스케일 바는 1cm를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 7. 닭 배아 및 CAM 모델을 사용한 절차 중에 발생할 수있는 합병증. (A ) 방법 1.2 (5 일령 배아) 또는 1.3 (6-7 일령 배아)을 사용하여 껍질에서 난자 내용물을 꺼낼 때 CAM 아래에 갇힌 기포. (B) 오른쪽 상단에 화살표로 표시된 노른자의 작은 누출 (6 일 된 배아). (C ) 검은 점선 원 (7 일 된 배아)으로 표시된 CAM 아래에 갇힌 공기. (D) 출혈, 검은 색 화살표로 표시 (5 일령 배아. (E) 건조된 배아 및 CAM (5일령 배아). (F) 거대한 모세 혈관 폐쇄 (5 일 된 배아). 모든 스케일 바는 1cm를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 8. CAM 혈관의 미세 기포. 혈관벽은 점선으로 표시되고 단일 마이크로 버블은 화살표로 표시됩니다. 스케일 바는 20μm를 나타냅니다. 해당 현미경 녹화는 보충 비디오 1에서 찾을 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 9. 닭 배아 및 CAM 혈관의 조영제 강화 초음파 영상. (A) B-모드(I, III) 및 실시간 준고조파(II, IV) 이미지(MS250 프로브가 있는 전임상 동물 초음파 기계, 30MHz 전송 및 15MHz 수신 주파수, 10% 전력)의 최대 강도 투영 위에 아가로스 패치가 있는 6일 된 배아. 상단 이미지 (I, II)는 5 μL 초음파 조영제 주입 전과 하단 (III, IV)의 결과를 보여줍니다. 스케일 바는 1mm를 나타냅니다. 이 이미지는 Daeichin et al. 201511(B) 6일 된 닭 배아의 광학(왼쪽) 및 3D 준고조파 영상(오른쪽)의 허가를 받아 수정되었습니다. CAM 용기에 5μL 초음파 조영제를 주입하고 고주파 프로브 (MS550s 프로브가있는 전임상 동물 초음파 기계, 전송 주파수 40MHz, 피크 음압 ~ 300kPa, 전임상 동물 초음파 기계 3D 모드로 렌더링)로 이미징을 수행했습니다. 스케일 바는 5mm를 나타냅니다. 이 이미지는 Daeichin et al. 201511의 허가를 받아 수정되었습니다. (C) 6일 된 배아의 CAM 미세혈관구조의 광학 이미지(왼쪽) 및 초고조파 혈관내 초음파(IVUS)의 평균 강도 투영(오른쪽). CAM 용기에는 4 ± 1 μL 조영제를 주입하였다. 울트라 고조파 IVUS 이미징은 맞춤형 IVUS 프로브 (전송 주파수 35MHz, 피크 음압 600kPa)로 수행되었습니다. 두 이미지 모두 동일한 배아와 관심 영역에서 만들어집니다. 화살표는 두 이미지에서 해당 선박을 나타냅니다. 스케일 바는 1mm를 나타냅니다. 이 이미지는 Maresca et al. 201412의 허가를 받아 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 

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그림 10. 6일령 배아에서 CAM 혈관 내피 세포로의 약물 전달. (A) 초음파 치료 전에 혈관벽에 부착 된 흰색 화살표로 표시된 6 개의 αvβ3- 표적 마이크로 버블의 명시야 이미지. (B) 초음파 처리 전에 형광 염색 된 내피 세포 핵. (C) 초음파 처리 전에 흰색 화살표로 표시된 염색된 표적 마이크로버블의 형광 이미지. (D) 초음파 처리 후 표적 마이크로버블 아래의 세포핵으로 모델 약물 프로피듐 요오드화물(PI)의 흡수(1MHz, 200kPa 피크 음압, 1000사이클의 단일 버스트). 스케일 바는 10μm를 나타내며 모든 이미지에 적용됩니다. 이 이미지는 Skachkov et al. 20147의 허가를 받아 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일

보충 비디오 1. CAM 혈관의 미세 기포. 스케일 바는 20μm를 나타냅니다. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

