Un modelo de ratón para la pancreatitis crónica a través de la infusión de TNBS del conducto biliar

Resumen

La pancreatitis crónica (PC) es una enfermedad caracterizada por inflamación y fibrosis del páncreas, a menudo asociada con dolor abdominal intratable. Este artículo se centra en refinar la técnica para generar un modelo de ratón de CP mediante infusión de conductos biliares con ácido sulfónico trinitrobenceno 2,4,6 (TNBS).

Resumen

La pancreatitis crónica (PC) es una enfermedad compleja que involucra inflamación pancreática y fibrosis, atrofia glandular, dolor abdominal y otros síntomas. Se han desarrollado varios modelos de roedores para estudiar la CP, de los cuales el modelo de infusión de ácido sulfónico trinitrobenceno (TNBS) del conducto biliar 2,4,6 replica las características del dolor neuropático observado en la PC. Sin embargo, la infusión de medicamentos para las vías biliares en ratones es técnicamente desafiante. Este protocolo demuestra el procedimiento de infusión de TNBS de conducto biliar para la generación de un modelo de ratón CP. TNBS se infundió en el páncreas a través de la ampolla de Vater en el duodeno. Este protocolo optimizó el volumen de medicamentos, las técnicas quirúrgicas y el manejo de medicamentos durante el procedimiento. Los ratones tratados con TNBS mostraron características de PC reflejadas por las reducciones de peso corporal y páncreas, los cambios en los comportamientos asociados al dolor y la morfología pancreática anormal. Con estas mejoras, la mortalidad asociada con la inyección de TNBS fue mínima. Este procedimiento no solo es crítico en la generación de modelos de enfermedad pancreática, sino que también es útil en la administración local de medicamentos pancreáticos.

Introducción

La pancreatitis crónica (PC) es una enfermedad inflamatoria crónica caracterizada por la atrofia del páncreas, fibrosis, dolor abdominal y eventual pérdida de las funciones exocrina y endocrina¹. Los tratamientos médicos y quirúrgicos actuales no son curativos, sino que se llevan a cabo para aliviar los síntomas que son la consecuencia de la enfermedad: dolor abdominal refractario, disfunción endocrina y exocrina. Por lo tanto, se necesitan urgentemente tratamientos más efectivos². Los modelos animales proporcionan una herramienta esencial para desarrollar una mejor comprensión de la enfermedad e investigar posibles terapias³. Se han desarrollado múltiples modelos de ratón para PC, de los cuales se utilizan comúnmente modelos de ceruleína y / o alcohol. Se ha demostrado que la ceruleína, un oligopéptido que estimula la secreción pancreática, induce de forma reproducible un modelo de PC con atrofia pancreática, fibrosis, entre otros⁴. Otro modelo común utiliza inyecciones seriadas de L-arginina, que produce insuficiencia exocrina similar a la observada en pacientes humanos⁵. La PC también puede ser inducida por ligadura completa o parcial del conducto pancreático, así como por hipertensión del conducto pancreático^6,7. A pesar de la variedad de modelos animales disponibles para la PC, ninguno de estos modelos reproduce eficazmente el dolor abdominal experimentado por los pacientes con^{PC 8}.

Estudios previos mostraron que la inyección pancreática local de ácido 2,4,6 -trinitrobenceno sulfónico (TNBS) replica el dolor persistente experimentado por los pacientes con PC^9,10,11. Los ratones tratados con TNBS demostraron hipersensibilidad abdominal y un aumento de los comportamientos relacionados con el dolor, así como una "hipersensibilidad generalizada" a los estímulos dolorosos, un fenómeno que se ha observado en pacientes con PC¹⁰. Además de imitar con precisión el dolor CP, el modelo TNBS también replica otras características patológicas de la condición humana como la fibrosis, la infiltración de células mononucleares y el reemplazo de células acinares con tejido graso^10,12. Sin embargo, la infusión de TNBS a través del conducto biliar es un procedimiento técnicamente desafiante en ratones que puede causar la muerte. Hasta donde sabemos, no existe un protocolo visual que muestre cómo se realiza la infusión de conductos biliares. En este artículo, demostramos el procedimiento de la infusión de ducción biliar de TNBS para generar un modelo de ratón CP. Este procedimiento ayudará a generar valiosos modelos animales para el estudio de la PC y otras enfermedades pancreáticas y se puede utilizar para infundir otros materiales (por ejemplo, virus, células) en el páncreas¹³.

