Мышиная модель хронического панкреатита с помощью инфузии TNBS желчных протоков

Хронический панкреатит (ХП) – это заболевание, характеризующееся воспалением и фиброзом поджелудочной железы, часто связанное с трудноизлечимыми болями в животе. Эта статья посвящена совершенствованию метода генерации мышиной модели CP с помощью инфузии желчных протоков с 2,4,6-тринитробензолсульфоновой кислотой (TNBS).

Аннотация

Хронический панкреатит (ХП) является сложным заболеванием, включающим воспаление и фиброз поджелудочной железы, атрофию желез, боль в животе и другие симптомы. Для изучения ДЦП было разработано несколько моделей грызунов, из которых инфузионная модель желчного протока 2,4,6-тринитробензоловой сульфоновой кислоты (TNBS) воспроизводит особенности невропатичной боли, наблюдаемой при ДЦП. Тем не менее, инфузия препарата желчных протоков у мышей технически сложна. Данный протокол демонстрирует процедуру инфузии TNBS желчных протоков для генерации модели мыши CP. TNBS вливали в поджелудочную железу через ампулу Фатера в двенадцатиперстной кишки. Этот протокол оптимизировал объем препарата, хирургические методы и обращение с лекарствами во время процедуры. Мыши, получаемые TNBS, показали особенности CP, отраженные в снижении массы тела и веса поджелудочной железы, изменениях в поведении, связанном с болью, и аномальной морфологии поджелудочной железы. С этими улучшениями смертность, связанная с инъекцией TNBS, была минимальной. Эта процедура не только имеет решающее значение для создания моделей заболеваний поджелудочной железы, но также полезна для местной доставки лекарств поджелудочной железе.

Введение

Хронический панкреатит (ХП) является хроническим воспалительным заболеванием, характеризующимся атрофией поджелудочной железы, фиброзом, болью в животе и возможной потерей как экзокринных, так и эндокринных функций^1. Современные медицинские и хирургические методы лечения не являются лечебными, но предпринимаются для облегчения симптомов, которые являются следствием заболевания: рефрактерная боль в животе, эндокринная и экзокриновая дисфункция. Поэтому срочно необходимы более эффективные методы^{лечения 2.} Животные модели обеспечивают важный инструмент для развития лучшего понимания заболевания и исследования потенциальных терапевтических средств^3. Было разработано несколько моделей мышей для CP, из которых обычно используются модели церулеина и / или алкоголя. Было показано, что церулеин, олигопептидно-стимулирующий секрецию поджелудочной железы, воспроизводимо индуцирует модель CP с атрофией поджелудочной железы, фиброзом, среди прочих^4. Другая распространенная модель использует серийные инъекции L-аргинина, который вызывает экзокриновую недостаточность, аналогичную той, которая наблюдается у пациентов с человеческим^5. ДЦП также может быть индуцирована полным или частичным лигированием протоков поджелудочной железы, а также гипертонией протоков поджелудочной железы^6,^7. Несмотря на разнообразие животных моделей, доступных для ДЦП, ни одна из этих моделей эффективно не воспроизводит боль в животе, испытываемую пациентами с^{ДЦП 8.}

Предыдущие исследования показали, что местная инъекция поджелудочной железы 2,4,6-тринитробензолсульфоновой кислоты (ТНБС) воспроизводит постоянную боль, испытываемую пациентами с^{ДЦП 9,}^10,^11. Мыши, получавших TNBS, продемонстрировали абдоминальную гиперчувствительность и повышенное поведение, связанное с болью, а также «генерализованную гиперчувствительность» к болевым раздражителям, явление, которое наблюдалось у пациентов с ДЦП^10. В дополнение к точному имитированию боли CP, модель TNBS также воспроизводит другие патологические особенности состояния человека, такие как фиброз, инфильтрация мононуклеарных клеток и замена ацинарных клеток жировой^{тканью 10,}^12. Тем не менее, инфузия TNBS через желчный проток является технически сложной процедурой у мышей, которая может привести к смерти. Насколько нам известно, не существует визуального протокола, чтобы показать, как выполняется инфузия желчных протоков. В этой статье мы продемонстрируем процедуру инфузии желчи TNBS для генерации модели мыши CP. Эта процедура поможет создать ценные животные модели для изучения ДЦП и других заболеваний поджелудочной железы и может быть использована для влития других материалов (например, вируса, клеток) в поджелудочную железу^13.

