JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Этот протокол подробно описывает исследование ранних взаимодействий между вирусно инфицированными эпителиальными клетками носа и активацией врожденных клеток. Отдельные подмножества иммунных клеток можно выделить на основе их активации в ответ на вирусные инфекции. Затем они могут быть дополнительно исследованы, чтобы определить их влияние на ранние противовирусные реакции.

Аннотация

Ранние взаимодействия между эпителиальным слоем носа и врожденными иммунными клетками во время вирусных инфекций остаются недостаточно изученной областью. Значение передачи сигналов врожденного иммунитета при вирусных инфекциях значительно возросло, поскольку пациенты с респираторными инфекциями, которые демонстрируют высокую врожденную активацию Т-клеток, показывают лучший исход заболевания. Следовательно, препарирование этих ранних врожденных иммунных взаимодействий позволяет прояснить процессы, которые ими управляют, и может способствовать разработке потенциальных терапевтических целей и стратегий для ослабления или даже предотвращения раннего прогрессирования вирусных инфекций. Этот протокол детализирует универсальную модель, которая может быть использована для изучения ранних перекрестных помех, взаимодействий и активации врожденных иммунных клеток из факторов, секретируемых вирусно инфицированными эпителиальными клетками дыхательных путей. Используя вирус гриппа H3N2 (A/Aichi/2/1968) в качестве репрезентативной модели вируса, врожденная клеточная активация совместно культивируемых мононуклеарных клеток периферической крови (PBMCs) была проанализирована с использованием проточной цитометрии для исследования подмножеств клеток, которые активируются растворимыми факторами, высвобождаемыми из эпителия в ответ на вирусную инфекцию. Результаты демонстрируют стратегию дифференциации подмножеств клеток и выявляют четкие различия между активированными популяциями PBMCs и их перекрестными помехами с контрольным и инфицированным эпителием. Затем активированные подмножества могут быть дополнительно проанализированы для определения их функций, а также молекулярных изменений, специфичных для клеток. Результаты такого перекрестного исследования могут выявить факторы, которые важны для активации жизненно важных врожденных клеточных популяций, которые полезны для контроля и подавления прогрессирования вирусной инфекции. Кроме того, эти факторы могут быть повсеместно применены к различным вирусным заболеваниям, особенно к вновь возникающим вирусам, чтобы ослабить воздействие таких вирусов, когда они впервые циркулируют в наивных человеческих популяциях.

Введение

Респираторные вирусы, пожалуй, являются одними из наиболее распространенных патогенов, вызывающих серьезное медицинское и экономическое бремя. От периодических глобальных вспышек новых эпидемических штаммов (например, H1N1, H5N1, H3N2, MERS, COVID-19) до сезонных штаммов гриппа каждый год, вирусы представляют постоянную угрозу для здоровья населения. Хотя вакцины составляют основную часть ответных мер на эти глобальные проблемы общественного здравоохранения, отрезвляюще отметить, что эти контрмеры являются просто ответными 1,2. Кроме того, задержка между появлением нового инфекционного штамма и успешной разработкой его вакцины неизбежна3, что приводит к периоду, когда меры, доступные для сдерживания распространения вируса, сильно ограничены.

Эти задержки еще более подчеркиваются издержками, которые наносятся обществу как в экономическом, так и в социальном плане. Только сезонный грипп несет ответственность за примерно 8 миллиардов долларов косвенных расходов, 3,2 миллиарда долларов медицинских расходов и 36,3 тысячи смертей в Соединенных Штатах Америки ежегодно4. Это до рассмотрения расходов на исследования, которые необходимы для финансирования разработки вакцины. Эпидемические вспышки имеют еще более серьезные последствия для общества, усугубляемые растущими темпами глобализации с каждым годом, о чем свидетельствуют глобальные сбои, вызванные возникновением и быстрым распространением тяжелого острого респираторного синдрома короновируса 2 (SARS-CoV-2)5,6,7.