Protocolo

Todos los procedimientos se llevaron a cabo con la aprobación de los Comités Institucionales de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Médica de Carolina del Sur y el Centro Médico Ralph H. Johnson. En este estudio se utilizaron ratones machos C57BL/6J entre 8-10 semanas de edad. Los ratones fueron alojados bajo un ciclo estándar de 12 luces / 12 oscuros con acceso ad libitum a los alimentos y al agua.

1. Preparación de TNBS solución inyectable

1. Preparar etanol al 10% en solución salina al 0,9%. Disolver TNBS (ver Tabla de Materiales)en etanol al 10% a una concentración final de 7,5 mM añadiendo 7,5 μL de TNBS en 1 mL de etanol al 10%.
   PRECAUCIÓN: El TNBS presenta un peligro químico. Prepare la solución dentro de una campana extractora de humos y use equipo de protección personal como guantes, gafas y una bata de laboratorio para evitar el contacto directo con TNBS.
2. Cargue 50 μL de solución de TNBS al 0,75% en una jeringa de insulina con una aguja calibre 31. Cargue 50 μL de etanol al 10% en solución salina en una jeringa del mismo tamaño que el control del vehículo. Coloque las jeringas sobre hielo y protéjalas de la luz hasta que sea necesario.

2. Preparación y cirugía del ratón

1. Afeitar el vello de la zona quirúrgica abdominal.
2. Inyecte una dosis preventiva del analgésico (por ejemplo, buprenorfina 0,1 mg/kg p.i.) antes de la cirugía.
3. Inducir y mantener al ratón bajo anestesia general con 1,5-2% de isoflurano y 1 L/min de oxígeno. Confirme la anestesia pellizcando los dedos de los dedos de los dedos de los los días y observando al animal por falta de reflejo.
4. Coloque el ratón en una almohadilla quirúrgica calentada durante la cirugía. Aplique ungüento veterinario en cada ojo cuando el ratón esté bajo anestesia.
5. Desinfectar el sitio quirúrgico limpiando el área quirúrgica 3 veces con 2% de yodo, seguido de alcohol al 70%(Tabla de Materiales).
6. Realizar una laparotomía con micro tijeras para generar una incisión de 0,5-1 cm.
7. Exponga suavemente el duodeno y localice el conducto biliar común utilizando hisopos de algodón(Tabla de materiales).
8. Coloque un microclip hemo recto(Tabla de Materiales)sobre el conducto común proximal para evitar el flujo de TNBS o soluciones de vehículos hacia el hígado y la vesícula biliar (Figura 1A,B).
9. Exponga suavemente el duodeno e inserte la aguja en el conducto pancreático a través de la papila de Vater.
10. Una vez que la aguja esté dentro del conducto, coloque un micro clip hemo curvo(Tabla de materiales)sobre el duodeno que rodea la aguja(Figura 1A)para asegurar la aguja en su lugar y evitar que la solución inyectada entre en el duodeno.
11. Infundir gradualmente la solución (TNBS o vehículo) en el conducto pancreático en el transcurso de un minuto.
    NOTA: TNBS necesita ser infundido lentamente durante un minuto de tiempo, y es fácil controlar la velocidad de infusión cuando el páncreas se perfunde con una jeringa de insulina con una aguja de 5/16 pulgadas y 31G. Mantenga la mano lo más estable posible para evitar pinchar el conducto biliar. Si TNBS se inyecta con éxito, el color amarillo puede ser visible dentro del páncreas.
12. Después de la infusión, retire cuidadosamente la micro pinza cerca del hígado y luego retire la micro pinza que sostiene la aguja y el duodeno.
13. Devuelva cuidadosamente el duodeno a su posición original.
14. Deje 0,5 ml de solución salina estéril tibia (36-37 ° C) en la cavidad abdominal antes del cierre, para ayudar a que el duodeno vuelva a su posición original y ayudar con la recuperación de la peristalsis.
15. Cierre la incisión en la capa muscular con sutura continua con un punto 5-0. Cierre la piel con sutura interrumpida con una puntada de 4-0.
16. Coloque la jaula que contiene ratones en una almohadilla térmica para permitir la recuperación de la anestesia.
17. Confirme que los ratones están calientes y son capaces de movimiento espontáneo antes de devolverlos a la sala de espera.
18. Continúe proporcionando un analgésico (por ejemplo, buprenorfina 0,1 mg/kg i.p.) cada 12 h y calor suplementario durante 48 h después de la cirugía.

