通过胆管 TNBS 输液治疗慢性胰腺炎的鼠标模型

摘要

慢性胰腺炎 （CP） 是一种以胰腺炎症和纤维化为特征的疾病，通常与难以克服的腹痛有关。本文侧重于改进技术，通过胆管输液产生CP的小鼠模型与2，4，6-三硝基苯硫酸（TNBS）。

摘要

慢性胰腺炎 （CP） 是一种复杂的疾病，涉及胰腺炎症和纤维化、腺萎缩、腹痛和其他症状。已开发了几种啮齿动物模型来研究CP，其中胆管2，4，6-三硝基苯硫酸（TNBS）输液模型复制了CP中神经病变疼痛的特征。然而，胆管药物输注在小鼠是技术上具有挑战性的。此协议演示了胆管 TNBS 输注过程，用于生成 CP 鼠标模型。TNBS通过十二指肠的瓦特安普拉注入胰腺。该协议优化了药物体积、外科手术技术和药物处理过程。TNBS 治疗的小鼠表现出 CP 的特征，如体重和胰腺体重减轻、疼痛相关行为的变化和胰腺形态异常所反映。有了这些改进，与TNBS注射相关的死亡率是最小的。此过程不仅在生成胰腺疾病模型方面至关重要，而且对当地胰腺药物的提供也很有用。

引言

慢性胰腺炎 （CP） 是一种慢性炎症性疾病，其特征是胰腺萎缩、纤维化、腹痛，以及最终失去外分泌和内分泌功能^1.目前的医疗和外科治疗不是治疗性的，而是用来缓解疾病后果的症状:难治性腹痛、内分泌和外分泌功能障碍。因此，迫切需要更有效的治疗^。动物模型提供了一个基本工具，以发展更好地了解这种疾病和研究潜在的治疗^方法3。已开发了多个 CP 小鼠模型，其中通常使用纤维素和/或酒精模型。Cerulein，一种刺激胰腺分泌物的寡头肽，已被证明可重复诱导CP模型，其特征包括胰腺萎缩、纤维化等⁴种。另一种常见的模型使用L-精氨酸的连续注射，产生外分泌不足类似于在人类患者中观察到^的5。CP也可以由完全或部分胰腺管粘连，以及胰腺导管高血压^6，7诱导。尽管CP的动物模型种类繁多，但这些模型都没有有效地再现CP患者⁸经历的腹痛。

先前的研究表明，局部胰腺注射2，4，6-三硝基苯硫酸（TNBS）复制了CP患者^9，10，11经历的持续疼痛。TNBS治疗的小鼠表现出腹部过敏和增加疼痛相关行为，以及"普遍的超敏"疼痛刺激，这种现象已经观察到在CP患者^10。除了准确模仿CP疼痛，TNBS模型还复制了人类状况的其他病理特征，如纤维化，单核细胞渗透，以及用脂肪组织^10，12替换细胞。然而，通过胆管输液是一个技术上具有挑战性的程序，在小鼠可能会导致死亡。据我们所知，没有视觉协议来显示胆管输液是如何进行的。在本文中，我们演示了 TNBS 的胆汁诱导输注产生 CP 鼠标模型的程序。这个程序将有助于产生有价值的动物模型，用于CP和其他胰腺疾病的研究，并可用于注入其他材料（例如，病毒，细胞）到胰腺^13。

研究方案

所有程序均经南卡罗来纳医科大学动物护理和使用委员会和拉尔夫·约翰逊医疗中心批准。本研究使用了C57BL/6J雄性小鼠8-10周。老鼠被安置在一个标准的12光/12暗循环下，食物和水的自由。

1. 准备用于注射的 TNBS 解决方案

1. 在 0.9% 盐中准备 10% 乙醇。将 10% 乙醇中的库存 TNBS（参见 材料表）溶解到 7.5 mM 的最终浓度，将 7.5 μL 的 TNBS 加入 1 mL 的 10% 乙醇中。
   警告:TNBS 具有化学危害。在烟气罩内准备解决方案，并使用手套、护目镜和实验室外套等个人防护设备，避免与 TNBS 直接接触。
2. 将 50 μL 0.75% TNBS 溶液加载到带 31 米针头的胰岛素注射器中。将盐水中 10% 乙醇的 50 μL 装载到与车辆控制相同的大小的注射器中。将注射器放在冰上，保护它们免受光线的照射，直到需要为止。