Недавние исследования показали, что инфицированные пациенты, имеющие большую популяцию активированных врожденных Т-клеток, как правило, имеют лучший исход заболевания 8,9,10. Кроме того, врожденная популяция Т-клеток подразделяется на несколько подгрупп: слизисто-ассоциированные инвариантные Т-клетки (MAIT), Vδ1 γδ Т-клетки, Vδ2 γδ Т-клетки и естественные Т-киллеры (NKT). Эти подгруппы врожденных Т-клеток также демонстрируют гетерогенность в своих популяциях, увеличивая сложность взаимодействий между клеточными популяциями, участвующими во врожденном иммунном ответе11. Следовательно, механизм, который активирует эти врожденные Т-клетки и знание конкретных подгрупп врожденных Т-клеток, может обеспечить другое направление исследований для ограничения инфекционного воздействия этих вирусов на человека-хозяина, особенно в период разработки вакцины.

Эпителиальные клетки, инфицированные гриппом, продуцируют факторы, которые быстро активируют врожденные Т-клетки 12,13,14. Основываясь на этом открытии, эта бесконтактная модель кокультуры воздушно-жидкостного интерфейса (ALI) направлена на имитацию ранних химических взаимодействий (опосредованных растворимыми факторами, высвобождаемыми инфицированным эпителиальным слоем) между инфицированным носовым эпителиальным слоем и НБМК во время ранней инфекции. Физическое разделение между носовым эпителиальным слоем (культивируемым на мембранных вставках) и PBMCs (в камере внизу) и целостность эпителия предотвращают прямую инфекцию PBMCs вирусом, что позволяет детально изучить влияние эпителиальных растворимых факторов на PBMCs. Поэтому выявленные факторы могут быть дополнительно исследованы на предмет их терапевтического потенциала в индуцировании соответствующей врожденной популяции Т-клеток, которая может защитить от инфекции гриппа. Поэтому в этой статье подробно описаны методы создания кокультуры для изучения врожденной активации Т-клеток из растворимых факторов, полученных из эпителия.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Рецепты носителей, используемых в этом протоколе, приведены в Таблице 1 .
ПРИМЕЧАНИЕ: было обнаружено, что hNECS, выращенные на 12-луночной трансвелле, вырастают в более оптимальную толщину для того, чтобы растворимые факторы легко достигали базальной камеры при заражении вирусом гриппа. Поэтому рекомендуется использовать 12-луночный трансвеллер для совместной культивирования.

1. Установка фидерного слоя 3Т3

  1. Создание из замороженных запасов
    1. Разморозить криовиал фибробластов NIH/3T3 из замороженных запасов. Добавьте содержимое криовиала в 2 мл полной минимальной существенной среды Dulbecco (DMEM) и повторно суспендируйте клетки.
    2. Центрифугу в течение 5 мин при 300 × г и комнатной температуре/давлении (RTP) и удаляют супернатант. Повторное суспендирование клеток в полном DMEM.
    3. Подсчитайте клетки с помощью окрашивания трипан синим цветом. Добавьте 10 мкл трипана синего к 10 мкл повторно суспензионной клеточной суспензии. Тщательно перемешайте и добавьте 10 мкл суспензии в гемоцитометр для подсчета клеток.
    4. Семенные клетки при плотности 1 × 104 клетки/см2 в соответствующей чашке для культивирования (например, колбе T75). Инкубируйте полученную культуральную колбу в течение 3 дней при 37 °C в атмосфере 5% CO2 .
  2. Лечение митомицином С
    1. Через 3 дня убедитесь, что сливание составляет 60%-80%, удалите среду и промывайте клетки 1x фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Важно, чтобы слой питателя 3Т3 не достигал полного слияния; в противном случае лечение митомицином С не будет эффективным.
    2. Добавьте в колбу полный DMEM, дополненный митомицином С, и инкубируйте в течение 3,5 ч при 37 °C в 5% атмосфере CO2 . Удалить митомицин С-содержащую среду и промыть клетки 2x с 1x PBS.
  3. Посев клеток 3Т3 в 6-луночные пластины
    1. Добавьте 3 мл 1x трипсина-ЭДТА в колбу в течение 3-5 мин, чтобы диссоциировать клетки. Соберите диссоциированные клетки в свежую трубку объемом 15 мл. Центрифуга в пробирке 15 мл в течение 5 мин при 300 × г, rtp; отбросьте супернатант. Повторное суспендирование клеток в полном DMEM.
    2. Подсчитайте клетки с помощью окрашивания трипан синим цветом. Засейте клетки в 6-луночную пластину при 7,5 × 10 5-2,5 × 106 клеток/лунку. Инкубируйте пластину в течение ночи при 37 °C в атмосфере 5% CO2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Питательный слой 3T3 считается готовым, если клетки здоровы. На этом этапе посейте стволовые /прогениторные клетки эпителия носа человека (hNESPC) на слой кормушки для расширения.
    3. Добавьте Complete DMEM в колбу и инкубируйте при 37°C, 5% CO2 в течение ночи для клеток 3T3 для восстановления после лечения митомицином C.