3. Supervisión del comportamiento del ratón

1. Retire las suturas en el día 7 después de la cirugía.
2. Monitoree la salud y el comportamiento del ratón diariamente durante la primera semana después de la cirugía. Esté atento a los signos de angustia, como vocalización, postura encorvada de la espalda o reducción de la locomoción. Mide el peso corporal cada dos días.
3. Utilizar monofilamentos de Von Frey (VFF) para medir la hipersensibilidad mecánica abdominal antes, y 2, 3 semanas después de la cirugía como se describe^9,14.
   1. Aplique VFFs de diferentes fuerzas aplicadas en orden ascendente a la zona abdominal superior 10x cada 1-2 s. Considere la elevación, retracción o lamido del abdomen (respuesta de abstinencia) como una respuesta positiva.
   2. Aplicar un estímulo más fuerte si no se observa una respuesta positiva, y un estímulo más débil si se observa una respuesta positiva. El umbral de retirada es la fuerza a la que el ratón responde el 50% de las veces.

4. Recolección y análisis histológico del tejido pancreático

1. Sacrifique a los ratones bajo anestesia por dislocación cervical y diseccione cuidadosamente el páncreas del intestino y otros órganos.
2. Fije el páncreas en paraformaldehído al 10% durante 24 h, incrute parafina, corte secciones de tejido de 5 μm de espesor y colóquelas en portaobjetos de vidrio para teñirlos.
3. Realizar la tinción de hematoxilina-eosina y tricrómica de Masson utilizando métodos estándar como se informó anteriormente⁴.

Resultados

Los procedimientos de infusión de conductos biliares se optimizaron para reducir la mortalidad de ratones asociada con este procedimiento¹⁰. TNBS se administró por primera vez en un volumen total de 35 μL o 50 μL. La inyección de TNBS en un volumen de 50 μL podría llegar a todo el páncreas e inducir un fenotipo de enfermedad más homogéneo(Figura 1B). Además, la inyección de TNBS utilizando una jeringa de insulina con aguja 31G podría controlar mejor la ve...

Discusión

La infusión de TNBS en las vías biliares para inducir pancreatitis crónica es técnicamente un desafío en ratones, ya que hasta el 22,5% de los ratones pueden morir dentro de los 3-4 días posteriores a la infusión del medicamento¹⁰. Aquí, este informe refinó el procedimiento basado en estudios previos y redujo la mortalidad temprana de ratones a <10%. Por ejemplo, el aumento del volumen de medicamentos (de 35 μL a 50 μL) puede garantizar que los medicamentos lleguen a todo el páncreas. ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Neutral buffered formalin v/v	Fisher Scientific	23426796
Alcohol prep pads, sterile	Fisher Scientific	22-363-750
Animal Anesthesia system	VetEquip, Inc.	901806
Buprenorphine hydrochloride, injection	Par Sterile Products, LLC	NDC 42023-179-05
Centrifuge tubes, 15 mL	Fisher Scientific	0553859A
Ethanol, absolute (200 proof), molecular biology grade	Fisher Scientific	BP2818500
Extra fine Micro Dissecting scissors 4” straight sharp	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5882
Graefe forceps 4” extra delicate tip	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5136
Heated pad	Amazon	B07HMKMBKM
Hegar-Baumgartner Needle Holder 5.25”	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-7850
Insulin syringe with 31-gauge needle	BD	324909
Iodine prep pads	Fisher Scientific	19-027048
Isoflurane	Piramal Critical Care	NDC 66794-017-25
Micro clip applying forceps 5.5”	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5410
Micro clip, straight strong curved 1x6mm	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5433
Micro clip, straight, 0.75mm clip width	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5420
Picrylsulfonic acid solution, TNBS, 1M in H2O	Millipore Sigma	92822-1ML
Polypropylene Suture 4-0	Med-Vet International	MV-8683
Polypropylene Suture 5-0	Med-Vet International	MV-8661
Sodium chloride, 0.9% intravenous solution	VWR	2B1322Q
Surgical drape, sterile	Med-Vet International	DR1826
Tissue Cassette	Fisher Scientific	22-272416
Von Frey filaments	Bioseb	EB2-VFF