Modelo de cocultivo sin contacto para el estudio de la activación de células inmunes innatas durante la infección por virus respiratorios

Resumen

Este protocolo detalla una investigación de las interacciones tempranas entre las células epiteliales nasales infectadas viralmente y la activación de células innatas. Los subconjuntos individuales de células inmunes se pueden distinguir en función de su activación en respuesta a infecciones virales. Luego se pueden investigar más a fondo para determinar sus efectos sobre las respuestas antivirales tempranas.

Resumen

Las interacciones tempranas entre la capa epitelial nasal y las células inmunes innatas durante las infecciones virales siguen siendo un área poco explorada. La importancia de la señalización de la inmunidad innata en las infecciones virales ha aumentado sustancialmente a medida que los pacientes con infecciones respiratorias que exhiben una alta activación innata de las células T muestran un mejor resultado de la enfermedad. Por lo tanto, la disección de estas interacciones inmunes innatas tempranas permite la elucidación de los procesos que las gobiernan y puede facilitar el desarrollo de posibles dianas terapéuticas y estrategias para amortiguar o incluso prevenir la progresión temprana de las infecciones virales. Este protocolo detalla un modelo versátil que se puede utilizar para estudiar la diafonía temprana, las interacciones y la activación de las células inmunes innatas a partir de factores secretados por las células epiteliales de las vías respiratorias infectadas viralmente. Utilizando un virus de la influenza H3N2 (A/Aichi/2/1968) como modelo de virus representativo, la activación celular innata de células mononucleares de sangre periférica cocultivadas (PBMC) se ha analizado mediante citometría de flujo para investigar los subconjuntos de células que se activan por los factores solubles liberados del epitelio en respuesta a la infección viral. Los resultados demuestran la estrategia de gating para diferenciar los subconjuntos de células y revelan las claras diferencias entre las poblaciones activadas de PBMC y su diafonía con el epitelio control e infectado. Los subconjuntos activados se pueden analizar más a fondo para determinar sus funciones, así como los cambios moleculares específicos de las células. Los hallazgos de dicha investigación de diafonía pueden descubrir factores que son importantes para la activación de poblaciones vitales de células innatas, que son beneficiosos para controlar y suprimir la progresión de la infección viral. Además, estos factores se pueden aplicar universalmente a diferentes enfermedades virales, especialmente a los virus recién emergentes, para amortiguar el impacto de dichos virus cuando circulan por primera vez en poblaciones humanas ingenuas.

Introducción

Los virus respiratorios se encuentran quizás entre los patógenos más extendidos que causan una grave carga sanitaria y económica. Desde los brotes mundiales periódicos de cepas epidémicas emergentes (por ejemplo, H1N1, H5N1, H3N2, MERS, COVID-19) hasta las cepas estacionales de influenza cada año, los virus son una amenaza constante para la salud pública. Aunque las vacunas constituyen la mayor parte de la respuesta a estos desafíos de salud pública mundial, es aleccionador observar que estas contramedidas son simplemente receptivas ^1,2. Además, un retraso entre la aparición de una nueva cepa infecciosa y el desarrollo exitoso de su vacuna es inevitable³, lo que lleva a un período en el que las medidas disponibles para frenar la propagación del virus son muy limitadas.

Estos retrasos se enfatizan aún más por los costos que se infligen a la sociedad, económica y socialmente. Solo la gripe estacional es responsable de aproximadamente $ 8 mil millones en costos indirectos, $ 3.2 mil millones en costos médicos y 36.3 mil muertes en los Estados Unidos de América anualmente⁴. Esto es antes de considerar los costos de investigación que son necesarios para financiar el desarrollo de vacunas. Los brotes epidémicos tienen efectos aún más graves en la sociedad, agravados por la creciente tasa de globalización cada año, como lo demuestran las perturbaciones mundiales causadas por la aparición y rápida propagación del coronovirus del síndrome respiratorio agudo grave 2 (SARS-CoV-2)^5,6,7.

Estudios recientes han demostrado que los pacientes infectados que tienen una mayor población de células T innatas activadas tienden a tener un mejor resultado de la enfermedad ^8,9,10. Además, la población de células T innatas se clasifica en múltiples subgrupos: las células T invariantes asociadas a la mucosa (MAIT), las células T Vδ1 γδ, las células T Vδ2 γδ y las células T asesinas naturales (NKT). Estos subgrupos de células T innatas también exhiben heterogeneidad dentro de sus poblaciones, aumentando la complejidad de las interacciones entre las poblaciones celulares involucradas en la respuesta inmune innata¹¹. Por lo tanto, el mecanismo que activa estas células T innatas y el conocimiento de los subgrupos específicos de células T innatas pueden proporcionar una vía diferente de investigación para reducir los efectos infecciosos de estos virus en el huésped humano, especialmente durante el período de desarrollo de la vacuna.