2. Создание культуры эпителиальных клеток носа человека (hNEC)

ПРИМЕЧАНИЕ: Клинические образцы должны быть получены от пациентов, у которых нет симптомов инфекции верхних дыхательных путей.

  1. Переработка носовой ткани в одноклеточную суспензию
    1. Промыть носовую ткань в 1x Dulbecco PBS (dPBS) (PBS без Mg2+ и Ca2+), содержащих 100 мкл/мл антибиотическо-антимикотической смеси. Разрежьте ткань на мелкие фрагменты и обработайте образец в 10 мг/мл нейтральной протеазы на ночь при 4 °C с встряхиванием.
    2. Центрифугу в течение 5 мин при 200 × г и удаляют супернатант после центрифугирования. Инкубируют гранулы в 1-2 мл 1x трипсина-ЭДТА (37 °C, 15 мин) и закаливают, добавляя объем фетальной бычьей сыворотки, равный 10% от объема в пробирке.
    3. Механически диссоциируют переваренную ткань на одноклеточные агрегаты путем пипетирования, а затем пропускают полученную суспензию через 70-мкм клеточный ситечко. Повторное суспендирование клеток в полном DMEM.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После этой стадии клеточная суспензия представляет собой смесь терминально дифференцированных клеток и стволовых клеток, которые называются стволовыми /прогениторными клетками эпителия носа человека (hNESPCs). Целью последующих шагов является отбор и обогащение популяции hNESPC из смеси различных клеточных популяций.
  2. Посев одноэлементной суспензии на слой питателя 3T3 для выбора hNESPC
    1. Центрифугируют клеточную суспензию со стадии 2.1.3 (300 × г, 5 мин, rtp) и удаляют супернатант. Повторно суспендируют клетки в 3-5 мл среды 3.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Среда 3 сформулирована для содействия селективному росту hNESPC.
    2. Подсчитайте клетки с помощью окрашивания трипан синим цветом. Посейте 1 х 106 ячеек в 2 мл среды 3 на скважину на 6-луночную пластину, содержащую подготовленный слой подачи 3Т3 после удаления среды в 6-луночной пластине. Инкубируют полученную кокультуру при 37 °C в 5% атмосфереCO2 .
      ПРИМЕЧАНИЕ: После посева позаботьтесь о том, чтобы не перемешивать пластину, так как это повлияет на прикрепление hNESPC.
    3. Меняйте среду 3 (2 мл) каждые 2-4 дня, полностью удаляя старую среду и заменяя ее свежей средой 3.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Среда изменяется для пополнения питательных веществ и предотвращения чрезмерно кислых условий от негативного влияния на рост hNESPC. Интервал между каждым изменением среды зависит от того, насколько кислой (желтой) становится среда. Интервалы следует сократить, если среда быстро становится кислой.
    4. Через 7-10 дней обратите внимание, что hNESPC находятся в слиянии, подходящем для переноса их на мембранные вставки. На рисунке 1 показана репрезентативная морфология hNESPC в 3 различных временных точках (2 дня, 5 дней и 10 дней).
  3. Перенос hNESPC на мембранные вставки
    ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за обработки митомицином С слой питателя 3T3 будет медленно разлагаться в течение периода расширения hNESPC. Это приведет к ослаблению адгезии к поверхности скважины, что позволит их сместить путем промывки пипеткой, оставив после себя только здоровые hNESPC.
    1. Извлеките среду и добавьте 500 мкл 1x dPBS в каждую лунку. Промыть ячейки 3x микропипеткой, чтобы вытеснить ячейки 3T3, и выбросить 1x dPBS. Наблюдайте под микроскопом, что круглые hNESPC остаются, в то время как шпиндельообразный слой подачи 3T3 смещен.
