胆管TNBS輸液による慢性膵炎のマウスモデル

要約

慢性膵炎(CP)は、しばしば難治性腹痛に関連する膵臓の炎症および線維症を特徴とする疾患である。本稿では、2,4,6-トリニトロベンゼンスルホン酸(TNBS)を用いた胆管注入を介してCPのマウスモデルを生成する技術を改良することに焦点を当てています。

要約

慢性膵炎(CP)は、膵炎や線維症、腺萎縮、腹痛および他の症状を含む複雑な疾患である。CPを研究するためにいくつかのげっ歯類モデルが開発されており、そのうち胆管2,4,6 -トリニトロベンゼンスルホン酸(TNBS)注入モデルは、CPに見られる神経因性疼痛の特徴を再現しています。しかし、マウスの胆管薬物注入は技術的に困難です。このプロトコルは、CPマウスモデルの生成のための胆管TNBS注入の手順を示す。TNBSは十二指腸のヴァーターのアンフィラを通して膵臓に注入された。このプロトコルは、処置中に薬物容積、外科技術および薬物処理を最大限に活用した。TNBS治療マウスは、体重および膵臓の体重減少、疼痛関連行動の変化、および異常な膵形態によって反映されるCPの特徴を示した。これらの改善により、TNBS注射に伴う死亡率は最小限であった。この手順は、膵臓疾患モデルを生成する上で重要であるだけでなく、局所的な膵薬の送達にも有用である。

概要

慢性膵炎(CP)は、膵臓の萎縮、線維症、腹痛、および外分泌および内分泌機能の両方の最終的な喪失を特徴とする慢性炎症性疾患^である。現在の医学的および外科的治療は治癒的ではありませんが、難治性腹痛、内分泌および外分泌機能不全という疾患の結果である症状を緩和するために行われている。したがって、より効果的な治療が緊急に必要^{とされる2}.動物モデルは、病気のより良い理解を開発し、潜在的な治療薬を調査するための不可欠なツールを提供します³.CP用の複数のマウスモデルが開発されており、その中でセルリンやアルコールモデルが一般的に使用されています。セレルミンは、膵臓分泌を刺激するオリゴペプチドであり、膵萎縮、線維症、とりわけ⁴を特徴とするCPモデルを再現的に誘導することが示されている。別の一般的なモデルは、L-アルギニンの連続注射を使用します, 人間の患者で観察されたものと同様の外分泌不全を生成^{します 5}.CPはまた、完全または部分的な膵管結紮、ならびに膵管高血圧^6、7によって誘発され^得る。CPで利用可能な様々な動物モデルにもかかわらず、これらのモデルのどれも効果的にCP患者⁸によって経験した腹痛を再現しません。

これまでの研究では、2,4,6-トリニトロベンゼンスルホン酸(TNBS)の局所膵臓注射は^{、CP患者9、10、11}が経験した持続的な痛みを複製することを示した。TNBS処置マウスは、腹部過敏症および疼痛関連行動の増加ならびに痛みを伴う刺激に対する「一般化過敏症」を示し、CP患者¹⁰において観察されている現象である。TNBSモデルは、CP疼痛を正確に模倣することに加えて、線維症、単核細胞浸潤、および脂肪組織^10、12との共生細胞の置換などのヒト状態の他の病理学的特徴を複製する。しかし、胆管を介したTNBS注入は、死を引き起こす可能性のあるマウスでは技術的に困難な手順である。私たちの知る限りでは、胆管注入がどのように行われるかを示す視覚的なプロトコルはありません。本稿では、CPマウスモデルを生成するTNBSの胆管注入の手順を示す。この手順は、CPおよび他の膵臓疾患の研究のための貴重な動物モデルを生成するのに役立ち、膵臓¹³に他の材料(例えば、ウイルス、細胞)を注入するために使用することができる。

プロトコル

すべての手順は、サウスカロライナ医科大学とラルフ・H・ジョンソン医療センターの施設動物ケアおよび使用委員会の承認を得て行われました。C57BL/6J雄マウスは、8〜10週齢の間に、この研究で使用された。マウスは、食物および水へのアドリビタムアクセスを伴う標準的な12光/12暗いサイクルの下に収容された。

1. 注射用TNBS溶液の調製

1. 10%のエタノールを0.9%生理液に調製します。10%エタノールの1mLに7.5 μLを加えて、10%エタノールのストックTNBS( 材料表を参照)を最終濃度7.5mMに溶解します。
   注意:TNBSは化学的危険を示します。フュームフードの中に溶液を準備し、手袋、ゴーグル、ラボコートなどの個人用保護具を使用して、TNBSとの直接接触を避けてください。
2. 0.75%TNBS溶液の50 μLを31ゲージ針でインシュリンシリンジにロードします。50 μLの10%エタノールをサリンにロードし、車両制御と同じサイズのシリンジにします。注射器を氷の上に置き、必要になるまで光から保護します。