토론

이 프로토콜은 조영제 강화 초음파 영상 및 마이크로버블 매개 약물 전달을 연구하기 위해 생체 내 모델로 5-8일 된 닭 배아와 CAM을 얻고 사용하는 방법에 대한 세 가지 방법을 설명합니다. 5 일 된 (섹션 1.2) 및 6-7 일 된 (섹션 1.3) 배아를 껍질에서 꺼내는 가장 중요한 단계는 다음과 같습니다 : 1) 달걀 흰자를 빼기 전에 달걀 꼭대기의 작은 구멍을 만들어 달걀 껍질 전체를 통해 공기 주머니로 들어갑니다. 2) 쉘의 큰 구멍을위한 부드러운 가장자리를 만듭니다. 껍질에서 8 일 된 배아를 꺼내는 방법 (섹션 1.4)의 경우 가장 중요한 단계는 다음과 같습니다 : 1) 계란을 따라 멋진 균열을 만들기 위해 충분한 수의 들여 쓰기를 만드십시오. 2) 계란을 PBS에 담그십시오. 모든 방법에 대한 배아 생존력을 보장하려면 난자와 그 내용물을 37 ° C로 유지하는 것이 중요합니다. 또한 CAM 동맥에 주사하지 마십시오. 연구 중 배아의 심박수를 육안으로 모니터링하는 것은 배아의 활력을 보장하기 위해 권장됩니다. 배아의 정확한 발달 단계를 확인하기 위해 Hamburger & Hamilton22의 표시를 사용할 수 있습니다.

배아, CAM 및 노른자 자루의 손상을 방지하는 것이 중요합니다. 이 손상은 배아와 CAM의 생존력, 혈류 및 가시성에 영향을 줄 수 있습니다. 또한 노른자 자루가 손상되어 결과적으로 멤브레인의 강성이 낮아 CAM 용기에 주입이 불가능합니다. 5 일 된 배아는 비교적 작은 공기 주머니를 가지고 있으므로 껍질에 난자 함량을 제거 할 수있는 충분히 큰 구멍을 만들 수 있으려면 2mL의 달걀 흰자를 빼내야합니다. 결과적으로 달걀 껍질과 배아 사이에 더 많은 공간이 생깁니다. 달걀 흰자를 빼낸 후 바늘이 들어간 구멍을 테이프 조각으로 막아야합니다. 달걀 흰자가 여전히 새어 나오면 다른 테이프를 바르십시오. 이 외에도 측면의 구멍에 테이프를 붙이면 계란 내부에 진공이 생성되어 1.2.2.8단계에서 큰 구멍을 만들 때 자체 무게로 인해 계란 내용물이 떨어지는 것을 방지합니다. 배아 또는 CAM의 손상은 달걀 껍질의 가장자리가 너무 날카 롭거나 달걀 내용물이 계량 보트에 너무 엄격하게 떨어질 때도 발생할 수 있으므로 달걀 껍질을 계량 보트에 매우 가깝게 유지해야합니다. 현상 5일째와 6일 사이에, CAM은 쉘 멤브레인(32)에 부착되기 시작한다. 이 부착물은 달걀 껍질에서 난자 내용물을 꺼낼 때 배아와 CAM을 손상시킬 위험을 증가시킵니다. PBS를 주입 한 후 6 내지 7 일 배양 된 난자 또는 8 일 배양 난자에 대해 설명 된대로 PBS로 채워진 용기에 넣음으로써 손상 위험이 감소합니다. CAM 정맥으로의 주사와 관련하여: 첫 번째 주사가 실패하면 손상이 경미하거나 다른 CAM 정맥에 있는 경우 동일한 정맥에서 두 번째 주사를 더 업스트림으로 수행할 수 있습니다. 배아와 CAM을 노른자에서 분리하면 배아와 CAM 혈관이 광학적으로 투명해집니다. 결과적으로, 배아는 영양소의 주요 공급원을 잃는다33. 이러한 영양소 손실은 여전히 노른자와 접촉하는 6 일 된 배아의 경우 ~ 190과 비교하여 관찰 된80bpm의 낮은 심박수와이 분리 절차 후 2 시간의 감소 된 생존 시간에 대한 설명 일 수 있습니다. 감소된 심박수 및 생존 시간에 역할을 할 수 있는 또 다른 인자는 난황으로 분리된 배아 및 CAM 혈관을 37°C에서 유지하는 것이 도전이다. 현미경 스테이지 인큐베이터가 도움이 될 수 있습니다. 이 외에도 노른자에서 CAM이 분리되면 막 장력이 낮아지기 때문에 조직의 기계적 변화가 발생할 수 있습니다. 멤브레인 장력이 낮 으면 내부 혈관 전단 속도가 증가하여 심박수가 낮아질 수 있습니다.