    2. Добавьте 500 мкл реагента диссоциации клеток на лунку и инкубируйте при 37 °C в атмосфере 5% CO2 в течение 5-10 мин или до тех пор, пока hNESPC не отделятся от поверхности скважины.
    3. Соберите суспензию hNESPC, центрифугу (300 × г, 5 мин, rtp) и удалите супернатант.
    4. Повторно суспендировать гранулы в среде 3. Подсчитайте клетки с помощью окрашивания трипан синим цветом. Семя 3 × 104 ячейки в 150 мкл среды 3 на мембранную вставку (24-луночная пластина) или 1 × 105 клеток в 300 мкл среды 3 на мембранную вставку (12-луночная пластина) (Фиг.2). Инкубируют клетки при 37 °C в 5% атмосфере CO2 .
    5. Меняйте среду (среду 3) верхушечной и базальной камер каждые 2 дня. Переместите наконечник пипетки между поддерживающими рычагами мембранной вставки, чтобы получить доступ к базальной камере, удалите старую среду, а затем снова введите свежую среду тем же методом. Хотя апикальная камера легко доступна, позаботьтесь о том, чтобы не нарушить растущий слой hNESPC.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не беспокойте среду в апикальной камере в течение как минимум 2 дней после посева, так как клеткам требуется время для прикрепления к мембране.
  4. Дифференциация hNESPC на hNECs
    1. Когда hNESPC достигнут 100% слива (примерно через 3-7 дней после посева на мембранной вставке), запустите культуру ALI. Замените базальную среду на дифференцирующую среду и удалите среду из апикальной камеры. Добавляйте среду в базальную камеру только без добавления ее в апикальную камеру при смене среды каждые 2-3 дня, как показано на рисунке 3 и этапе 2.3.5.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Среда изменена на среду дифференциации, чтобы способствовать дифференциации hNESPC в hNECs в ALI. HNESPC требуется примерно 3-4 недели, чтобы достичь полной зрелости, чтобы стать hNECs в ALI, и в этот момент клетки выросли бы в многослойный с различными популяциями клеток в каждом слое. Реснички также следует наблюдать при увеличении в 400 раз (реснички могут быть идентифицированы по их бьющемуся движению, которое заставляет поле микроскопа выглядеть так, как будто оно вибрирует). На этом этапе клетки готовы к использованию для экспериментов с кокультурой. Поперечное сечение полностью дифференцированного слоя hNEC приведено на рисунке 4 .
    2. После получения зрелых hNEC промыть клетки в апикальной камере 3x с 1x dPBS с интервалом в 2-3 дня в течение 1 недели до эксперимента с кокультурой. Объедините этап стирки с изменениями базальной среды и выполните промывку следующим образом.
      1. Добавьте 50 мкл (24 лунки)/150 мкл (12 лунок) 1x dPBS в апикальную камеру мембранной вставки и инкубируйте клетки при 37 °C в течение 10 мин. Удаляют dPBS после 10 мин инкубации для удаления скопившейся слизи и мертвых клеток в ходе дифференцировки.
        ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от характера эксперимента, раствор бикарбоната натрия может быть использован для полного смывания слоя слизи. Однако при вирусной инфекции в экспериментах с кокультурой слой слизи сохраняется, и только избыток слизи удаляется с помощью промывки dPBS. Это удержание должно имитировать физиологический слой слизи, присутствующий на носовом эпителии, который будет взаимодействовать с поступающей вирусной инфекцией.