Las células epiteliales infectadas por la influenza producen factores que activan rápidamente las células T innatas ^12,13,14. Sobre la base de ese hallazgo, este modelo de cocultivo de interfaz aire-líquido (ALI) sin contacto tiene como objetivo imitar las interacciones químicas tempranas (mediadas por factores solubles liberados por la capa epitelial infectada) entre la capa epitelial nasal infectada y los PBMC durante la infección temprana. La separación física entre la capa epitelial nasal (cultivada en insertos de membrana) y los PBMC (en la cámara inferior) y la integridad epitelial previenen la infección directa de los PBMC por el virus, lo que permite un estudio detallado de los efectos de los factores solubles derivados del epitelio en los PBMC. Por lo tanto, los factores identificados pueden investigarse más a fondo por su potencial terapéutico para inducir la población de células T innatas adecuada que puede proteger contra la infección por influenza. Por lo tanto, este artículo ha detallado los métodos para establecer un cocultivo para el estudio de la activación innata de células T a partir de factores solubles derivados del epitelio.

Protocolo

NOTA: Consulte la Tabla 1 para obtener recetas de los medios utilizados en este protocolo.
NOTA: Se ha encontrado que los hNECS cultivados en transwell de 12 pocillos crecen en un grosor más óptimo para que los factores solubles lleguen fácilmente a la cámara basal cuando se infectan con el virus de la influenza. Por lo tanto, se recomienda el uso de transwell de tamaño 12 pocillos para el cocultivo.

1. Establecimiento de la capa alimentadora 3T3

1. Establecimiento a partir de existencias congeladas
   1. Descongelar un criovial de fibroblastos NIH/3T3 de cepas congeladas. Agregue el contenido del criovial a 2 ml de Medios Esenciales Mínimos (DMEM) completos de Dulbecco y resuspenda las células.
   2. Centrifugar durante 5 min a 300 × g y temperatura/presión ambiente (rtp), y retirar el sobrenadante. Resuspend las células en DMEM completo.
   3. Cuente las células usando tinción azul tripano. Añadir 10 μL de azul de tripano a 10 μL de la suspensión celular resuspendida. Mezcle bien y agregue 10 μL de la suspensión a un hemocitómetro para contar las células.
   4. Células de semillas a una densidad de 1 × 10⁴ células/cm² en una placa de cultivo apropiada (por ejemplo, matraz T75). Incubar el matraz de cultivo resultante durante 3 días a 37 °C en una atmósfera de 5% de CO₂ .
2. Tratamiento con mitomicina C
   1. A los 3 días, asegúrese de que la confluencia sea del 60% al 80%, retire el medio y lave las células con 1 solución salina tamponada con fosfato (PBS).
      NOTA: Es importante que la capa alimentadora 3T3 no alcance la confluencia total; de lo contrario, el tratamiento con mitomicina C no será efectivo.
   2. Añadir DMEM completo suplementado con mitomicina C al matraz e incubar durante 3,5 h a 37 °C en una atmósfera de 5% de CO₂ . Retire el medio que contiene mitomicina C y lave las células 2 veces con 1x PBS.
3. Siembra de células 3T3 en placas de 6 pocillos
   1. Agregue 3 ml de 1x tripsina-EDTA al matraz durante 3-5 minutos para disociar las células. Recoja las células disociadas en un tubo fresco de 15 ml. Centrifugar el tubo de 15 ml durante 5 min a 300 × g, rtp; deseche el sobrenadante. Resuspend las células en DMEM completo.
   2. Cuente las células usando tinción azul tripano. Sembrar las células en una placa de 6 pocillos a 7.5 × 10 5-2.5 × 10⁶ células/pozo. Incubar la placa durante la noche a 37 °C en una atmósfera de 5% de CO₂.
      NOTA: La capa alimentadora 3T3 se considera lista si las células están sanas. En este punto, sembra las células madre/progenitoras epiteliales nasales humanas (hNESPC) en la capa alimentadora para su expansión.
   3. Agregue DMEM completo al matraz e incube a 37 ° C, 5% de CO² durante la noche para que las células 3T3 se recuperen del tratamiento con mitomicina C.

2. Establecimiento de un cultivo de células epiteliales nasales humanas (hNEC)

NOTA: Se deben obtener muestras clínicas de pacientes que estén libres de síntomas de infección del tracto respiratorio superior.

