Safra Kanalı TNBS infüzyonu ile Kronik Pankreatit için Bir Fare Modeli

Özet

Kronik pankreatit (CP), genellikle inatçı karın ağrısı ile ilişkili olan pankreasın iltihabı ve fibrozisi ile karakterize bir hastalıktır. Bu makalede, 2,4,6 -trinitrobenzen sülfiyonik asit (TNBS) ile safra kanalı infüzyonu yoluyla CP'nin fare modelini oluşturma tekniğinin iyileştirilmesine odaklanmaktadır.

Özet

Kronik pankreatit (CP), pankreas iltihabı ve fibrozis, glandüler atrofi, karın ağrısı ve diğer semptomları içeren karmaşık bir hastalıktır. Safra kanalı 2,4,6 -trinitrobenzen sülfikonik asit (TNBS) infüzyon modelinin CP'de görülen nöropatik ağrının özelliklerini çoğalttığı CP'yi incelemek için çeşitli kemirgen modelleri geliştirilmiştir. Bununla birlikte, farelerde safra yolu ilaç infüzyonu teknik olarak zordur. Bu protokol, cp fare modeli üretimi için safra kanalı TNBS infüzyon prosedürünü gösterir. TNBS, duodenumdaki Vater ampullası aracılığıyla pankreasa aşılandı. Bu protokol, işlem sırasında ilaç hacmini, cerrahi teknikleri ve ilaç kullanımını optimize etti. TNBS ile tedavi edilen fareler, vücut ağırlığı ve pankreas kilo azalmaları, ağrıya bağlı davranışlardaki değişiklikler ve anormal pankreas morfolojisi ile yansıtıldığı gibi CP özellikleri gösterdi. Bu gelişmelerle TNBS enjeksiyonu ile ilişkili mortalite en az düzeydeydi. Bu prosedür sadece pankreas hastalığı modellerinin oluşturulmasında kritik değildir, aynı zamanda lokal pankreas ilacı dağıtımında da yararlıdır.

Giriş

Kronik pankreatit (CP), pankreas atrofisi, fibrozis, karın ağrısı ve hem ekzokrin hem de endokrin fonksiyonların nihai kaybı ile karakterize kronik bir enflamatuar hastalıktır¹. Mevcut tıbbi ve cerrahi tedaviler iyileştirici değildir, ancak hastalığın sonucu olan semptomları hafifletmek için üstlenilir: refrakter karın ağrısı, endokrin ve ekzokrin disfonksiyon. Bu nedenle, acilen daha etkili tedavilere ihtiyaç vardır². Hayvan modelleri, hastalığın daha iyi anlaşılması ve potansiyel terapötiklerin araştırılması için gerekli bir araç sağlar³. CP için cerulein ve/veya alkol modellerinin yaygın olarak kullanıldığı birden fazla fare modeli geliştirilmiştir. Bir oligopeptid uyarıcı pankreas salgısı olan Cerulein'in, pankreas atrofisi, fibrozis içeren bir CP modelini tekrar tekrar teşvik ettiği gösterilmiştir⁴. Başka bir yaygın model, insan hastalarda gözlemlenene benzer ekzokrin yetmezlik üreten L-arginin seri enjeksiyonlarını kullanır⁵. CP ayrıca komple veya kısmi pankreas kanalı ligasyonu ve pankreas kanalı^{hipertansiyonu 6,7}ile de indüklenebilir. CP için mevcut hayvan modellerinin çeşitliliğine rağmen, bu modellerin hiçbiri CP hastalarının yaşadığı karın ağrısını etkili bir şekilde yeniden üretmez⁸.

Önceki çalışmalar, 2,4,6 -trinitrobenzen sülfikonik asit (TNBS) lokal pankreas enjeksiyonunun CP hastalarının yaşadığı kalıcı ağrıyı⁹, 10^,11çoğaldığını göstermiştir. TNBS ile tedavi edilen fareler, karın aşırı duyarlılığı ve ağrıya bağlı davranışların artmasının yanı sıra, CP hastalarında gözlenen bir fenomen olan ağrılı uyaranlara "genelleştirilmiş aşırı duyarlılık" göstermiştir¹⁰. CP ağrısını doğru bir şekilde taklit etmenin yanı sıra, TNBS modeli ayrıca fibrozis, mononükleer hücre infiltrasyon ve acınar hücrelerin yağ dokusu ile değiştirilmesi gibi insan durumunun diğer patolojik özelliklerini de çoğaltır^10,12. Bununla birlikte, safra kanalı ile TNBS infüzyonu, farelerde ölüme neden olabilecek teknik olarak zorlu bir prosedürdür. Bilgimize göre, safra kanalı infüzyonunun nasıl yapıldığını gösteren görsel bir protokol yoktur. Bu yazıda, bir CP fare modeli oluşturmak için TNBS safra kanalı infüzyonunun prosedürünü gösteriyoruz. Bu prosedür CP ve diğer pankreas hastalıklarının incelenmesi için değerli hayvan modelleri üretmeye yardımcı olacak ve pankreas^13'ediğer malzemeleri (örneğin virüs, hücreler) aşılamak için kullanılabilir.