3. Измерение трансэпителиального электрического сопротивления (TEER)

ПРИМЕЧАНИЕ: Подтверждение целостности эпителия важно для обеспечения получения неповрежденного и здорового эпителиального слоя. Интактный эпителиальный слой определяется путем измерения TEER, выполняемого на 4 случайных скважинах с использованием вольтомметра.

  1. Промойте электрод 70% этанолом и стерилизуйте его ультрафиолетом в течение 15 мин перед использованием для обеспечения стерильности. Промыть 1x dPBS после стерилизации.
  2. Добавьте 100 мкл (для 24 лунок) или 300 мкл (для 12 лунок) 1x dPBS в апикальную камеру мембранной вставки. Инкубировать пластину при 37 °C в течение 10 мин; затем удалите dPBS.
  3. Для каждой измеряемой скважины подготовьте неиспользованную скважину с 1 мл (для 24-лунки) или 3 мл (для 12-лунки) предварительной (до 37 °C) дифференцировочной среды. Поместите мембранную вставку в подготовленный колодец и добавьте 200 мкл (для 24-лунки) или 600 мкл (для 12 лунок) предварительной дифференцированной среды в апикальную камеру. Уравновешивать при 37 °C (при условии температуры инкубации типа добавленного вируса, например, 35 °C для гриппа) в течение 15 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте заготовку (вставку пустой мембраны) таким же образом для расчета TEER.
  4. Уравновешивайте 15 мл пробирку предварительной дифференцированной среды при той же температуре в течение 15 мин. Поместите электроды в трубку объемом 15 мл и включите вольтомметр.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этот момент показания должны быть 0 сопротивления, так как электроды находятся в одной среде. Если получены какие-либо другие показания, уравновешивайте электрод в трубке объемом 15 мл до тех пор, пока показания не будут равны 0.
  5. Начиная с заготовки, расположите электроды в каждой скважине таким образом, чтобы один электрод погружался в среду апикальной камеры, а другой в среду базальной камеры. Записывайте показания только тогда, когда постоянное показание получено в течение не менее 5 мин.
  6. После каждого измерения промывайте электрод PBS перед следующим измерением. Для каждой испытанной скважины проведите измерения для трех образцов в разных положениях мембраны. Чтобы рассчитать чистый TEER каждого образца, вычтите фоновое сопротивление, заданное пустой мембранной вставкой, из каждого измерения.
  7. Рассчитайте общие показания TEER для скважины, используя следующее уравнение:
    Целостность эпителия (Ωcm2) = Net TEER (Ом) × площадь мембраны (см2)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Значения TEER hNECs для экспериментов с вирусной инфекцией должны составлять >1000 Ωcm2 13,15,16. 

4. Выделение моноцитов периферической крови и NK-клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы крови должны быть получены у здоровых добровольцев и использованы в тот же день изоляции.

  1. Соберите 30-40 мл цельной крови от каждого донора в 10 мл пробирок для сбора крови.
  2. Изолируйте НБМК с помощью центрифугирования градиента плотности и получите НБМК из пышного слоя после следующих шагов (см. также Таблицу материалов).
    1. Тщательно смешайте ~10 мл крови из пробирки для сбора крови в вакутайнере перед разбавлением равным объемом сбалансированного солевого раствора (PBS).
    2. Добавьте 15 мл градиентной среды плотности к основанию трубки объемом 50 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Отношение градиента плотности среды к разбавленной крови должно составлять 2:3-3,5.
    3. Слой 35 мл разбавленной крови на среде градиента плотности с помощью пипетки (с настройкой дозирования, установленной на минимально возможную возможную), наклоняя трубку на 45° и позволяя разбавленной крови по каплям падать на внутреннюю стенку трубки, чтобы слой среды градиента плотности не нарушался.
    4. Центрифужный лизат при 500 × г, 18-20 °C в течение 30 мин (тормоз: выключен). Осторожно удалите и отбросьте верхний слой плазмы, не нарушая нижний слой.
    5. Перенесите пышную оболочку в новую трубку, не смешивая слой эритроцитов, слой среды градиентной плотности или слой баффи. После того, как пальто будет собрано в новую трубку объемом 50 мл, дополните объем до 50 мл с помощью 1x PBS.
    6. Центрифуга лизата при 800 × г, 18-20 °C, 8 мин (тормоз: выключен), и удалите супернатант с помощью пипетки. Повторно суспендируют ячейку гранулы с 50 мл 1x PBS и центрифугу при 120 × г, 18-20 °C, 10 мин для удаления тромбоцитов.
    7. Выбросьте супернатант путем пипетирования, не нарушая гранулу клетки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку гранула ячейки может быть рыхлой, нецелесообразно выбрасывать супернатант путем заливки.
    8. Повторное суспендирование клеточной гранулы с помощью полной среды RPMI (Roswell Park Memorial Institute). Выполните подсчет клеток, добавив 10 мкл 3% уксусной кислоты с метиленовым синим к 10 мкл повторно суспензионной клеточной суспензии. Тщательно перемешайте и добавьте 10 мкл смеси в гемоцитометр для подсчета клеток.
  3. Разбавляйте НБМК полной средой RPMI до плотности 2 × 106/мл (для 24 лунок) или 4 × 106/мл (для 12 лунок).