1. Procesamiento de tejido nasal en suspensión unicelular
   1. Lavar el tejido nasal en 1x PBS de Dulbecco (dPBS) (PBS sin Mg²⁺ y Ca²⁺) que contenga 100 μL/ml de una mezcla antibiótico-antimicótica. Cortar el tejido en pequeños fragmentos y tratar la muestra en 10 mg/ml de una proteasa neutra durante la noche a 4 °C con agitación.
   2. Centrifugar durante 5 min a 200 × g, y retirar el sobrenadante después de la centrifugación. Incubar el pellet en 1-2 mL de 1x tripsina-EDTA (37 °C, 15 min), y apagar añadiendo un volumen de suero fetal bovino igual al 10% del volumen en el tubo.
   3. Disociar mecánicamente el tejido digerido en agregados unicelulares mediante pipeteo, y luego pasar la suspensión resultante a través de un colador de células de 70 μm. Resuspend las células en DMEM completo.
      NOTA: Después de este paso, la suspensión celular es una mezcla de células diferenciadas terminalmente y células madre que se conocen como células madre /progenitoras epiteliales nasales humanas (hNESPC). El objetivo de los pasos posteriores es seleccionar y enriquecer la población hNESPC a partir de la mezcla de diferentes poblaciones celulares.
2. Siembra de una suspensión unicelular en la capa alimentadora 3T3 para la selección de hNESPC
   1. Centrifugar la suspensión celular del paso 2.1.3 (300 × g, 5 min, rtp) y retirar el sobrenadante. Resuspendir las células en 3-5 mL de medio 3.
      NOTA: El medio 3 está formulado para promover el crecimiento selectivo de los hNESPC.
   2. Cuente las células a través de la tinción azul tripano. Sembrar 1 x 10⁶ células en 2mL de medio 3 por pozo en una placa de 6 pocillos que contenga una capa alimentadora 3T3 preparada después de retirar el medio en la placa de 6 pocillos. Incubar el cocultivo resultante a 37 °C en una atmósfera de 5% de CO₂ .
      NOTA: Después de la siembra, tenga cuidado de no agitar la placa, ya que afectará la unión de los hNESPC.
   3. Cambie el medio 3 (2 ml) cada 2-4 días retirando el medio viejo por completo y reemplazándolo por medio fresco 3.
      NOTA: El medio se cambia para reponer los nutrientes y evitar que las condiciones demasiado ácidas influyan negativamente en el crecimiento de los hNESPC. El intervalo entre cada cambio de medio depende de qué tan ácido (amarillo) se vuelve el medio. Los intervalos deben acortarse si el medio se vuelve ácido rápidamente.
   4. Después de 7-10 días, observe que los hNESPC están en una confluencia adecuada para transferirlos a insertos de membrana. Ver Figura 1 para la morfología representativa de los hNESPC en 3 puntos de tiempo diferentes (2 días, 5 días y 10 días).
3. Transferencia de hNESPC a insertos de membrana
   NOTA: Debido al tratamiento con mitomicina C, la capa alimentadora 3T3 se degradará lentamente durante el período de expansión de hNESPC. Esto resultará en una adhesión debilitada a la superficie del pozo, permitiendo su desalojo mediante el lavado con una pipeta, dejando solo atrás las hNESPC saludables.
   1. Retire el medio y agregue 500 μL de 1x dPBS a cada pocillo. Enjuague las células 3x con una micropipeta para desalojar las células 3T3 y deseche el 1x dPBS. Observe bajo el microscopio que las hNESPC redondas permanecen mientras que la capa alimentadora 3T3 en forma de huso se desaloja.
   2. Agregue 500 μL de un reactivo de disociación celular por pozo e incube a 37 °C en una atmósfera de CO_{2 al} 5% durante 5-10 min, o hasta que los hNESPC se hayan desprendido de la superficie del pozo.
   3. Recoja la suspensión hNESPC, la centrífuga (300 × g, 5 min, rtp) y retire el sobrenadante.
   4. Resuspendir el pellet en medio 3. Cuente las células a través de la tinción azul tripano. Semilla 3 × 10⁴ células en 150 μL de medio 3 por inserto de membrana (placa de 24 pocillos) o 1 × 10⁵ células en 300 μL de medio 3 por inserto de membrana (placa de 12 pocillos) (Figura 2). Incubar las células a 37 °C en una atmósfera de 5% de CO₂ .
   5. Cambie el medio (medio 3) de las cámaras apical y basal cada 2 días. Navegue por la punta de una pipeta entre los brazos de soporte del inserto de membrana para acceder a la cámara basal, retire el medio antiguo y luego vuelva a introducir el medio fresco por el mismo método. Aunque la cámara apical es fácilmente accesible, tenga cuidado de no perturbar la capa de hNESPC en crecimiento.
      NOTA: No perturbe el medio en la cámara apical durante al menos 2 días después de la siembra, ya que las células necesitan tiempo para adherirse a la membrana.
4. Diferenciación de hNESPCs en hNECs
   1. Cuando los hNESPC alcancen el 100% de confluencia (aproximadamente 3-7 días desde la siembra en el inserto de membrana), comience el cultivo de ALI. Cambie el medio basal por medio de diferenciación y retire el medio de la cámara apical. Solo agregue medio a la cámara basal sin agregarlo a la cámara apical al cambiar el medio cada 2-3 días, como se indica en la Figura 3 y el paso 2.3.5.
      NOTA: El medio se cambia a medio de diferenciación para promover la diferenciación de los hNESPC en hNEC en ALI. Los hNESPC tardan aproximadamente 3-4 semanas en alcanzar la madurez completa para convertirse en hNEC en ALI, momento en el que las células habrían crecido en una multicapa con diferentes poblaciones de células en cada capa. Los cilios también deben observarse a un aumento de 400x (los cilios se pueden identificar por su movimiento de latido, lo que hace que el campo del microscopio parezca que está vibrando). En este punto, las células están listas para ser utilizadas para los experimentos de cocultivo. Consulte la Figura 4 para ver la sección transversal de una capa hNEC totalmente diferenciada.
   2. Después de obtener hNEC maduros, lave las células en la cámara apical 3x con 1x dPBS a intervalos de 2-3 días durante 1 semana antes del experimento de cocultivo. Sinergice el paso de lavado con los cambios del medio basal y realice los lavados de la siguiente manera.
      1. Añadir 50 μL (24 pocillos)/150 μL (12 pocillos) de 1x dPBS en la cámara apical del inserto de membrana, e incubar las células a 37 °C durante 10 min. Retire el dPBS después de 10 minutos de incubación para eliminar el moco acumulado y las células muertas en el transcurso de la diferenciación.
         NOTA: Dependiendo de la naturaleza del experimento, la solución de bicarbonato de sodio se puede utilizar para lavar la capa de moco por completo. Sin embargo, para la infección viral en experimentos de cocultivo, la capa de moco se retiene y solo se elimina el exceso de moco con el lavado de dPBS. Esta retención es para imitar la capa de moco fisiológico presente en los epitelios nasales que interactuarán con la infección viral entrante.