Protokol

Tüm prosedürler, Güney Carolina Tıp Üniversitesi ve Ralph H. Johnson Tıp Merkezi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitelerinin onayıyla gerçekleştirildi. Bu çalışmada 8-10 haftalık C57BL/6J erkek fareler kullanılmıştır. Fareler, yiyecek ve suya reklam libitumaccess ile standart bir 12 ışık / 12 karanlık döngü altında barındırıldı.

1. Enjeksiyon için TNBS çözeltisinin hazırlanması

1. % 0.9 salin içinde% 10 etanol hazırlayın. %10 etanol 1 mL'ye 7,5 μL TNBS ekleyerek stok TNBS'yi (bkz. Malzeme Tablosu)%10 etanol içinde 7,5 mM'lik nihai konsantrasyonda çözün.
   DİkKAT: TNBS kimyasal bir tehlike oluşturur. Çözeltiyi bir duman kaputunun içine hazırlayın ve TNBS ile doğrudan teması önlemek için eldiven, gözlük ve laboratuvar önlüğü gibi kişisel koruyucu ekipmanlar kullanın.
2. 50 μL%0,75 TNBS çözeltisini 31 kalibrelik bir iğne ile bir insülin şırıngasına yükleyin. Salin içinde araç kontrolü ile aynı boyutta bir şırınna 50 μL%10 etanol yükleyin. Şırınnaları buza yerleştirin ve ihtiyaç duyulana kadar ışıktan koruyun.

2. Fare hazırlama ve ameliyat

1. Karın cerrahi bölgesinden saçları tıraş edin.
2. Ameliyattan önce analjezik dozda (örneğin, buprenorfin 0.1 mg/kg i.p.) bir adet önceden enjekte edin.
3. Fareyi% 1.5-2 izofluran ve 1 L / dk oksijen ile genel anestezi altında indükle ve koruyun. Parmakları sıkıştırarak ve hayvanı refleks eksikliği nedeniyle gözlemleyerek anesteziyi onaylayın.
4. Ameliyat sırasında fareyi ısıtılmış bir cerrahi ped üzerine yerleştirin. Fare anestezi altındayken her göze veteriner merhem uygulayın.
5. Cerrahi bölgeyi %2 iyotla 3x silerek, ardından %70 alkol(Malzeme Masası)ile dezenfekte edin.
6. 0,5-1 cm'lik bir kesi oluşturmak için mikro makasla laparotomi gerçekleştirin.
7. Duodenumu hafifçe maruz bırak ve pamuklu çubuklar ( Malzeme Masası ) kullanarak ortak safrakanalınıbulun.
8. TNBS veya araççözeltilerininkaraciğere ve safra kesesine akışını önlemek için proksimal ortak kanalın üzerine düz bir mikro hemo klipsi ( Malzeme Tablosu ) yerleştirin (Şekil 1A, B).
9. Duodenumu hafifçe maruz koyun ve iğneyi Vater'in papillası aracılığıyla pankreas kanalına yerleştirin.
10. İğne kanalın içine girdikten sonra, iğneyi yerine sabitlemek ve enjekte edilençözeltininduodenuma girmesini önlemek için iğneyi çevreleyen duodenumun üzerine kavisli bir mikro hemo klipsi(Malzeme Tablosu ) yerleştirin .
11. Çözeltiyi (TNBS veya araç) bir dakika boyunca pankreas kanalına yavaş yavaş aşılayın.
    NOT: TNBS'nin bir dakika içinde yavaşça aşılanması gerekir ve pankreas 5/16 inç ve 31G iğneli bir insülin şırıngası ile perfüzyon edildiğinde infüzyon hızını kontrol etmek kolaydır. Safra kanalına batmamak için eli mümkün olduğunca sabit tutun. TNBS başarıyla enjekte edilirse, pankreasın içinde sarı renk görülebilir.
12. İnfüzyondan sonra, karaciğerin yakınındaki mikro kelepçeyi dikkatlice çıkarın ve ardından iğneyi ve duodenumu tutan mikro kelepçeyi çıkarın.
13. Duodenumu dikkatlice orijinal konumuna getirin.
14. Duodenumun orijinal konumuna dönmesine yardımcı olmak ve peristalsin iyileşmesine yardımcı olmak için kapanmadan önce karın boşluğunda 0,5 mL sıcak steril salin (36-37 °C) bırakın.
15. 5-0 dikiş ile sürekli dikiş kullanarak kas tabakasındaki kesiği kapatın. 4-0 dikiş ile yarıda kalan dikiş kullanarak cildi kapatın.
16. Anesteziden iyileşmeyi sağlamak için fareleri içeren kafesi bir ısıtma yastığına yerleştirin.
17. Farelerin sıcak olduğunu ve bekleme odasına geri dönmeden önce spontan hareket edebildiğini onaylayın.
18. Her 12 saatte bir analjezik (örneğin, buprenorfin 0.1 mg/kg i.p.) ve ameliyat sonrası 48 saat için ek ısı sağlamaya devam edin.