exovo 닭 배아 및 CAM 혈관은 조영제 강화 초음파 영상 및 마이크로버블 매개 약물 전달 연구를 위한 단시간 관찰만을 포함하여 생체내 모델과 마찬가지로 몇 가지 제한이 있습니다. 5일째에 100±23μL, 6일째에 171±23μL의34μL의 작은 혈액량으로 인해 최대 ~5μL를 주사할 수 있습니다. 발달의 후기 단계 (7 일 이상)에서는 혈관 강성이 증가하고 노른자 탄력이 감소합니다. 이것은 오래된 배아에서 성공적인 주사를 복잡하게 만들 수 있습니다. 일단 마이크로버블이 주입되면, 닭 배아는 이 단계(35)에서 완전히 발달된 면역계를 갖지 않기 때문에 그들은 몇 시간 동안 순환한다. 따라서 마이크로 버블은 인간36,37에서와 같이 ~ 6 분 이내에 제거되지 않으므로 결합되지 않은 표적 마이크로 버블이 제거되기까지 5-10 분의 대기 기간을 가진 전형적인 초음파 분자 영상 연구가 불가능합니다 38. 마이크로버블을 표적화하기 위해, 조류 내피 세포에 결합할 수 있는 적합한 리간드가 혈관신생 마커 αvβ37에 대해 이전에 기술된 바와 같이 사용될 필요가 있다. 이 모델에 대해 고려해야 할 다른 측면은 오래된 배아(> 8일)에서 노른자에서 배아와 CAM 혈관을 분리하는 데 어려움이 증가하고 인간에 비해 ~20%39의 낮은 헤마토크릿입니다. 후자는 마이크로버블 진동에 영향을 미칠 수 있는데, 그 이유는 마이크로버블 진동이 더 점성이 있는 환경(40)에서 감쇠되는 것으로 알려져 있기 때문이다. CAM 동맥은 CAM 정맥41,42보다 산소가 적습니다. 이 차이는 예를 들어 혈액 산소 공급의 광 음향 영상을 연구 할 때 고려되어야합니다.

여기에 설명된 방법을 사용하면 초음파 영상 또는 약물 전달 연구 당일, 일반적으로 배양 5-8일에 달걀 껍질에서 계란 내용물을 꺼낼 수 있습니다. 이는 3일 배양 후 껍질에서 난자 함량을 꺼내 exovo 배양 18,20,21로 추가로 개발하는 기존 방법과 다릅니다. 장점은 5 일 동안 90 %, 6 일 동안 75 %, 7 일 동안 50 %, 7 일 동안 60 %, 8 일 된 배양 된 알의 경우 60 %의 더 높은 생존율이며, 달걀 껍질에서 꺼내어 추가로 배양 된 3 일 된 배아의 경우 ~ 50 %와 비교하여 1,18 배양 중 항생제 회피 18, 20 및ex ovo 배양을 위한 대형 멸균 배양기. 6-8일된 배아의 생존은 CAM이 껍질(21)에 부착되기 시작하여 추출시 CAM 막이 파열되기 더 쉽기 때문에 더 낮습니다. 배아와 CAM 형태의 노른자의 분리는 또한 배아와 CAM을 광학적으로 투명하게 만드는 것으로 설명된다.