2. マウスの準備と手術

1. 腹部の外科領域から髪を剃ります。
2. 手術前に鎮痛薬の先制用量(例えば、ブプレノルフィン0.1mg/kg i.p.)を注入する。
3. 1.5-2%のイオブルランと1 L/分の酸素で全身麻酔下でマウスを誘導し、維持する。足の指をつまんで、反射の欠如のために動物を観察することによって麻酔を確認します。
4. 手術中に加熱された外科用パッドの上にマウスを置きます。マウスが麻酔下にある場合は、各眼に獣医軟膏を塗布します。
5. 手術部位を2%ヨウ素で3倍拭き、続いて70%アルコール(材料表)を拭いて外科部位を消毒する。
6. マイクロハサミで開腹術を行い、0.5〜1cmの切開を発生させる。
7. 十二指腸を穏やかに露出し、綿棒を使用して共通の胆管を見つける (材料のテーブル).
8. 真っ直ぐマイクロヘモクリップ(材料表)を近位共通ダクトの上に置き、TNBSまたは車両溶液が肝臓および胆嚢に流れ込むのを防ぎます(図1A、B)。
9. 十二指腸をそっと露出し、Vaterの乳頭を通して膵管に針を挿入します。
10. 針がダクトの中に入ったら、針を囲む十二指腸の上に湾曲したマイクロヘモクリップ(材料表)を置き、針を所定の位置に固定し、注入された溶液が十二指腸に入るのを防ぎます。
11. 徐々に1分の間に膵管に溶液(TNBSまたは車両)を注入します。
    注:TNBSは1分の時間をかけてゆっくりと注入する必要があり、膵臓に5/16インチと31G針のインスリン注射器を灌流すると注入速度を制御しやすくなります。胆管を刺さないように、手をできるだけ安定させておいてください。TNBSが正常に注入された場合、黄色の色が膵臓の内部に見えるかもしれません。
12. 注入後、肝臓の近くのマイクロクランプを慎重に取り外し、針と十二指腸を保持しているマイクロクランプを取り外します。
13. 慎重に元の位置に十二指腸を返します。
14. 閉鎖前に腹腔内に0.5mLの温かい滅菌生理液(36-37°C)を残して、十二指腸が元の位置に戻り、蠕動の回復を助ける。
15. 5-0ステッチの連続縫合を使用して、筋肉層の切開を閉じます。4-0ステッチで中断された縫合糸を使用して皮膚を閉じます。
16. マウスを含むケージを加熱パッドの上に置き、麻酔からの回復を可能にします。
17. マウスが暖かく、持ち場に戻す前に自発的な動きができることを確認してください。
18. 手術後も12時間ごとに鎮痛薬(例えば、ブプレノルフィン0.1mg/kg i.p.)と補助熱を提供し続ける。

3. マウスの動作を監視する

1. 7日目の手術後に縫合糸を取り除く。
2. 最初の週の手術後に、マウスの健康と行動を毎日監視します。発声、背中の姿勢、移動の減少などの苦痛の兆候に注意してください。一日おきに体重を測定します。
3. フォン・フレイのモノフィラメント(VFF)を使用して^、9,14に記載されているように、腹部の機械的過敏症を測定し、手術後2週間、3週間を行^います。
   1. 上腹部領域10x 1-2 sに昇順で異なる適用力のVFFを適用します。腹部の上昇、引き込み、または舐め(離脱反応)を肯定的な反応として考えてみましょう。
   2. 肯定的な反応が認められない場合は、より強い刺激を適用し、肯定的な応答が観察された場合は弱い刺激を適用します。引き出しのしきい値は、マウスが50%の時間で応答する力です。

4. 膵組織の採取と組織学的分析

1. 子宮頸部脱臼により麻酔下でマウスを犠牲にし、腸や他の器官から慎重に膵臓を解剖する。
2. 膵臓を24時間パラホルムアルデヒド10%に固定し、パラフィンに埋め込み、厚さ5μmの切片を切り取り、ガラススライドに入れて染色します。
3. ヘマトキシリン-エオジン、およびマッソンのトリクローム染色を、前述の4^{に記載した}標準的な方法を用いて行う。

結果

胆管注入手順は、この手順¹⁰に関連するマウスの死亡率を減少させるために最適化された。TNBSは、最初に35μLまたは50μLの総体積で与えられた。50 μLの容積でTNBSを注入すると、膵臓全体に達し、より均質な疾患表現型を誘導する可能性がある(図1B)。さらに、31G針を用いたインスリン注射器を使用したTNBSの注射は、通常の注射器および針のサイズに対す...

ディスカッション

慢性膵炎を誘発するTNBSの胆管注入は、マウスでは技術的に困難であり、マウスの最大22.5%が薬物注入¹⁰の3〜4日以内に死ぬ可能性がある。ここでは、この報告書は、以前の研究に基づいて手順を洗練し、早期マウス死亡率を<10%に減少させた。例えば、薬物量の増加(35μLから50μL)は、薬物が膵臓全体に到達することを保証することができる。インスリン注射器と小さい針サイ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Neutral buffered formalin v/v	Fisher Scientific	23426796
Alcohol prep pads, sterile	Fisher Scientific	22-363-750
Animal Anesthesia system	VetEquip, Inc.	901806
Buprenorphine hydrochloride, injection	Par Sterile Products, LLC	NDC 42023-179-05
Centrifuge tubes, 15 mL	Fisher Scientific	0553859A
Ethanol, absolute (200 proof), molecular biology grade	Fisher Scientific	BP2818500
Extra fine Micro Dissecting scissors 4” straight sharp	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5882
Graefe forceps 4” extra delicate tip	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5136
Heated pad	Amazon	B07HMKMBKM
Hegar-Baumgartner Needle Holder 5.25”	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-7850
Insulin syringe with 31-gauge needle	BD	324909
Iodine prep pads	Fisher Scientific	19-027048
Isoflurane	Piramal Critical Care	NDC 66794-017-25
Micro clip applying forceps 5.5”	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5410
Micro clip, straight strong curved 1x6mm	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5433
Micro clip, straight, 0.75mm clip width	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5420
Picrylsulfonic acid solution, TNBS, 1M in H2O	Millipore Sigma	92822-1ML
Polypropylene Suture 4-0	Med-Vet International	MV-8683
Polypropylene Suture 5-0	Med-Vet International	MV-8661
Sodium chloride, 0.9% intravenous solution	VWR	2B1322Q
Surgical drape, sterile	Med-Vet International	DR1826
Tissue Cassette	Fisher Scientific	22-272416
Von Frey filaments	Bioseb	EB2-VFF