3. Fare davranışını izleme

1. Ameliyat sonrası 7. günde dikişleri çıkarın.
2. Ameliyat sonrası ilk hafta boyunca fare sağlığını ve davranışını günlük olarak izleyin. Seslendirme, kambur sırt duruşu veya daha az hareket etme gibi sıkıntı belirtilerine dikkat edin. Vücut ağırlığını her gün ölçün.
3. Von Frey monofilamentlerini (VFF' ler) karın mekanik aşırı duyarlılığını ölçmek için kullanın ve ameliyat sonrası⁹,¹⁴olarak tanımlandığı gibi^2,3 hafta.
   1. Her 1-2 sn'de 10x olan üst karın bölgesine artan sırada farklı uygulanan kuvvetlerin VFF'lerini uygulayın. Karnın yükseltilmesini, geri çekilmesini veya yalamasını (çekilme yanıtı) olumlu bir yanıt olarak düşünün.
   2. Olumlu bir yanıt gözlenmezse daha güçlü bir uyaran, olumlu bir yanıt gözlenirse daha zayıf bir uyaran uygulayın. Çekilme eşiği, farenin zamanın% 50'sini yanıtladığı kuvvettir.

4. Pankreas dokusunun toplanması ve histolojik analizi

1. Servikal çıkık ile anestezi altındaki fareleri kurban edin ve pankreası bağırsaktan ve diğer organlardan dikkatlice parçalara ayırmayın.
2. Pankreası 24 saat boyunca% 10 paraformaldehitte sabitleyin, parafin içine gömün, 5 μm kalınlığında doku bölümlerini kesin ve boyama için cam slaytlara yerleştirin.
3. Hematoksilin-eosin ve Masson'un üç renkli boyamasını daha önce bildirildiği gibi standart yöntemler kullanarak gerçekleştirin⁴.

Sonuçlar

Safra kanalı infüzyon prosedürleri, bu prosedürle ilişkili fare mortalitesini azaltmak için optimize edilmiştir¹⁰. TNBS ilk olarak toplam 35 μL veya 50 μL hacimde verildi. TNBS'nin 50 μL'lik bir hacimde enjeksiyonu tüm pankreasa ulaşabilir ve daha homojen bir hastalık fenotipine neden olabilir (Şekil 1B). Ek olarak, 31G iğne ile insülin şırıngası kullanılarak TNBS enjeksiyonu, düzenli şırıngalara ve iğne boyutlarına göre infüzyon hızını...

Tartışmalar

Kronik pankreatit indükle etmek için TNBS'nin safra kanalı infüzyonu, farelerde teknik olarak zordur, çünkü farelerin% 22,5'i ilaç infüzyonunun 3-4 gün içinde ölebilir¹⁰. Burada, bu rapor önceki çalışmalara dayanarak prosedürü iyileştirdi ve erken fare ölüm oranını% <10'a düşürdü. Örneğin, artan ilaç hacmi (35 μL'den 50μL'ye kadar) ilaçların tüm pankreasa ulaşmasını sağlayabilir. Bir insülin şırıngası ve daha küçük bir iğne boyutu (31G) kullanmak, pa...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Neutral buffered formalin v/v	Fisher Scientific	23426796
Alcohol prep pads, sterile	Fisher Scientific	22-363-750
Animal Anesthesia system	VetEquip, Inc.	901806
Buprenorphine hydrochloride, injection	Par Sterile Products, LLC	NDC 42023-179-05
Centrifuge tubes, 15 mL	Fisher Scientific	0553859A
Ethanol, absolute (200 proof), molecular biology grade	Fisher Scientific	BP2818500
Extra fine Micro Dissecting scissors 4” straight sharp	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5882
Graefe forceps 4” extra delicate tip	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5136
Heated pad	Amazon	B07HMKMBKM
Hegar-Baumgartner Needle Holder 5.25”	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-7850
Insulin syringe with 31-gauge needle	BD	324909
Iodine prep pads	Fisher Scientific	19-027048
Isoflurane	Piramal Critical Care	NDC 66794-017-25
Micro clip applying forceps 5.5”	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5410
Micro clip, straight strong curved 1x6mm	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5433
Micro clip, straight, 0.75mm clip width	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5420
Picrylsulfonic acid solution, TNBS, 1M in H2O	Millipore Sigma	92822-1ML
Polypropylene Suture 4-0	Med-Vet International	MV-8683
Polypropylene Suture 5-0	Med-Vet International	MV-8661
Sodium chloride, 0.9% intravenous solution	VWR	2B1322Q
Surgical drape, sterile	Med-Vet International	DR1826
Tissue Cassette	Fisher Scientific	22-272416
Von Frey filaments	Bioseb	EB2-VFF