3. Medición de la resistencia eléctrica transepitelial (TEER)

NOTA: La confirmación de la integridad epitelial es importante para garantizar que se obtenga una capa epitelial intacta y saludable. Una capa epitelial intacta se determina a través de la medición TEER realizada en 4 pozos aleatorios utilizando un voltohmómetro.

1. Enjuague el electrodo con etanol al 70% y esterilícelo con luz ultravioleta durante 15 minutos antes de usarlo para garantizar la esterilidad. Enjuague con 1x dPBS después de la esterilización.
2. Agregue 100 μL (para 24 pocillos) o 300 μL (para 12 pocillos) de 1x dPBS a la cámara apical del inserto de membrana. Incubar la placa a 37 °C durante 10 min; a continuación, quite el dPBS.
3. Para cada pozo a medir, prepare un pozo no utilizado con 1 mL (para 24 pocillos) o 3 mL (para 12 pocillos) de medio de diferenciación precalentado (a 37 °C). Coloque el inserto de membrana en el pozo preparado y agregue 200 μL (para 24 pocillos) o 600 μL (para 12 pocillos) de medio de diferenciación precalentado a la cámara apical. Equilibrar a 37 °C (sujeto a la temperatura de incubación del tipo de virus añadido, por ejemplo, 35 °C para la gripe) durante 15 min.
   NOTA: Prepare un espacio en blanco (inserto de membrana vacío) de la misma manera para el cálculo del TEER.
4. Equilibre un tubo de 15 ml de medio de diferenciación precalentado a la misma temperatura durante 15 minutos también. Coloque los electrodos en el tubo de 15 ml y encienda el voltímetro.
   NOTA: En este punto, la lectura debe ser de 0 resistencia, ya que los electrodos están en el mismo medio. Si se obtiene cualquier otra lectura, equilibre el electrodo en el tubo de 15 ml hasta que la lectura sea 0.
5. A partir del espacio en blanco, coloque los electrodos en cada pozo de tal manera que un electrodo esté sumergido en el medio de la cámara apical y el otro en el medio de la cámara basal. Registre la lectura solo cuando se obtenga una lectura constante durante un período de al menos 5 minutos.
6. Después de cada medición, lave el electrodo con PBS antes de la siguiente medición. Para cada pozo probado, tome medidas para tres muestras en diferentes posiciones de la membrana. Para calcular el TEER neto de cada muestra, reste la resistencia de fondo, dada por el inserto de membrana en blanco, de cada medición.
7. Calcule la lectura total de TEER para un pozo utilizando la siguiente ecuación:
   Integridad epitelial (Ωcm²) = TEER neto (ohmios) × Área de membrana (cm²)
   NOTA: Los valores TEER de los hNEC para experimentos de infección viral deben ser >1000 Ωcm² 13,15,16. 

4. Aislamiento de monocitos de sangre periférica y células NK

NOTA: Las muestras de sangre deben obtenerse de voluntarios sanos y usarse el mismo día del aislamiento.

1. Recolectar 30-40 ml de sangre total de cada donante en tubos de recolección de sangre de 10 ml.
2. Aísle los PBMC mediante centrifugación por gradiente de densidad y obtenga PBMC de la capa buffy después de los siguientes pasos (consulte también la Tabla de materiales).
   1. Mezcle bien ~ 10 ml de sangre del tubo de recolección de sangre en un vacutainer antes de diluir con un volumen igual de solución salina equilibrada (PBS).
   2. Agregue 15 ml de medio de gradiente de densidad a la base de un tubo de 50 ml.
      NOTA: La relación entre el medio de gradiente de densidad y la sangre diluida debe ser de 2: 3-3.5.
   3. Capa 35 ml de sangre diluida en el medio de gradiente de densidad con una pistola de pipeta (con el ajuste de dispensación ajustado al más bajo posible) inclinando el tubo 45 ° y permitiendo que la sangre diluida caiga gota a gota sobre la pared interna del tubo para que la capa de medio de gradiente de densidad no se altere.
   4. Lisado centrífugo a 500 × g, 18-20 °C durante 30 min (freno: apagado). Retire y deseche cuidadosamente la capa de plasma superior sin perturbar la capa inferior.
   5. Transfiera la capa buffy a un nuevo tubo sin mezclar la capa de glóbulos rojos, la capa media de densidad de gradiente o la capa buffy. Una vez que la capa buffy se haya recogido en un nuevo tubo de 50 ml, rellene el volumen a 50 ml con 1x PBS.
   6. Lisar centrifugar a 800 × g, 18-20 °C, 8 min (freno: apagado), y retirar el sobrenadante con una pistola pipeta. Resuspendir el pellet celular con 50 mL de 1x PBS, y centrifugar a 120 × g, 18-20 °C, 10 min para eliminar las plaquetas.
   7. Deseche el sobrenadante mediante pipeteo, sin perturbar la bolita celular.
      NOTA: Como el pellet celular puede estar suelto, no es aconsejable desechar el sobrenadante vertiendo.
   8. Resuspend el pellet celular con medio RPMI (Roswell Park Memorial Institute) completo. Realice un recuento celular agregando 10 μL de ácido acético al 3% con azul de metileno a 10 μL de la suspensión celular resuspendida. Mezcle bien y agregue 10 μL de la mezcla a un hemocitómetro para contar las células.
3. Diluir PBMC con medio RPMI completo a una densidad de 2 × 10⁶/mL (para 24 pocillos) o 4 × 10⁶/ml (para 12 pocillos).