5. Вирусная инфекция hNEC и переход на кокультуру hNEC:PBMC

ПРИМЕЧАНИЕ: H3N2 (A/Aichi/2/1968) используется в качестве репрезентативного штамма инфекции в настоящем протоколе. Множественность инфекции (MOI) 0,1 используется в качестве репрезентативного MOI в этом протоколе.

  1. День 0 (Заражение хНЭК)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Одна лунка из гНЭК, выращенных у одного и того же донора, используется для получения репрезентативного количества клеток для каждой скважины, используемой в эксперименте.
    1. В репрезентативном колодце добавляют 150 мкл 1x трипсина-ЭДТА к апикальной камере мембранной вставки и 350 мкл 1x трипсина-ЭДТА в базальную камеру и инкубируют при 37 °C в течение 10 мин или до тех пор, пока клетки не отделятся от мембраны.
    2. Промывайте клетки на мембране путем пипетки вверх и вниз и соберите суспензию в центрифужную трубку объемом 1,5 мл. Добавьте 200 мкл полного DMEM для подавления активности трипсина. Подсчитывайте клетки с помощью окрашивания трипановым синим цветом, чтобы получить количество клеток на лунку.
    3. Рассчитайте требуемый MOI вируса на основе количества клеток на скважину и соответственно разбавьте запас вируса полным RPMI на льду.
      ПРИМЕЧАНИЕ: MOI 0,1 из 1,26 × 106 гНЭК на лунку = 1,26 × 105 вирусных частиц H3N2 на скважину в 30 мкл (для 24 лунок)/100 мкл (для 12 лунок)
    4. Для оставшихся лунок для эксперимента с инфекцией добавляют 50 мкл (для 24-лунки)/150 мкл (для 12-лунки) 1x dPBS в апикальные камеры мембранных вставок, инкубируют при 37 °C в течение 10 мин и удаляют 1x dPBS.
    5. Измените базальную среду в мембранных вставках на полную rpmI-среду путем переноса вставок на новую пластину с полным RPMI, добавленным в скважины (350 мкл (для 24-лунки)/700 мкл (для 12-луночной)).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Когда hNESPC полностью дифференцировались от hNEC, они устойчивы / разрешительны к различным средам в течение 72 ч, без изменений в морфологии или организации при переключении среды на RPMI12. RPMI используется для поддержки роста и поддержания популяции PBMC.
    6. Добавьте приготовленные 30 мкл (для 24 лунок)/100 мкл (для 12 лунок) инокулята вируса в апикальную камеру мембранной вставки, инкубируйте при 35°С в 5% атмосфере CO2 в течение 1 ч и удалите вирусный инокулят из апикальной камеры.
    7. Изменить базальную среду мембранной вставки на свежую полную rpmI-среду и инкубировать при 35 °C в атмосфере 5% CO2 в течение 24 ч.
  2. День 1 (создание совместной культуры hNECs + PBMCs)
    1. Засейте необходимое количество НБМК в 150 мкл (для 24 лунок)/300 мкл (для 12 лунок) полной среды RPMI путем непосредственного добавления суспензии ПБМК в базальную камеру каждой скважины неинфицированных или инфицированных хНЭК с 0-го дня (1,5 × 106 для 24-луночных пластин и 3 × 106 для 12-луночных пластин). Инкубировать при 37 °C в течение 24/48 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Конечный объем в базальной камере после создания кокультуры составляет 500 мкл (для 24-луночной) /1000 мкл (для 12-луночной).
  3. Дни 2-3 (сбор ПБМК 48/72 ч поствирусной инфекции)
    1. Коллекция апикальных супернатантов (48/72 ч поствирусной инфекции)
      1. Добавьте 50 мкл (для 24 лунок)/150 мкл (для 12 лунок) 1x dPBS в каждую апикальную камеру и инкубируйте при 37 °C в течение 10 мин. Соберите 1x dPBS в пробирки по 1,5 мл. Аликвот 25 мкл (для 24-лунки)/50 мкл (для 12-лунки) надосадочного вещества для анализа бляшек в новой пробирке объемом 1,5 мл и немедленно замораживают как запас, так и аликвоты при -80 °С.
    2. Сбор клеточной РНК из hNECs (поствирусная инфекция 48/72 ч)
      1. Переложите мембранную вставку в чистый колодец, добавьте 300 мкл (для 24-лунки)/600 мкл (для 12 лунок) буфера лизиса РНК в апикальную камеру и инкубируйте при RTP в течение 5 мин. Соберите супернатант в центрифужную трубку объемом 1,5 мл и храните его при -80 °C до экстракции РНК для молекулярного анализа.
    3. Сбор ПБМК (поствирусная инфекция 48/72 ч)
      1. С широким основанием стерильного наконечника пипетки аккуратно соскоблите поверхность скважины, чтобы выбить активированные НБМК, которые могут быть прикреплены к поверхности скважины. Соберите базальную среду, содержащую НБМК, в центрифужную трубку объемом 2 мл.
      2. Промыть скважины 2x с 300 мкл 1x dPBS и собрать промывку в ту же 2 мл трубку. Центрифугируют трубку 2 мл (500 × г, 5 мин, RTP) и собирают супернатант в свежую трубку 2 мл, не нарушая гранулы клеток. Хранить супернатант при -80 °C для анализа цитокинов и хемокинов; повторно суспендировать ячейку гранулы в 200 мкл 1x dPBS.

