Бесконтактная модель кокультуры для изучения активации врожденных иммунных клеток во время респираторной вирусной инфекции

Резюме

Этот протокол подробно описывает исследование ранних взаимодействий между вирусно инфицированными эпителиальными клетками носа и активацией врожденных клеток. Отдельные подмножества иммунных клеток можно выделить на основе их активации в ответ на вирусные инфекции. Затем они могут быть дополнительно исследованы, чтобы определить их влияние на ранние противовирусные реакции.

Аннотация

Ранние взаимодействия между эпителиальным слоем носа и врожденными иммунными клетками во время вирусных инфекций остаются недостаточно изученной областью. Значение передачи сигналов врожденного иммунитета при вирусных инфекциях значительно возросло, поскольку пациенты с респираторными инфекциями, которые демонстрируют высокую врожденную активацию Т-клеток, показывают лучший исход заболевания. Следовательно, препарирование этих ранних врожденных иммунных взаимодействий позволяет прояснить процессы, которые ими управляют, и может способствовать разработке потенциальных терапевтических целей и стратегий для ослабления или даже предотвращения раннего прогрессирования вирусных инфекций. Этот протокол детализирует универсальную модель, которая может быть использована для изучения ранних перекрестных помех, взаимодействий и активации врожденных иммунных клеток из факторов, секретируемых вирусно инфицированными эпителиальными клетками дыхательных путей. Используя вирус гриппа H3N2 (A/Aichi/2/1968) в качестве репрезентативной модели вируса, врожденная клеточная активация совместно культивируемых мононуклеарных клеток периферической крови (PBMCs) была проанализирована с использованием проточной цитометрии для исследования подмножеств клеток, которые активируются растворимыми факторами, высвобождаемыми из эпителия в ответ на вирусную инфекцию. Результаты демонстрируют стратегию дифференциации подмножеств клеток и выявляют четкие различия между активированными популяциями PBMCs и их перекрестными помехами с контрольным и инфицированным эпителием. Затем активированные подмножества могут быть дополнительно проанализированы для определения их функций, а также молекулярных изменений, специфичных для клеток. Результаты такого перекрестного исследования могут выявить факторы, которые важны для активации жизненно важных врожденных клеточных популяций, которые полезны для контроля и подавления прогрессирования вирусной инфекции. Кроме того, эти факторы могут быть повсеместно применены к различным вирусным заболеваниям, особенно к вновь возникающим вирусам, чтобы ослабить воздействие таких вирусов, когда они впервые циркулируют в наивных человеческих популяциях.

Введение

Респираторные вирусы, пожалуй, являются одними из наиболее распространенных патогенов, вызывающих серьезное медицинское и экономическое бремя. От периодических глобальных вспышек новых эпидемических штаммов (например, H1N1, H5N1, H3N2, MERS, COVID-19) до сезонных штаммов гриппа каждый год, вирусы представляют постоянную угрозу для здоровья населения. Хотя вакцины составляют основную часть ответных мер на эти глобальные проблемы общественного здравоохранения, отрезвляюще отметить, что эти контрмеры являются просто ответными ^1,2. Кроме того, задержка между появлением нового инфекционного штамма и успешной разраб....

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Рецепты носителей, используемых в этом протоколе, приведены в Таблице 1 .
ПРИМЕЧАНИЕ: было обнаружено, что hNECS, выращенные на 12-луночной трансвелле, вырастают в более оптимальную толщину для того, чтобы растворимые факторы легко достигали базальной камеры при заражении вирусом гриппа. Поэтому рекомендуется использовать 12-луночный трансвеллер для совместной культивирования.

1. Установка фидерного слоя 3Т3

1. Создание из замороженных запасов
   1. Разморозить криовиал фибробластов NIH/3T3 из замороженных запасов. Добавьте содержимое криовиала в 2 мл полной минимальной существенной среды Dulbecco (D....

Результаты

Хотя обычные Т-клетки образуют основной репертуар адаптивного иммунного ответа против вирусной инфекции для облегчения вирусного клиренса, врожденная популяция Т-клеток работает по всему более широкому спектру, чтобы подавить вирусную нагрузку для эффективного кли.......