2. 鼠标准备和手术

1. 从腹部手术区剃掉头发。
2. 手术前注射一剂先发制人的镇痛剂（例如丁丙诺啡0.1毫克/千克即p.p.）。
3. 在全身麻醉下诱导和维持小鼠，用1.5-2%的异黄素和1升/分钟的氧气。通过捏住脚趾和观察动物缺乏反射来确认麻醉。
4. 手术时将鼠标放在加热手术垫上。当小鼠麻醉时，在每只眼睛上涂抹兽药膏。
5. 用2%碘擦拭手术部位3倍，然后用70%酒精（材料表）消毒手术部位。
6. 用微型剪刀进行腹腔切除术，产生0.5-1厘米的切口。
7. 轻轻地暴露十二指肠，并使用棉签（材料表）定位常见的胆管。
8. 将一个直的微气片（材料表）放在近似公共导管上，以防止TNBS或车辆溶液流入肝脏和胆囊（图1A，B）。
9. 轻轻地暴露十二指肠，并通过瓦特的将针插入胰腺管中。
10. 一旦针头在管道内，在针头周围的十二指肠（图1A）上放置一个弯曲的微血红膜夹（材料表），以确保针头到位，并防止注射的溶液进入十二指肠。
11. 在一分钟内将溶液（TNBS 或车辆）逐渐注入胰腺导管。
    注:TNBS 需要在一分钟内缓慢注入，当胰腺用 5/16 英寸和 31G 针头注入胰岛素注射器时，很容易控制输液速度。保持手尽可能稳定，以避免刺胆管。如果成功注射TNBS，胰腺内可能会看到黄色。
12. 输液后，小心地取出肝脏附近的微夹，然后取出夹着针头和十二指肠的微夹子。
13. 小心地将十二指肠恢复到原来的位置。
14. 关闭前将 0.5 mL 的温暖无菌盐水（36-37 °C）留在腹腔中，以帮助十二指肠恢复其原始位置，并协助恢复腹膜病。
15. 用连续缝合以 5-0 缝合来关闭肌肉层的切口。用中断的缝合线缝合4-0针关闭皮肤。
16. 将装有老鼠的笼子放在加热垫上，以便从麻醉中恢复过来。
17. 确认小鼠是温暖的，能够自发运动，然后再返回到拘留室。
18. 继续每12小时提供镇痛剂（例如丁丙诺啡0.1毫克/千克），手术后48小时提供补充热量。

3. 监测鼠标行为

1. 手术后第7天切除缝合线。
2. 在手术后的第一周，每天监测小鼠的健康和行为。注意痛苦的迹象，如发声、驼背姿势或减少运动。每隔一天测量一次体重。
3. 使用冯弗雷单丝（VFFs）测量腹部机械过敏之前，和2，3周的手术后描述^9，14。
   1. 将不同应用力的 VFF 以每 1-2 s 10 倍的上升顺序应用于上腹部区域。将腹部的提升、缩回或舔（戒断反应）视为积极响应。
   2. 如果没有观察到积极反应，则实施更有力的刺激措施:如果观察到积极反应，则实施更弱的刺激。退出阈值是鼠标响应 50% 时间的力。

4. 胰腺组织的收集和组织分析

1. 通过颈椎错位在麻醉下牺牲小鼠，并仔细剖析肠道和其他器官的胰腺。
2. 将胰腺固定在 10% 的副甲醛中 24 小时，嵌入石蜡中，切割 5μm 厚度的组织部分，并将其放置在玻璃滑梯上进行染色。
3. 执行血氧素-奥辛，和马森的三色染色使用标准方法，如先前报告^4。

结果

胆管输液程序进行了优化，以降低与此程序相关的小鼠死亡率^。TNBS 首次提供总容量为 35 μL 或 50 μL。在50微升的体积内注射TNBS可以到达整个胰腺，并诱发更均匀的疾病表型（图1B）。此外，使用31G针头注射胰岛素注射器的TNBS可以更好地控制输液速度相对于常规注射器和针头的大小。与准备时间超过一小时的TNBS相比，储存在冰上并在药物制剂后一小时内使?...

讨论

在小鼠中，TNBS输液诱发慢性胰腺炎的胆管输液在技术上具有挑战性，因为多达22.5%的小鼠在药物输液^10天后3-4天内死亡。在这里，本报告在先前研究的基础上改进了程序，将早期小鼠死亡率降低到<10%。例如，药物量的增加（从 35 μL 增加到 50μL）可以确保药物到达整个胰腺。使用胰岛素注射器和较小的针头尺寸 （31G） 可减少胰腺导管的潜在损伤和胆汁渗入胆囊或腹部，这最有可...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Neutral buffered formalin v/v	Fisher Scientific	23426796
Alcohol prep pads, sterile	Fisher Scientific	22-363-750
Animal Anesthesia system	VetEquip, Inc.	901806
Buprenorphine hydrochloride, injection	Par Sterile Products, LLC	NDC 42023-179-05
Centrifuge tubes, 15 mL	Fisher Scientific	0553859A
Ethanol, absolute (200 proof), molecular biology grade	Fisher Scientific	BP2818500
Extra fine Micro Dissecting scissors 4” straight sharp	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5882
Graefe forceps 4” extra delicate tip	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5136
Heated pad	Amazon	B07HMKMBKM
Hegar-Baumgartner Needle Holder 5.25”	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-7850
Insulin syringe with 31-gauge needle	BD	324909
Iodine prep pads	Fisher Scientific	19-027048
Isoflurane	Piramal Critical Care	NDC 66794-017-25
Micro clip applying forceps 5.5”	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5410
Micro clip, straight strong curved 1x6mm	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5433
Micro clip, straight, 0.75mm clip width	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5420
Picrylsulfonic acid solution, TNBS, 1M in H2O	Millipore Sigma	92822-1ML
Polypropylene Suture 4-0	Med-Vet International	MV-8683
Polypropylene Suture 5-0	Med-Vet International	MV-8661
Sodium chloride, 0.9% intravenous solution	VWR	2B1322Q
Surgical drape, sterile	Med-Vet International	DR1826
Tissue Cassette	Fisher Scientific	22-272416
Von Frey filaments	Bioseb	EB2-VFF