מודל עכבר לדלקת לבלב כרונית באמצעות עירוי TNBS צינור המרה

Summary

דלקת לבלב כרונית (CP) היא מחלה המאופיינת בדלקת ופיברוזיס של הלבלב, הקשורים לעתים קרובות עם כאבי בטן עקשניים. מאמר זה מתמקד בשיפור הטכניקה ליצירת מודל עכבר של CP באמצעות עירוי צינור המרה עם 2,4,6 -טרינדרובנזן חומצה גופרתית (TNBS).

Abstract

דלקת לבלב כרונית (CP) היא מחלה מורכבת הכוללת דלקת לבלב ופיברוזיס, ניוון בלוטות, כאבי בטן ותסמינים אחרים. מספר מודלים מכרסמים פותחו כדי לחקור CP, אשר צינור המרה 2,4,6 -טריניטרובנזן חומצה גופרתית (TNBS) מודל עירוי משכפל את התכונות של כאב נוירופתי לראות CP. עם זאת, עירוי סמים צינור המרה בעכברים הוא מאתגר מבחינה טכנית. פרוטוקול זה מדגים את ההליך של עירוי TNBS צינור המרה עבור הדור של מודל עכבר CP. TNBS היה חדורה לתוך הלבלב דרך האמפולה של ואטר בתריסריון. פרוטוקול זה מיטב את נפח התרופה, טכניקות כירורגיות וטיפול בסמים במהלך ההליך. עכברים שטופלו ב-TNBS הראו תכונות של CP כפי שמשתקפות על ידי הפחתות במשקל הגוף והלבלב, שינויים בהתנהגויות הקשורות לכאב, ומורפולוגיה לבלב חריגה. עם שיפורים אלה, התמותה הקשורה הזרקת TNBS היה מינימלי. הליך זה הוא לא רק קריטי ביצירת מודלים מחלת הלבלב, אלא הוא גם שימושי במשלוח תרופות הלבלב המקומי.

Introduction

דלקת לבלב כרונית (CP) היא מחלה דלקתית כרונית המאופיינת על ידי ניוון הלבלב, פיברוזיס, כאבי בטן, ובסופו של דבר אובדן של תפקודים אקסוקריניים ואנדוקרינים¹. הטיפולים הרפואיים והכירורגיים הנוכחיים אינם מרפאים אך נעשים כדי להקל על הסימפטומים שהם תוצאה של המחלה: כאבי בטן עקשן, תפקוד אנדוקריני ואקסוקריני. לכן, טיפולים יעילים יותר נדרשים בדחיפות². מודלים של בעלי חיים מספקים כלי חיוני לפיתוח הבנה טובה יותר של המחלה וחקירת טיפולים פוטנציאליים³. מודלים עכבר מרובים עבור CP פותחו, אשר cerulein ו / או מודלים אלכוהול נפוצים. Cerulein, אוליגופפטיד מגרה הפרשת הלבלב, הוכח לגרום להתרבות מודל CP הכולל ניוון הלבלב, פיברוזיס, בין היתר⁴. מודל נפוץ אחר משתמש זריקות סדרתיות של L-ארגנין, אשר מייצרת אי ספיקה אקסוקרינית דומה לזו שנצפו בחולים אנושיים⁵. CP יכול גם להיות מושרה על ידי קשירת צינור הלבלב מלאה או חלקית, כמו גם יתר לחץ דם צינור הלבלב^6,7. למרות מגוון המודלים של בעלי חיים הזמינים עבור CP, אף אחד מהמודלים האלה למעשה משחזר את כאבי הבטן שחווים חולי CP⁸.

מחקרים קודמים הראו כי הזרקת לבלב מקומית של 2,4,6 - טריילרבנזן חומצה גופרתית (TNBS) משכפלת את הכאב המתמשך שחווים חולי CP^9,10,11. עכברים שטופלו ב- TNBS הדגימו רגישות יתר בבטן והתנהגויות מוגברות הקשורות לכאב, כמו גם "רגישות יתר כללית" לגירויים כואבים, תופעה שנצפתה בחולי CP¹⁰. בנוסף לחיקוי מדויק של כאבי CP, מודל TNBS משכפל גם תכונות פתולוגיות אחרות של המצב האנושי כגון פיברוזיס, חדירת תאים מונונוקלאריים והחלפת תאי סינאר ברקמת^{שומן 10,12}. עם זאת, עירוי TNBS באמצעות צינור המרה הוא הליך מאתגר מבחינה טכנית בעכברים שעלול לגרום למוות. למיטב ידיעתנו, אין פרוטוקול חזותי כדי להראות כיצד עירוי צינור המרה מבוצע. במאמר זה, אנו מדגימים את ההליך של עירוי אוורור מרה של TNBS כדי ליצור מודל עכבר CP. הליך זה יסייע לייצר מודלים בעלי ערך לבעלי חיים לחקר CP ומחלות לבלב אחרות וניתן להשתמש בו כדי להחדיר חומרים אחרים (למשל, וירוס, תאים) לתוך הלבלב¹³.

