Um modelo de rato para pancreatite crônica através da infusão TNBS do ducto biliar

Resumo

Pancreatite crônica (PC) é uma doença caracterizada por inflamação e fibrose do pâncreas, frequentemente associada a dor abdominal intratável. Este artigo se concentra na refinação da técnica para gerar um modelo de camundongo de CP via infusão de ducto biliar com ácido sulfônico de 2,4,6 -trinitrobenzene (TNBS).

Resumo

Pancreatite crônica (PC) é uma doença complexa que envolve inflamação pancreática e fibrose, atrofia glandular, dor abdominal e outros sintomas. Vários modelos de roedores foram desenvolvidos para estudar CP, dos quais o ducto biliar 2,4,6 -trinitrobenzeno modelo de infusão de ácido sulfônico (TNBS) replica as características da dor neuropática vista em CP. No entanto, a infusão de drogas de ducto biliar em camundongos é tecnicamente desafiadora. Este protocolo demonstra o procedimento de infusão tnbs do ducto biliar para a geração de um modelo de mouse CP. TNBS foi infundido no pâncreas através da ampola de Vater no duodeno. Este protocolo otimizeu o volume de medicamentos, técnicas cirúrgicas e o manuseio de drogas durante o procedimento. Os camundongos tratados com TNBS apresentaram características de CP refletidas por reduções de peso corporal e pâncreas, alterações nos comportamentos associados à dor e morfologia pancreática anormal. Com essas melhorias, a mortalidade associada à injeção de TNBS foi mínima. Este procedimento não é apenas crítico na geração de modelos de doenças pancreáticas, mas também é útil na entrega de medicamentos pancreáticos locais.

Introdução

Pancreatite crônica (PC) é uma doença inflamatória crônica caracterizada pela atrofia do pâncreas, fibrose, dor abdominal e eventual perda das funções exócrina e endócrina¹. Os tratamentos médicos e cirúrgicos atuais não são curativos, mas são realizados para aliviar sintomas que são consequência da doença: dor abdominal refratária, disfunção endócrina e exócrina. Portanto, tratamentos mais eficazes são urgentemente necessários². Os modelos animais fornecem uma ferramenta essencial para desenvolver uma melhor compreensão da doença e investigar possíveis terapêuticas³. Vários modelos de mouse para CP foram desenvolvidos, dos quais modelos de ceruleina e/ou álcool são comumente usados. Cerulein, um oligopeptide estimulando a secreção pancreática, tem sido mostrado para induzir reproduivelmente um modelo de CP com atrofia pancreática, fibrose, entre outros⁴. Outro modelo comum utiliza injeções seriais de L-arginina, que produz insuficiência exócrina semelhante à observada em pacientes humanos⁵. A CP também pode ser induzida por ligadura completa ou parcial do ducto pancreático, bem como hipertensão do ducto pancreático^6,7. Apesar da variedade de modelos animais disponíveis para PC, nenhum desses modelos reproduz efetivamente a dor abdominal experimentada pelos pacientes de PC⁸.

Estudos anteriores mostraram que a injeção pancreática local de 2,4,6 -trinitrobenzene ácido sulfônico (TNBS) replica a dor persistente experimentada pelos pacientes de PC^9,10,11. Os camundongos tratados com TNBS demonstraram hipersensibilidade abdominal e aumentaram os comportamentos relacionados à dor, bem como uma "hipersensibilidade generalizada" a estímulos dolorosos, fenômeno que tem sido observado em pacientes com PC¹⁰. Além de imitar com precisão a dor de CP, o modelo TNBS também replica outras características patológicas da condição humana, como fibrose, infiltração de células mononucleares e substituição de células acinar por tecido gorduroso^10,12. No entanto, a infusão de TNBS via ducto biliar é um procedimento tecnicamente desafiador em camundongos que pode causar a morte. Pelo que sabemos, não há protocolo visual para mostrar como a infusão do ducto biliar é realizada. Neste artigo, demonstramos o procedimento da infusão de dução bile de TNBS para gerar um modelo de mouse CP. Este procedimento ajudará a gerar modelos animais valiosos para o estudo de CP e outras doenças pancreáticas e pode ser usado para infundir outros materiais (por exemplo, vírus, células) no pâncreas¹³.