протокол

Все процедуры были проведены с одобрения институциональных комитетов по уходу за животными и их использованию в Медицинском университете Южной Каролины и Медицинском центре Ральфа Х. Джонсона. В этом исследовании использовались самцы мышей C57BL/6J в возрасте от 8 до 10 недель. Мышей размещали по стандартному циклу 12 светлых/ 12 темных с ad libitum доступом к пище и воде.

1. Приготовление раствора TNBS для инъекций

Готовят 10% этанол в 0,9% физиологического раствора. Растворить запас TNBS (см. Таблицу материалов)в 10% этаноле до конечной концентрации 7,5 мМ путем добавления 7,5 мкл TNBS в 1 мл 10% этанола.
ВНИМАНИЕ: TNBS представляет химическую опасность. Подготовьте раствор внутри вытяжного капюшона и используйте средства индивидуальной защиты, такие как перчатки, очки и лабораторный халат, чтобы избежать прямого контакта с TNBS.
Загрузите 50 мкл 0,75% раствора TNBS в инсулиновый шприц с помощью иглы 31-го калибра. Загрузите 50 мкл 10% этанола в физиологический раствор в шприц того же размера, что и управление транспортным средством. Поместите шприцы на лед и защитите их от света до тех пор, пока это не понадобится.

2. Подготовка и хирургия мышей

Сбрить волосы из брюшной полости хирургической области.
Вводят одну упреждающей дозу анальгетика (например, бупренорфина 0,1 мг/кг в.п.) перед операцией.
Индуцировать и поддерживать мышь под общим наркозом с 1,5-2% изофлурана и 1 л/мин кислорода. Подтвердите анестезию, ущипнив щипать ноши и наблюдая за животным на отсутствие рефлекса.
Поместите мышь на нагретую хирургическую прокладку во время операции. Наносите ветеринарную мазь на каждый глаз, когда мышь находится под наркозом.
Продезинфицируйте место операции, протирая хирургическую область 3x 2% йода, а затем 70%спиртом (Таблица материалов).
Выполните лапаротомию микроножами для создания разреза 0,5-1 см.
Осторожно обнажите двенадцатиперстную кишки и найдите общий желчный проток с помощью ватных тампонов(Таблица материалов).
Поместите прямой микро-гемозажим(Таблица материалов)над проксимальным общим протоком, чтобы предотвратить поступление TNBS или растворов транспортных средств в печень и желчный пузырь(рисунок 1A,B).
Осторожно обнажите двенадцатиперстную кишку и вставьте иглу в проток поджелудочной железы через сосочек Фатера.
Как только игла находится внутри протока, поместите изогнутый микро-гемозажим(Таблица материалов)над двенадцатиперстной кишкой, окружающей иглу(рисунок 1А),чтобы закрепить иглу на месте и предотвратить попадание введенного раствора в двенадцатиперстную кишки.
Постепенно вводят раствор (ТНБС или носитель) в проток поджелудочной железы в течение одного мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: TNBS необходимо вводить медленно в течение одной минуты времени, и легко контролировать скорость инфузии, когда поджелудочная железа перфузирована инсулиновым шприцем с иглой 5/16 дюйма и 31G. Держите руку как можно более устойчивой, чтобы избежать прокалывания желчного протока. Если TNBS успешно введен, желтый цвет может быть виден внутри поджелудочной железы.
После инфузии осторожно снимите микрозажим возле печени, а затем удалите микрозажим, удерживая иглу и двенадцатиперстную кишки.
Осторожно верните двенадцатиперстную кишки в исходное положение.
Оставьте 0,5 мл теплого стерильного физиологического раствора (36-37 °C) в брюшной полости до закрытия, чтобы помочь двенадцатиперстной кишки вернуться в исходное положение и помочь с восстановлением перистальтики.
Закройте разрез в мышечном слое с помощью непрерывного шва с 5-0 швом. Закройте кожу прерывым швом швом 4-0.
Поместите клетку, содержащую мышей, на грелку, чтобы обеспечить восстановление после анестезии.
Подтвердите, что мыши теплые и способны к спонтанному движению, прежде чем вернуть их в комнату для хранения.
Продолжайте принимать анальгетик (например, бупренорфин 0,1 мг/кг в/кг в/п.) каждые 12 ч и дополнительное тепло в течение 48 ч после операции.