Обсуждение

Врожденные иммунные реакции против вирусов являются недостаточно изученной областью исследований в области противовирусного лечения. Эпителиальные клетки дыхательных путей и врожденные иммунные клетки работают согласованно, чтобы подавить репликацию вируса во время инфекции, поми.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5% Trypsin-EDTA	Gibco	15400-054
0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), pH 8.0, RNase-free	Thermofisher	AM9260G	0.5M EDTA
1.5 mL SafeLock Tubes	Eppendorf	0030120086	1.5mL Centrifuge Tube
10 mL K3EDTA Vacutainer Tubes	BD	366643	10mL Blood Collection Tubes
10x dPBS	Gibco	14200-075
10x PBS	Vivantis	PC0711
12-well Plate	Corning	3513
12-well Transwell Insert	Corning	3460	membrane insert
1x FACS Lysing Solution	BD	349202
2.0 mL SafeLock Tubes	Eppendorf	0030120094	2 mL centrifuge tube
24-well Plate	Corning	3524
24-well Transwell Insert	Corning	3470
3% Acetic Acid with Methylene Blue	STEMCELL Technologies	07060
3,3',5-triiodo-l-thyronine	Sigma	T-074
37% Formaldehyde Solution w 15% Methanol as Stabilizer in H2O	Sigma	533998
5810R Centrifuge	Eppendorf	5811000320
5 mL polypropylene tubes (flow tubes)	BD	352058
70 µm Cell Strainer	Corning	431751
A-4-62 Rotor	Eppendorf	5810709008
Accutase	Gibco	A1110501	Cell Dissociation Reagent
Antibiotic-Antimycotic	Gibco	15240-062
Avicel CL-611	FMC Biopolymer	NA	Liquid Overlay
Bio-Plex Manager 6.2 Standard Software	Bio-Rad Laboratories, Inc	171STND01	Multiplex Manager Software
Butterfly Needle 21 G	BD	367287
Cholera Toxin	Sigma	C8052
Crystal Violet	Merck	C6158
Cytofix/Cytoperm Solution	BD	554722	Fixation and Permeabilization Solution
Dispase II	Sigma	D4693	Neutral Protease
DMEM/High Glucose	GE Healthcare Life Sciences	SH30243.01
DMEM/Nutrient Mixture F-12	Gibco-Invitrogen	11320033
dNTP Mix	Promega	U1515	dNTP Mix
EMEM (w L-Glutamine)	ATCC	30-2003
EVOM voltohmmeter device	WPI, Sarasota, FL, USA	300523
FACS Lysing Solution	BD	349202	1x Lysing Solution
Falcon tube 15 mL	CellStar	188271	15 mL tube
Falcon tube 50 mL	CellStar	227261	50 mL Tube
Fast Start Essential DNA Probes Master	Roche	6402682001	qPCR Master Mix
Ficoll Paque Premium	Research Instruments	17544203	Density Gradient Media
H3N2 (A/Aichi/2/1968)	ATCC	VR547
H3N2 M1 Forward Primer Sequence	Sigma	5'- ATGGTTCTGGCCAGCACTAC-3'
H3N2 M1 Reverse Primer Sequence	Sigma	5'- ATCTGCACCCCCATTCGTTT-3'
H3N2 NS1 Forward Primer Sequence	Sigma	5'- ACCCGTGTTGGAAAGCAGAT-3'
H3N2 NS1 Reverse Primer Sequence	Sigma	5'- CCTCTTCGGTGAAAGCCCTT-3'
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum	Gibco	10500-064
hNESPCs	Human Donors	NA
Human Epithelial Growth Factor	Gibco-Invitrogen	PHG0314
Hydrocortisone	STEMCELL Techonologies	7925	Collected from nasal biopsies during septal deviation surgeries
Insulin	Sigma	I3536
Lightcycler 96	Roche	5815916001	qPCR Instrument
Live/DEAD Blue Cell Stain Kit *for UV Excitation	Thermofisher	L23105	Viability Stain
MILLIPLEX MAP Human Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel II - Premixed 23 Plex	Merck Pte Ltd	HCP2MAG-62K-PX23	Immunology Multiplex Assay
Mitomycin C	Sigma	M4287
M-MLV 5x Buffer	Promega	M1705	RT-PCR 5x Buffer
M-MLV Reverse Transcriptase	Promega	M1706	Reverse Transcriptase
N-2 supplement	Gibco-Invitrogen	17502-048
NIH/3T3	ATCC	CRL1658
Perm/Wash Buffer	BD	554723	Permeabilization Wash Buffer
PneumaCult-ALI 10x Supplement	STEMCELL Techonologies	5001
PneumaCult-ALI Basal Medium	STEMCELL Techonologies	5001
PneumaCult-ALI Maintenance Supplement (100x)	STEMCELL Techonologies	5001
Random Primers	Promega	C1181	Random Primers
Recombinant Rnasin Rnase Inhibitor	Promega	N2511	RNase Inhibitor
RNA Lysis Buffer	Qiagen	Part of 52904
RPMI 1640 (w L-Glutamine)	ATCC	30-2001
STX2 electrodes	WPI, Sarasota, FL, USA	STX2	Electrode
T25 Flask	Corning	430639
T75 Flask	Corning	430641U
TPCK Trypsin	Sigma	T1426
Trypan Blue	Hyclone	SV30084.01
Viral RNA Extraction Kit	Qiagen	52904	Viral RNA Extraction Kit
V-Shaped 96-well Plate	Corning	3894