6. Проточная цитометрия

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот раздел протокола продолжается непосредственно из предыдущего раздела с использованием суспензии ячеек PBMC из шага 5.3.3.2. Обеспечьте минимальное освещение во время выполнения следующих шагов в этом разделе. Образец панели маркеров окрашивания поверхности можно найти в таблице 2.

  1. Окрашивание поверхности
    1. Перенесите повторно суспендированную гранулу ячейки PBMC в пластину нижней скважины напряжением 96 В. Центрифугу лизата при 800 × г в течение 3 мин и удаляют супернатант.
    2. Инкубировать все НБМК (за исключением «незапятнанных») со 100 мкл пятна жизнеспособности в течение 15 мин при RTP. Дополните до 200 мкл с помощью 150 мкл магнитно-активированного буфера сортировки клеток (MACS). Центрифугу лизата при 800 × г в течение 3 мин и выбрасывают супернатант.
    3. Подготовьте панель представляющих интерес для окрашивания поверхности антител с соответствующими коэффициентами разбавления и конечным объемом 50 мкл на реакцию (доливаем буфером MACS для получения конечного объема). Выполняют окрашивание поверхности путем добавления 50 мкл подготовленной смеси антител в клетки с помощью многоканальной пипетки. Инкубировать при 4 °C в течение 15 мин в темноте.
    4. Мойте, добавляя 150 мкл буфера MACS. Центрифугу лизата при 800 × г в течение 3 мин и выбрасывают супернатант. Если внутриклеточное окрашивание не требуется, приступайте непосредственно к 15-минутной инкубации на этапе 6.3.
  2. Внутриклеточное окрашивание (при необходимости)
    1. Добавьте 100 мкл раствора для фиксации и пермеабилизации в каждую лунку. Инкубировать при 4 °C в течение 20 мин в темноте. Доливайте скважины 100 мкл 1x MACS буфера.
    2. Центрифуга (800 × г, 3 мин, 25 °C) и удалить супернатант. Повторите стирку, добавив 200 мкл 1x permeabilization Wash buffer. Центрифуга (500 × г, 3 мин, 25 °C) и удалить супернатант.
    3. Подготовьте разведения для интересующей панели антител для достижения конечного объема 50 мкл с использованием 1x permeabilization Wash buffer. Инкубировать на льду в течение 30 мин в темноте. Добавьте 200 мкл 1-кратного буфера для промывки пермеабилизации.
    4. Центрифугируют клетки (800 × г, 3 мин, 4 °C) и удаляют супернатант. Повторное суспендирование клеток в 100 мкл флуоресцентно-активированного буфера сортировки клеток.
  3. Пипетка 200 мкл лизирующего раствора в каждую лунку. Инкубировать в течение 15 мин при РТП. Центрифугу лизата при 800 × г в течение 3 мин и выбрасывают супернатант.
  4. Повторное суспендирование клеточных гранул в 200 мкл буфера MACS. Выполняют проточную цитометрию в соответствии с настройками, изложенными ранее13, или хранят при 4 °C в темноте.