Protocolo

Todos os procedimentos foram conduzidos com a aprovação dos Comitês Institucionais de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Médica da Carolina do Sul e do Ralph H. Johnson Medical Center. Neste estudo, foram utilizados camundongos machos C57BL/6J entre 8 e 10 semanas de idade. Os camundongos estavam alojados sob um ciclo escuro padrão de 12 luz/12 com litbitumaccess ad libitumaccess à comida e à água.

1. Preparação da solução TNBS para injeção

1. Prepare 10% de etanol em 0,9% salina. Dissolver o estoque TNBS (ver Tabela de Materiais) em 10% de etanol para uma concentração final de 7,5 mM adicionando 7,5 μL de TNBS em 1 mL de 10% de etanol.
   ATENÇÃO: A TNBS apresenta um risco químico. Prepare a solução dentro de um capô de fumaça e use equipamentos de proteção individual, como luvas, óculos e um jaleco para evitar contato direto com a TNBS.
2. Carregue 50 μL de solução TNBS de 0,75% em uma seringa de insulina com uma agulha de calibre 31. Carregue 50 μL de 10% de etanol em soro fisiológico em uma seringa do mesmo tamanho do controle do veículo. Coloque as seringas no gelo e proteja-as da luz até que seja necessário.

2. Preparação e cirurgia do rato

1. Raspe o cabelo da área cirúrgica abdominal.
2. Injete uma dose preventiva do analgésico (por exemplo, buprenorfina 0,1 mg/kg i.p.) antes da cirurgia.
3. Induzir e manter o rato sob anestesia geral com 1,5-2% de isoflurane e 1 L/min de oxigênio. Confirme a anestesia beliscando os dedo dos dedo e observando o animal por falta de reflexo.
4. Coloque o mouse em uma almofada cirúrgica aquecida durante a cirurgia. Aplique pomada veterinária em cada olho quando o rato estiver sob anestesia.
5. Desinfetar o local cirúrgico limpando a área cirúrgica 3x com 2% de iodo, seguido por 70% de álcool(Tabela de Materiais).
6. Faça uma laparotomia com micro tesoura para gerar uma incisão de 0,5-1 cm.
7. Exponha suavemente o duodeno e localize o ducto biliar comum utilizando cotonetes de algodão (Tabela de Materiais).
8. Coloque um micro clipe de micro hemo retosobreo duto comum proximal para evitar o fluxo de TNBS ou soluções de veículo no fígado e na vesícula biliar(Figura 1A,B).
9. Exponha suavemente o duodeno e insira a agulha no ducto pancreático através da papila de Vater.
10. Uma vez que a agulha esteja dentro do duto, coloque um micro clipe de micro hemo curva(Tabela de Materiais) sobre o duodeno ao redor da agulha (Figura 1A) para fixar a agulha no lugar e evitar que a solução injetada entre no duodeno.
11. Infundir gradualmente a solução (TNBS ou veículo) no duto pancreático ao longo de um minuto.
    NOTA: O TNBS precisa ser infundido lentamente ao longo de um minuto de tempo, e é fácil controlar a velocidade de infusão quando o pâncreas é perfundido com uma seringa de insulina com uma agulha de 5/16 polegadas e 31G. Mantenha a mão o mais estável possível para evitar picar o ducto biliar. Se o TNBS for injetado com sucesso, a cor amarela pode ser visível dentro do pâncreas.
12. Após a infusão, remova cuidadosamente o micro grampo perto do fígado e, em seguida, remova o micro grampo segurando a agulha e o duodeno.
13. Retorne cuidadosamente o duodeno à sua posição original.
14. Deixe 0,5 mL de soro estéril quente (36-37 °C) na cavidade abdominal antes do fechamento, para ajudar o duodeno a retornar à sua posição original e auxiliar na recuperação da peristalse.
15. Feche a incisão na camada muscular usando sutura contínua com um ponto de 5-0. Feche a pele usando sutura interrompida com um ponto 4-0.
16. Coloque a gaiola contendo ratos em uma almofada de aquecimento para permitir a recuperação da anestesia.
17. Confirme se os ratos são quentes e capazes de movimento espontâneo antes de devolvê-los para a sala de espera.
18. Continue fornecendo um analgésico (por exemplo, buprenorfina 0,1 mg/kg i.p.) a cada 12h e calor suplementar para 48 h pós-cirurgia.