5. hNEC Infección viral y transición a hNEC:PBMC cocultivo

NOTA: El H3N2 (A/Aichi/2/1968) se utiliza como cepa representativa de la infección en este protocolo. La multiplicidad de infección (MOI) de 0.1 se utiliza como MOI representativo en este protocolo.

1. Día 0 (Infección de hNECs)
   NOTA: Se utiliza un pocillo de los hNEC cultivados a partir del mismo donante para obtener un recuento de células representativo por cada pozo utilizado en el experimento.
   1. En el pozo representativo, agregue 150 μL de 1x tripsina-EDTA a la cámara apical del inserto de membrana y 350 μL de 1x tripsina-EDTA a la cámara basal, e incube a 37 °C durante 10 min, o hasta que las células se desprendan de la membrana.
   2. Enjuague las células de la membrana mediante el pipeteo hacia arriba y hacia abajo, y recoja la suspensión en un tubo centrífugo de 1,5 ml. Agregue 200 μL de DMEM completo para apagar la actividad de tripsina. Contar las células mediante tinción azul tripano para obtener el recuento de células por pozo.
   3. Calcule el MOI requerido del virus en función del recuento de células por pozo y diluya el stock de virus en consecuencia con RPMI completo en hielo.
      NOTA: MOI 0.1 de 1.26 × 10⁶ hNEC por pozo = 1.26 × 10⁵ partículas virales H3N2 por pozo en 30 μL (para 24 pocillos)/100 μL (para 12 pocillos)
   4. Para los pocillos restantes para el experimento de infección, agregue 50 μL (para 24 pocillos)/150 μL (para 12 pocillos) de 1x dPBS en las cámaras apicales de los insertos de membrana, incube a 37 °C durante 10 min y retire el 1x dPBS.
   5. Cambie el medio basal en los insertos de membrana a un medio RPMI completo transfiriendo los insertos a una nueva placa con RPMI completo agregado a los pozos (350 μL (para 24 pocillos)/700 μL (para 12 pocillos)).
      NOTA: Cuando los hNESPC se han diferenciado completamente de los hNEC, son tolerantes/permisivos a diferentes medios durante un máximo de 72 h, sin cambios en la morfología u organización cuando el medio se cambia a RPMI¹². RPMI se utiliza para apoyar el crecimiento y mantenimiento de la población de PBMC.
   6. Agregue los 30 μL preparados (para 24 pocillos)/100 μL (para 12 pocillos) del inóculo del virus en la cámara apical del inserto de membrana, incube a 35 °C en una atmósfera de 5% de CO₂ durante 1 h y retire el inóculo viral de la cámara apical.
   7. Cambie el medio basal del inserto de membrana a un medio RPMI completo fresco e incube a 35 °C en una atmósfera de 5% de CO₂ durante 24 h.
2. Día 1 (establecimiento de cocultivos hNEC + PBMC)
   1. Sembrar el número requerido de PBMC en 150 μL (para 24 pocillos)/300 μL (para 12 pocillos) de medio RPMI completo agregando directamente la suspensión de PBMC en la cámara basal de cada pocillo de hNEC no infectados o infectados a partir del Día 0 (1.5 × 10 6 para placas^de 24 pocillos y 3 × 10⁶ para placas de 12 pocillos). Incubar a 37 °C durante 24/48 h.
      NOTA: El volumen final en la cámara basal después del establecimiento del cocultivo es de 500 μL (para 24 pocillos)/1000 μL (para 12 pocillos).
3. Días 2-3 (recolección de PBMCs 48/72 h post-infección viral)
   1. Recolección de sobrenadantes apicales (48/72 h post-infección viral)
      1. Añadir 50 μL (para 24 pocillos)/150 μL (para 12 pocillos) de 1x dPBS a cada cámara apical, e incubar a 37 °C durante 10 min. Recoja el 1x dPBS en tubos de 1,5 ml. Alícuota 25 μL (para 24 pocillos)/50 μL (para 12 pocillos) del sobrenadante para ensayo de placa en un nuevo tubo de 1,5 ml, y congelar inmediatamente tanto la cepa como las alícuotas a -80 °C.
   2. Recolección de ARN celular de hNEC (48/72 h de infección post-viral)
      1. Transfiera el inserto de membrana a un pozo limpio, agregue 300 μL (para 24 pocillos)/600 μL (para 12 pocillos) de tampón de lisis de ARN a la cámara apical e incube a rtp durante 5 min. Recoger el sobrenadante en un tubo centrífugo de 1,5 ml y almacenarlo a -80 °C hasta la extracción de ARN para su análisis molecular.
   3. Recolección de PBMCs (48/72 h post-infección viral)
      1. Con la base ancha de una punta de pipeta estéril, raspe suavemente la superficie del pozo para desalojar los PBMC activados que pueden estar adheridos a la superficie del pozo. Recoja el medio basal que contiene PBMC en un tubo centrífugo de 2 ml.
      2. Enjuague los pocillos 2x con 300 μL de 1x dPBS, y recoja el lavado en el mismo tubo de 2 mL. Centrifugue el tubo de 2 ml (500 × g, 5 min, rtp) y recoja el sobrenadante en un tubo fresco de 2 ml sin molestar la bolita celular. Almacenar el sobrenadante a -80 °C para el análisis de citoquinas y quimiocinas; resuspendir el pellet celular en 200 μL de 1x dPBS.