계란 함량을 다른 설정에 배치함으로써 닭 배아와 CAM은 IVUS, 광 음향, 2D 및 3D의 초음파 조영제 없이 또는 함께 사용하는 것과 같은 다양한 초음파 영상 연구에 사용할 수 있습니다. 초점은 새로운 초음파 펄스 체계를 개발하거나 새로운 변환기를 테스트하는 것입니다. 이 외에도이 모델은 새로운 초음파 조영제와 흐름중인 혈관에서의 행동을 조사하는 데에도 사용할 수 있습니다. 마이크로버블-매개 약물 전달의 메카니즘이 아직 알려지지 않았기 때문에43, 생체내 CAM 모델의 사용은 세포 반응과 관련된 마이크로버블 거동을 연구함으로써 메카니즘을 해명하는데 도움이 될 수 있다. 마지막으로, CAM 혈관은 이종이식 종양 이식을 조사하기에 적합한 시스템인 것으로 입증되었다44. 이것은 초음파를 사용하여 종양 영상을 조사하고 CEUS를 사용하여 종양 내부의 혈류를 조사하기 위한 모델로 CAM 혈관을 사용할 수 있는 가능성을 만듭니다. 종양은 전형적으로 8 일 또는 9 일 된 배아 1,14,45의 CAM 혈관에 이식되며, 배양 3 일째에 배아를 달걀 껍질에서 꺼내어 난소 외에서 추가로 발달시킨다. 이 프로토콜에 설명 된 방법은 종양 이식 당일까지 ovo에서 배아를 성장시키는 데 사용될 수 있습니다.

저자들은 이 논문이 조영제 및 유동 연구의 적용을 위한 생체 내 모델로 닭 배아와 융모막 막(CAM)을 사용하려는 연구자들에게 도움이 될 것이라고 믿습니다.

공개

저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 말

이 작업은 NWO의 일부인 응용 및 공학 과학 (TTW) (Vidi 프로젝트 17543)의 지원을 받았습니다. 저자는 네덜란드 로테르담 에라스무스 MC 대학 의료 센터의 기술 지원을 위해 생물 의학 공학과의 Robert Beurskens, Luxi Wei 및 Reza Pakdaman Zangabad와 실험 의료 계측과의 Michiel Manten 및 Geert Springeling에게 감사드립니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
AgaroseSigma-AldrichA9539
Clamp (Kocher clamp)
Cling film
Holder with acoustic membrane (CLINIcell 25 cm2)MABIO, Tourcoing, FranceCLINIcell25-50-T FER 00106
Demi water
Disposable plastic Pasteur pipetsVWR612-1747
EggsDrost Pluimveebedrijf Loenen BV, the NetherlandsFreshly fertilized
Fridge 15 °C
Glass capillary needlesDrummond1-000-1000Inside diameter: 0.0413 inch
Heating plate 37 °C
Humidified incubator 37 °C
Insect specimen pins
Metal egg holderCustom made by Experimental Medical Instrumentation at Erasmus MC. See figure 1 A,B
Metal weighing boat holderCustom made by Experimental Medical Instrumentation at Erasmus MC. See figure 1 C,D
Microinjection systemFUJIFILM VisualSonics
Mineral oilSigma-AldrichM8410-100ML
Needle, 19 GVWR (TERUMO)613-5392
Phosphate-bufferes saline (PBS), 1xThermoFisher10010023
Petri dish, 1 LGlass
Petri dish, 90 mm diameterVWR391-0559
Preclinical animal ultrasound machine (Vevo 2100)FUJIFILM VisualSonics
Probe (MS250)FUJIFILM VisualSonics30 MHz transmit and 15 MHz receive frequency
Probe (MS550s)FUJIFILM VisualSonicstransmission frequency of 40 MHz
ScalpelVWR (SWANN-MORTON)233-5363
Scissors, smallFine Science Tools (FST)14558-09
Syringe, 5 mLVWR (TERUMO)613-0973
Table spoon
Tape (Scotch Magic tape)Scotch
Tissue paperTork
Tweezers large VWR (USBECK Laborgeräte)232-0107See figure 1E
Tweezers smallDUMONT Medical, Switzerland0103-5/45See figure 1F
Ultrasound contrast agent (custum made F-type)Produced as described by: Daeichin, V. et al. Microbubble Composition and Preparation for Imaging : In Vitro and In Vivo Evaluation. IEEE TRANSACTIONS ON ULTRASONICS. 64 (3), 555–567 (2017).
Ultrasound contrast agent (MicroMarker)FUJIFILM VisualSonics, Inc.
Ultrasound contrast agent (Definity)Lantheus medical imaging, United States
Ultrasound gelAquasonic
Waxi film (Parafilm)Parafilm
Weighing boats (85 × 85 × 24 mm)VWR611-0094

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