Protocol

כל ההליכים נערכו באישור ועדות הטיפול והשימוש בבעלי חיים המוסדיים באוניברסיטה הרפואית של דרום קרוליינה ובמרכז הרפואי ראלף ה. ג'ונסון. C57BL / 6J עכברים זכרים בין 8-10 שבועות של גיל שימשו במחקר זה. עכברים שוכנו תחת מחזור כהה סטנדרטי של 12 אור/ 12 עם ליביטומקס עד למזון ומים.

1. הכנת פתרון TNBS להזרקה

1. הכן 10% אתנול ב 0.9% מלוחים. להמיס את המניה TNBS (ראה טבלה של חומרים) ב 10% אתנול לריכוז סופי של 7.5 מ"מ על ידי הוספת 7.5 μL של TNBS לתוך 1 מ"ל של 10% אתנול.
   זהירות: TNBS מהווה סכנה כימית. הכן את הפתרון בתוך מכסה המנוע של האדים והשתמש בציוד מגן אישי כגון כפפות, משקפי מגן וחלוק מעבדה כדי להימנע ממגע ישיר עם TNBS.
2. לטעון 50 μL של 0.75% פתרון TNBS לתוך מזרק אינסולין עם מחט 31-מד. לטעון 50 μL של 10% אתנול מלוח לתוך מזרק באותו גודל כמו בקרת רכב. מניחים את המזרקים על הקרח ומגינים עליהם מפני אור עד הצורך.

2. הכנת עכבר וניתוח

1. תגלח את השיער מאזור ניתוח הבטן.
2. הזריקו מנה אחת מראש של המשפך (למשל, בופרנורפין 0.1 מ"ג/ק"ג i.p. ) לפני הניתוח.
3. לגרום ולשמור על העכבר תחת הרדמה כללית עם 1.5-2% איזופלוראן ו 1 L / min של חמצן. אשר את ההשפלה על ידי צביטת בהונות והתבוננות בחיה מחוסר רפלקס.
4. מניחים את העכבר על כרית כירורגית מחוממת במהלך הניתוח. החל משחה וטרינרית על כל עין כאשר העכבר נמצא תחת הרדמה.
5. לחטא את האתר הכירורגי על ידי ניגוב האזור הכירורגי 3x עם 2% יוד, ואחריו 70% אלכוהול(שולחן החומרים).
6. בצע לפרוסטומיה עם מספריים מיקרו כדי ליצור 0.5-1 ס"מ ירידה.
7. לחשוף בעדינות את התריסריון ולאתר את צינור המרה המשותף באמצעות צמר גפן(שולחן החומרים).
8. הנח קליפ מיקרו המו ישר(שולחן חומרים)מעל הצינור המשותף הפרוקסימלי כדי למנוע את זרימת TNBS או פתרונות רכב לתוך הכבד וכיס המרה (איור 1A,B).
9. לחשוף בעדינות את התריסריון ולהכניס את המחט לתוך צינור הלבלב דרך הפפילה של ואטר.
10. לאחר המחט היא בתוך הצינור, למקם קליפ מיקרו המו מעוקל (שולחן החומרים) מעל התריסריון המקיף את המחט (איור 1A) כדי לאבטח את המחט במקום ולמנוע את הפתרון המוזרק מלהיכנס לתריסריון.
11. בהדרגה להחדיר את הפתרון (TNBS או רכב) לתוך צינור הלבלב במהלך דקה אחת.
    הערה: TNBS צריך להיות חדור לאט על פני דקה אחת של זמן, וזה קל לשלוט על מהירות העירוי כאשר הלבלב הוא perfused עם מזרק אינסולין עם מחט 5/16 אינץ 'ו 31G. שמור על היד יציבה ככל האפשר כדי למנוע דקירה צינור המרה. אם TNBS מוזרק בהצלחה, צבע צהוב עשוי להיות גלוי בתוך הלבלב.
12. לאחר עירוי, להסיר בזהירות את מהדק מיקרו ליד הכבד, ולאחר מכן להסיר את מהדק מיקרו מחזיק את המחט ואת התריסריון.
13. החזירו בזהירות את התריסריון למיקומו המקורי.
14. השאירו 0.5 מ"ל של תמיסת מלח סטרילית חמה (36-37 מעלות צלזיוס) בחלל הבטן לפני הסגירה, כדי לעזור לתריסריון לחזור למיקומו המקורי ולסייע בהתאוששות של פריסטלזיס.
15. סגור את החתירה בשכבת השריר באמצעות תפר רציף עם תפר 5-0. סגור את העור באמצעות תפר מופרע עם תפר 4-0.
16. מניחים את הכלוב המכיל עכברים על כרית חימום כדי לאפשר התאוששות מההרדמה.
17. אשר כי העכברים חמים ומסוגלים תנועה ספונטנית לפני החזרתם לחדר ההחזקה.
18. המשך לספק מכנס לשון (למשל, buprenorphine 0.1 מ"ג / קילוגרם i.p.) כל 12 שעות חום משלים עבור 48 שעות לאחר הניתוח.