6. Citometría de flujo

NOTA: Esta sección del protocolo se continúa directamente desde la sección anterior utilizando la suspensión de celdas PBMC del paso 5.3.3.2. Asegúrese de una exposición mínima a la luz durante los siguientes pasos de esta sección. En la Tabla 2 se puede encontrar un panel de muestra de marcadores de tinción superficial.

1. Tinción superficial
   1. Transfiera el pellet de célula PBMC resuspendido a una placa de pozo inferior de 96 V. Centrifuga lisar a 800 × g durante 3 min, y retirar el sobrenadante.
   2. Incubar todos los PBMC (excepto los "no manchados") con 100 μL de una tinción de viabilidad durante 15 min a rtp. Recargue hasta 200 μL con 150 μL de búfer de clasificación celular activada magnéticamente (MACS). Centrifuga lisar a 800 × g durante 3 min, y desechar el sobrenadante.
   3. Preparar un panel de anticuerpos de tinción superficial de interés con ratios de dilución adecuados y un volumen final de 50 μL por reacción (recarga con tampón MACS para obtener el volumen final). Realice la tinción superficial agregando 50 μL de la mezcla de anticuerpos preparada a las células utilizando una pipeta multicanal. Incubar a 4 °C durante 15 min en la oscuridad.
   4. Lavar añadiendo 150 μL de tampón MACS. Centrifuga lisar a 800 × g durante 3 min, y desechar el sobrenadante. Si no se requiere tinción intracelular, proceda directamente a la incubación de 15 minutos en el paso 6.3.
2. Tinción intracelular (si es necesario)
   1. Añadir 100 μL de una solución de fijación y permeabilización a cada pocillo. Incubar a 4 °C durante 20 min en la oscuridad. Rellene los pozos con 100 μL de 1x búfer MACS.
   2. Centrifugar (800 × g, 3 min, 25 °C), y retirar el sobrenadante. Repita el lavado agregando 200 μL de tampón de lavado de permeabilización 1x. Centrifugar (500 × g, 3 min, 25 °C), y retirar el sobrenadante.
   3. Preparar las diluciones para el panel de anticuerpos de interés para lograr un volumen final de 50 μL utilizando 1x tampón de lavado de permeabilización. Incubar en hielo durante 30 minutos en la oscuridad. Añadir 200 μL de tampón de lavado de permeabilización 1x.
   4. Centrifugar las células (800 × g, 3 min, 4 °C) y retirar el sobrenadante. Resuspend las células en 100 μL de tampón de clasificación celular activado por fluorescencia.
3. Pipetear 200 μL de una solución de lisado en cada pozo. Incubar durante 15 min a rtp. Centrifuga lisar a 800 × g durante 3 min y desechar el sobrenadante.
4. Resuspendir los gránulos celulares en 200 μL de tampón MACS. Realice citometría de flujo de acuerdo con los ajustes descritos anteriormente¹³, o guárdelo a 4 °C en la oscuridad.

7. Determinación de los niveles de citoquinas y quimiocinas

1. Procesar 25 μL del sobrenadante de cámara basal utilizando un ensayo multiplex de inmunología de acuerdo con el protocolo del fabricante¹⁸.
2. Calcule la concentración de cada analito utilizando el software multiplex manager utilizando un algoritmo de ajuste de curvas (5 parámetros) para la curva estándar.