3. Мониторинг поведения мыши

Снимают швы на 7 день после операции.
Ежедневно контролируйте здоровье и поведение мышей в течение первой недели после операции. Следите за признаками дистресса, такими как вокализация, сгорбленная поза спины или снижение локомоции. Измеряйте массу тела через день.
Используйте мононити фон Фрея (VFF) для измерения абдоминальной механической гиперчувствительности до и через 2, 3 недели после операции, как описано^9,^14.
1. Применяют ФПФ различных приложенных сил в порядке возрастания к верхней области живота 10 раз в 1-2 с. Рассматривайте поднятие, втягивание или облизывание живота (реакция отмены) как положительную реакцию.
2. Применяйте более сильный стимул, если положительный ответ не наблюдается, и более слабый стимул, если наблюдается положительный ответ. Порог вывода — это сила, с которой мышь реагирует в 50% случаев.

4. Сбор и гистологический анализ тканей поджелудочной железы

Приносят мышей в жертву под наркозом при вывихе шейки матки, и тщательно рассекивают поджелудочную железу от кишечника и других органов.
Зафиксируйте поджелудочную железу в 10% параформальдегиде в течение 24 ч, вставьте в парафин, вырежьте участки тканей толщиной 5 мкм и поместите их на стеклянные слайды для окрашивания.
Выполняют гематоксилин-эозин и трихромное окрашивание Массона с использованием стандартных методов, как сообщалось^{ранее 4.}

Результаты

Процедуры инфузии желчных протоков были оптимизированы для снижения смертности мышей, связанной с этой процедурой^10. TNBS впервые давали в общем объеме 35 мкл или 50 мкл. Инъекция ТНБС в объеме 50 мкл может достичь всей поджелудочной железы и вызвать более однородный фенотип заб...

Обсуждение

Инфузия желчных протоков TNBS для индуцирования хронического панкреатита технически сложна у мышей, так как до 22,5% мышей могут умереть в течение 3-4 дней после инфузии препарата^10. Здесь этот отчет уточнил процедуру, основанную на предыдущих исследованиях, и снизил раннюю смер...

Раскрытие информации

Все авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Благодарности

Это исследование было поддержано Департаментом по делам ветеранов (VA-ORD BLR & D Merit I01BX004536) и грантами Национального института здравоохранения No 1R01DK105183, DK120394 и DK118529 для HW. Мы благодарим д-ра Хунджу Ву за обмен техническим опытом.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Neutral buffered formalin v/v	Fisher Scientific	23426796
Alcohol prep pads, sterile	Fisher Scientific	22-363-750
Animal Anesthesia system	VetEquip, Inc.	901806
Buprenorphine hydrochloride, injection	Par Sterile Products, LLC	NDC 42023-179-05
Centrifuge tubes, 15 mL	Fisher Scientific	0553859A
Ethanol, absolute (200 proof), molecular biology grade	Fisher Scientific	BP2818500
Extra fine Micro Dissecting scissors 4” straight sharp	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5882
Graefe forceps 4” extra delicate tip	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5136
Heated pad	Amazon	B07HMKMBKM
Hegar-Baumgartner Needle Holder 5.25”	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-7850
Insulin syringe with 31-gauge needle	BD	324909
Iodine prep pads	Fisher Scientific	19-027048
Isoflurane	Piramal Critical Care	NDC 66794-017-25
Micro clip applying forceps 5.5”	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5410
Micro clip, straight strong curved 1x6mm	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5433
Micro clip, straight, 0.75mm clip width	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5420
Picrylsulfonic acid solution, TNBS, 1M in H₂O	Millipore Sigma	92822-1ML
Polypropylene Suture 4-0	Med-Vet International	MV-8683
Polypropylene Suture 5-0	Med-Vet International	MV-8661
Sodium chloride, 0.9% intravenous solution	VWR	2B1322Q
Surgical drape, sterile	Med-Vet International	DR1826
Tissue Cassette	Fisher Scientific	22-272416
Von Frey filaments	Bioseb	EB2-VFF