3. ניטור התנהגות העכבר

1. הסר תפרים ביום 7 לאחר הניתוח.
2. נטר את בריאות העכבר ואת התנהגותו מדי יום במהלך השבוע הראשון לאחר הניתוח. צפה בסימני מצוקה כגון השמעה, תנוחת גב כפופה או ירידה בקטר. למדוד את משקל הגוף כל יומיים.
3. השתמש פון פרי monofilaments (VFFs) כדי למדוד רגישות יתר מכנית בטן לפני, ו 2, 3 שבועות לאחר הניתוח כמתואר^9,14.
   1. החל VFFs של כוחות מיושמים שונים בסדר עולה על אזור הבטן העליונה 10x כל 1-2 s. שקול את העלאת, נסיגה, או ליקוק הבטן (תגובת גמילה) כתגובה חיובית.
   2. החל גירוי חזק יותר אם לא נצפתה תגובה חיובית, וגירוי חלש יותר אם נצפתה תגובה חיובית. סף המשיכה הוא הכוח שבו העכבר מגיב 50% מהזמן.

4. איסוף וניתוח היסתולוגי של רקמת הלבלב

1. להקריב את העכברים תחת הרדמה על ידי נקע צוואר הרחם, בזהירות לנתח את הלבלב מן המעי ואיברים אחרים.
2. תקן את הלבלב ב 10% paraformaldehyde עבור 24 שעות, הטמעה פרפין, לחתוך קטעי רקמות של 5 מיקרומטר, ומניחים אותם על שקופיות זכוכית להכתמה.
3. בצע המטוקסילין-אאוזין, והכתמת טריכרום של מאסון בשיטות סטנדרטיות כפי שדווח בעבר⁴.

תוצאות

הליכי עירוי צינור המרה היו אופטימיזציה כדי להפחית את תמותת העכבר הקשורים להליך זה¹⁰. TNBS ניתן לראשונה בנפח כולל של 35 μL או 50 μL. הזרקת TNBS בנפח של 50 μL יכול להגיע הלבלב כולו ולעורר פנוטיפ מחלה הומוגנית יותר (איור 1B). בנוסף, הזרקת TNBS באמצעות מזרק אינסולין עם מחט 31G יכול ...

Discussion

עירוי צינור המרה של TNBS כדי לגרום דלקת לבלב כרונית הוא מאתגר מבחינה טכנית בעכברים, כמו עד 22.5% של עכברים יכולים למות בתוך 3-4 ימים של עירוי סמים¹⁰. כאן, דו"ח זה חידד את ההליך בהתבסס על מחקרים קודמים והפחית את תמותת העכברים המוקדמים ל -<10%. לדוגמה, נפח התרופה המוגבר (מ 35 μL ל 50μL) יכול להבט...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Neutral buffered formalin v/v	Fisher Scientific	23426796
Alcohol prep pads, sterile	Fisher Scientific	22-363-750
Animal Anesthesia system	VetEquip, Inc.	901806
Buprenorphine hydrochloride, injection	Par Sterile Products, LLC	NDC 42023-179-05
Centrifuge tubes, 15 mL	Fisher Scientific	0553859A
Ethanol, absolute (200 proof), molecular biology grade	Fisher Scientific	BP2818500
Extra fine Micro Dissecting scissors 4” straight sharp	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5882
Graefe forceps 4” extra delicate tip	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5136
Heated pad	Amazon	B07HMKMBKM
Hegar-Baumgartner Needle Holder 5.25”	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-7850
Insulin syringe with 31-gauge needle	BD	324909
Iodine prep pads	Fisher Scientific	19-027048
Isoflurane	Piramal Critical Care	NDC 66794-017-25
Micro clip applying forceps 5.5”	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5410
Micro clip, straight strong curved 1x6mm	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5433
Micro clip, straight, 0.75mm clip width	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5420
Picrylsulfonic acid solution, TNBS, 1M in H2O	Millipore Sigma	92822-1ML
Polypropylene Suture 4-0	Med-Vet International	MV-8683
Polypropylene Suture 5-0	Med-Vet International	MV-8661
Sodium chloride, 0.9% intravenous solution	VWR	2B1322Q
Surgical drape, sterile	Med-Vet International	DR1826
Tissue Cassette	Fisher Scientific	22-272416
Von Frey filaments	Bioseb	EB2-VFF