8. Evaluación de la contaminación viral

1. Extraer ARN viral utilizando un kit de extracción en 4 juegos de soluciones: la solución H3N2 madre, la dilución MOI 0.1 para la infección, las diluciones en serie 10x del MOI 0.1 y el medio basal de las muestras (infección post-viral de 48 y 72 h)¹².
2. Seleccionar el gen no estructural (NS1) y la matriz (M1) como objetivos para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (consulte la Tabla de materiales para los cebadores utilizados en el experimento representativo).
3. Realizar PCR de transcripción inversa (RT-PCR) (42 °C, 60 min) para convertir el ARN viral en ADNc antes de realizar PCR cuantitativa (qPCR) para medir los niveles de NS1 y M1 como proxy de la presencia viral, y correlacionar los niveles con la curva estándar obtenida de la RT-qPCR realizada en la dilución en serie 10x de la alícuota MOI 0.1. Consulte la Tabla 3 para la composición de las mezclas de reacción y utilice las siguientes condiciones: preincubación a 95 °C durante 10 min, seguida de una amplificación en 3 pasos durante 40 ciclos: 95 °C durante 10 s, 60 °C durante 10 s, 72 °C durante 30 s; curva de fusión: 95 °C durante 10 s, 65 °C durante 60 s y 97 °C durante 1 s.

9. Ensayo de placa

1. Día 0: siembra MDCK (Riñón Canino Madin Darby) en placas de 24 pocillos
   1. Retire el medio de un matraz T75 de células MDCK confluentes. Lave 2x con 1x PBS para eliminar todos los rastros de suero. Tripsinizar las células MDCK añadiendo 10 ml de tripsina e incubando a 37 °C en una atmósfera de 5% de CO₂ durante 20-30 min hasta que las células se desprendan.
      NOTA: No toque el matraz, ya que esto podría provocar aglomeraciones.
   2. Pipetear la suspensión celular en un tubo de 15 ml que contenga 2 ml de medio esencial mínimo (EMEM) completo de Eagle. Centrifugar (300 × g, 5 min, rtp), y retirar el sobrenadante.
   3. Resuspend las células en 6 mL de EMEM completo. Cuente las células por tinción azul tripano.
   4. Diluir la suspensión de células MDCK a una concentración de 1 × 10⁵ células/ml, y sembrar 1 ml de la suspensión diluida en cada pocillo de una placa estéril de 24 pocillos. Incubar a 37 °C en una atmósfera de CO_{2 al} 5% durante 24 h para obtener una monocapa confluente de células MDCK en cada pozo.
2. Día 1: infección de células MDCK
   1. Prepare el medio de infección. Retire el medio de la monocapa MDCK en la placa de 24 pocillos y lave 2x con 1x dPBS. Para el segundo lavado, deje el PBS en los pozos mientras prepara diluciones en serie del virus.
   2. Descongele las muestras de virus en hielo y diluya en serie en una placa de 24 pocillos para lograr diluciones en serie de ^10-1 a ^10-6.
      NOTA: Como ejemplo, llene cada pozo en una placa de 24 pocillos con 270 μL de medio de infección.
   3. Agregue 30 μL de la muestra del virus al primer pozo de la fila. Con una nueva punta de pipeta, mezcle bien y transfiera al siguiente pozo de la fila para diluir la muestra 10 veces. Proceda hasta que se haya logrado una dilución ^{de 10-6} ; realice los pasos 9.2.1-9.2.3 para todas las muestras de virus.
   4. Retire el PBS de la placa MDCK e infecte por duplicado con 100 μL de las diluciones virales preparadas. Para los pocillos de control, agregue 100 μL del medio de infección (sin la muestra viral). Incubar a 35 °C en una atmósfera de 5% de CO₂ durante 1 h, agitando la placa para eliminar las manchas secas cada 15 min.
   5. Retire el inóculo viral y agregue 1 ml de superposición líquida para cada pocillo. Incubar a 35 °C en una atmósfera de CO_{2 al} 5% durante 72 h.
3. Día 4 (72 h post-infección): visualización de la placa
   1. Retire la capa líquida y fije las células con formaldehído al 4% en 1x PBS durante 1 h. Retire la solución de formaldehído y lave una vez con 1 pbS o agua destilada.
   2. Secuñera las células fijas agregando una solución violeta de cristal al 1% durante 15 min. Retire el tinte violeta cristalino y lave las células con agua corriente. Secar la placa a rtp.
   3. Una vez seco, cuente las placas y calcule el título viral de acuerdo con la siguiente fórmula:
      Número de placas × factor de dilución = Número de placa - Unidades formadoras en 100 μL

Resultados

Aunque las células T convencionales forman el repertorio principal de respuesta inmune adaptativa contra la infección viral para facilitar el aclaramiento viral, la población de células T innatas trabaja en un espectro más amplio para suprimir la carga viral para una eliminación efectiva en una etapa posterior. Por lo tanto, este protocolo crea específicamente una condición robusta para estudiar las células T innatas, su activación y su población funcional después de la infecc...