3. Monitorando o comportamento do mouse

1. Remova as suturas no 7º dia pós-cirurgia.
2. Monitore a saúde e o comportamento do rato diariamente durante a primeira semana pós-cirurgia. Cuidado com sinais de angústia, como vocalização, postura curvada nas costas ou menor locomoção. Meça o peso corporal dia não.
3. Use monofilamentos Von Frey (VFFs) para medir a hipersensibilidade mecânica abdominal antes, e 2, 3 semanas após a cirurgia, conforme descrito^9,14.
   1. Aplique VFFs de diferentes forças aplicadas na ordem ascendente à área abdominal superior 10x a cada 1-2 s. Considere o aumento, retração ou lambida do abdômen (resposta de retirada) como uma resposta positiva.
   2. Aplique um estímulo mais forte se uma resposta positiva não for observada, e um estímulo mais fraco se uma resposta positiva for observada. O limiar de retirada é a força com que o mouse responde 50% das vezes.

4. Coleta e análise histológica do tecido pancreático

1. Sacrifique os camundongos sob anestesia por deslocamento cervical, e disseca cuidadosamente o pâncreas do intestino e outros órgãos.
2. Fixar o pâncreas em 10% de paraformaldeído por 24 horas, incorporar em parafina, cortar seções teciduais de 5 μm de espessura e colocá-los em lâminas de vidro para coloração.
3. Realize a hematoxylin-eosina, e a coloração tricrática de Masson usando métodos padrão como relatado anteriormente⁴.

Resultados

Os procedimentos de infusão do ducto biliar foram otimizados para reduzir a mortalidade do camundongo associada a este procedimento¹⁰. O TNBS foi dado pela primeira vez em um volume total de 35 μL ou 50 μL. A injeção de TNBS em um volume de 50 μL poderia atingir todo o pâncreas e induzir um fenótipo de doença mais homogêneo(Figura 1B). Além disso, a injeção de TNBS usando seringa de insulina com agulha 31G poderia controlar melhor a velocidade de infusão...

Discussão

A infusão do ducto biliar de TNBS para induzir pancreatite crônica é tecnicamente desafiadora em camundongos, pois até 22,5% dos camundongos podem morrer dentro de 3-4 dias de infusão de medicamentos¹⁰. Aqui, este relatório refinou o procedimento com base em estudos anteriores e reduziu a mortalidade precoce do camundongo para <10%. Por exemplo, o aumento do volume de drogas (de 35 μL a 50μL) pode garantir que as drogas atinjam todo o pâncreas. O uso de uma seringa de insulina e um tamanh...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Neutral buffered formalin v/v	Fisher Scientific	23426796
Alcohol prep pads, sterile	Fisher Scientific	22-363-750
Animal Anesthesia system	VetEquip, Inc.	901806
Buprenorphine hydrochloride, injection	Par Sterile Products, LLC	NDC 42023-179-05
Centrifuge tubes, 15 mL	Fisher Scientific	0553859A
Ethanol, absolute (200 proof), molecular biology grade	Fisher Scientific	BP2818500
Extra fine Micro Dissecting scissors 4” straight sharp	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5882
Graefe forceps 4” extra delicate tip	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5136
Heated pad	Amazon	B07HMKMBKM
Hegar-Baumgartner Needle Holder 5.25”	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-7850
Insulin syringe with 31-gauge needle	BD	324909
Iodine prep pads	Fisher Scientific	19-027048
Isoflurane	Piramal Critical Care	NDC 66794-017-25
Micro clip applying forceps 5.5”	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5410
Micro clip, straight strong curved 1x6mm	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5433
Micro clip, straight, 0.75mm clip width	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5420
Picrylsulfonic acid solution, TNBS, 1M in H2O	Millipore Sigma	92822-1ML
Polypropylene Suture 4-0	Med-Vet International	MV-8683
Polypropylene Suture 5-0	Med-Vet International	MV-8661
Sodium chloride, 0.9% intravenous solution	VWR	2B1322Q
Surgical drape, sterile	Med-Vet International	DR1826
Tissue Cassette	Fisher Scientific	22-272416
Von Frey filaments	Bioseb	EB2-VFF