Discusión

Las respuestas inmunes innatas contra los virus son un campo de estudio poco investigado en el manejo de antivirales. Las células epiteliales de las vías respiratorias y las células inmunes innatas trabajan en conjunto para suprimir la replicación viral durante una infección, además de servir como determinante de la respuesta adaptativa hiperactiva si la carga viral no se mantiene bajo control 12,13,17. Sin embargo, el des...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5% Trypsin-EDTA	Gibco	15400-054
0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), pH 8.0, RNase-free	Thermofisher	AM9260G	0.5M EDTA
1.5 mL SafeLock Tubes	Eppendorf	0030120086	1.5mL Centrifuge Tube
10 mL K3EDTA Vacutainer Tubes	BD	366643	10mL Blood Collection Tubes
10x dPBS	Gibco	14200-075
10x PBS	Vivantis	PC0711
12-well Plate	Corning	3513
12-well Transwell Insert	Corning	3460	membrane insert
1x FACS Lysing Solution	BD	349202
2.0 mL SafeLock Tubes	Eppendorf	0030120094	2 mL centrifuge tube
24-well Plate	Corning	3524
24-well Transwell Insert	Corning	3470
3% Acetic Acid with Methylene Blue	STEMCELL Technologies	07060
3,3',5-triiodo-l-thyronine	Sigma	T-074
37% Formaldehyde Solution w 15% Methanol as Stabilizer in H2O	Sigma	533998
5810R Centrifuge	Eppendorf	5811000320
5 mL polypropylene tubes (flow tubes)	BD	352058
70 µm Cell Strainer	Corning	431751
A-4-62 Rotor	Eppendorf	5810709008
Accutase	Gibco	A1110501	Cell Dissociation Reagent
Antibiotic-Antimycotic	Gibco	15240-062
Avicel CL-611	FMC Biopolymer	NA	Liquid Overlay
Bio-Plex Manager 6.2 Standard Software	Bio-Rad Laboratories, Inc	171STND01	Multiplex Manager Software
Butterfly Needle 21 G	BD	367287
Cholera Toxin	Sigma	C8052
Crystal Violet	Merck	C6158
Cytofix/Cytoperm Solution	BD	554722	Fixation and Permeabilization Solution
Dispase II	Sigma	D4693	Neutral Protease
DMEM/High Glucose	GE Healthcare Life Sciences	SH30243.01
DMEM/Nutrient Mixture F-12	Gibco-Invitrogen	11320033
dNTP Mix	Promega	U1515	dNTP Mix
EMEM (w L-Glutamine)	ATCC	30-2003
EVOM voltohmmeter device	WPI, Sarasota, FL, USA	300523
FACS Lysing Solution	BD	349202	1x Lysing Solution
Falcon tube 15 mL	CellStar	188271	15 mL tube
Falcon tube 50 mL	CellStar	227261	50 mL Tube
Fast Start Essential DNA Probes Master	Roche	6402682001	qPCR Master Mix
Ficoll Paque Premium	Research Instruments	17544203	Density Gradient Media
H3N2 (A/Aichi/2/1968)	ATCC	VR547
H3N2 M1 Forward Primer Sequence	Sigma	5'- ATGGTTCTGGCCAGCACTAC-3'
H3N2 M1 Reverse Primer Sequence	Sigma	5'- ATCTGCACCCCCATTCGTTT-3'
H3N2 NS1 Forward Primer Sequence	Sigma	5'- ACCCGTGTTGGAAAGCAGAT-3'
H3N2 NS1 Reverse Primer Sequence	Sigma	5'- CCTCTTCGGTGAAAGCCCTT-3'
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum	Gibco	10500-064
hNESPCs	Human Donors	NA
Human Epithelial Growth Factor	Gibco-Invitrogen	PHG0314
Hydrocortisone	STEMCELL Techonologies	7925	Collected from nasal biopsies during septal deviation surgeries
Insulin	Sigma	I3536
Lightcycler 96	Roche	5815916001	qPCR Instrument
Live/DEAD Blue Cell Stain Kit *for UV Excitation	Thermofisher	L23105	Viability Stain
MILLIPLEX MAP Human Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel II - Premixed 23 Plex	Merck Pte Ltd	HCP2MAG-62K-PX23	Immunology Multiplex Assay
Mitomycin C	Sigma	M4287
M-MLV 5x Buffer	Promega	M1705	RT-PCR 5x Buffer
M-MLV Reverse Transcriptase	Promega	M1706	Reverse Transcriptase
N-2 supplement	Gibco-Invitrogen	17502-048
NIH/3T3	ATCC	CRL1658
Perm/Wash Buffer	BD	554723	Permeabilization Wash Buffer
PneumaCult-ALI 10x Supplement	STEMCELL Techonologies	5001
PneumaCult-ALI Basal Medium	STEMCELL Techonologies	5001
PneumaCult-ALI Maintenance Supplement (100x)	STEMCELL Techonologies	5001
Random Primers	Promega	C1181	Random Primers
Recombinant Rnasin Rnase Inhibitor	Promega	N2511	RNase Inhibitor
RNA Lysis Buffer	Qiagen	Part of 52904
RPMI 1640 (w L-Glutamine)	ATCC	30-2001
STX2 electrodes	WPI, Sarasota, FL, USA	STX2	Electrode
T25 Flask	Corning	430639
T75 Flask	Corning	430641U
TPCK Trypsin	Sigma	T1426
Trypan Blue	Hyclone	SV30084.01
Viral RNA Extraction Kit	Qiagen	52904	Viral RNA Extraction Kit
V-Shaped 96-well Plate	Corning	3894