7. Определение уровней цитокинов и хемокинов

  1. Обработать 25 мкл супернатанта базальной камеры с использованием иммунологического мультиплексного анализа в соответствии с протоколом18 производителя.
  2. Рассчитайте концентрацию каждого анализируемого вещества с помощью программного обеспечения мультиплексного менеджера с использованием алгоритма подгонки кривых (5 параметров) для стандартной кривой.

8. Оценка вирусной контаминации

  1. Экстрагируйте вирусную РНК с помощью экстракционного набора на 4 наборах растворов: запасной раствор H3N2, разведение MOI 0,1 для инфекции, 10-кратное серийное разведение MOI 0,1 и базальную среду из образцов (как 48, так и 72 ч поствирусной инфекции)12.
  2. Выделить неструктурный ген (NS1) и матрицу (M1) в качестве мишеней для полимеразной цепной реакции (ПЦР) (см. Таблицу материалов для праймеров, используемых в репрезентативном эксперименте).
  3. Выполните обратную транскрипцию-ПЦР (ОТ-ПЦР) (42 °C, 60 мин) для преобразования вирусной РНК в кДНК перед выполнением количественной ПЦР (qPCR) для измерения уровней NS1 и M1 в качестве прокси для вирусного присутствия и соотнесите уровни со стандартной кривой, полученной из RT-qPCR, выполненной на 10-кратном последовательном разведении MOI 0,1 аликвоты. Состав реакционных смесей приведен в таблице 3 и используйте следующие условия: преинкубация при 95°С в течение 10 мин с последующим 3-ступенчатым усилением в течение 40 циклов: 95°С в течение 10 с, 60°С в течение 10 с, 72°С в течение 30 с; кривая плавления: 95 °C в течение 10 с, 65 °C в течение 60 с и 97 °C в течение 1 с.

9. Анализ бляшек

  1. День 0: посев MDCK (Madin Darby Canine Kidney) в 24-луночных пластинах
    1. Удалите среду из колбы T75 из сливающихся клеток MDCK. Промыть 2x с 1x PBS, чтобы удалить все следы сыворотки. Трипсинизируют клетки MDCK путем добавления 10 мл трипсина и инкубации при 37 °C в 5% атмосфере CO2 в течение 20-30 мин до отслоения клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не прикасайтесь к колбе, так как это может привести к слипанию.
    2. Пипетка клеточной суспензии в пробирку объемом 15 мл, содержащую 2 мл полной минимальной существенной среды Eagle's Minimal Essential Medium (EMEM). Центрифугу (300 × г, 5 мин, RTP) и удаляют супернатант.
    3. Повторное суспендирование клеток в 6 мл полного ЭМЭМ. Подсчитайте клетки по трипановому окрашиванию в синий цвет.
    4. Разбавить клеточную суспензию MDCK до концентрации 1 × 105 клеток/мл и посеять 1 мл разбавленной суспензии в каждой лунке стерильной 24-луночной пластины. Инкубировать при 37 °C в 5% атмосфереCO2 в течение 24 ч для получения сливающегося монослоя клеток MDCK в каждой скважине.
  2. День 1: инфекция клеток MDCK
    1. Подготовьте инфекционную среду. Извлеките среду из монослоя MDCK в 24-луночной пластине и промыть 2x с 1x dPBS. Для второй промывки оставьте PBS в колодцах при подготовке серийных разведений вируса.
    2. Разморозить образцы вируса на льду, и последовательно разбавлять их в 24-луночной пластине для достижения серийных разведений от 10-1 до 10-6.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве примера заполните каждую скважину в 24-луночной пластине 270 мкл инфекционной среды.
    3. Добавьте 30 мкл образца вируса в первую лунку в ряду. С новым наконечником пипетки хорошо перемешайте и переложите в следующую скважину в ряду, чтобы разбавить образец в 10 раз. Продолжать до тех пор, пока не будет достигнуто 10-6 разбавления; Выполните действия 9.2.1-9.2.3 для всех образцов вирусов.
    4. Удалить PBS из пластины MDCK и заразить в двух экземплярах 100 мкл подготовленных вирусных разведений. Для контрольных скважин добавляют 100 мкл инфекционной среды (без вирусного образца). Инкубировать при 35 °C в атмосфере 5% CO2 в течение 1 ч, встряхивая пластину для устранения сухих пятен каждые 15 мин.
    5. Удалите вирусный инокулятив и добавьте 1 мл жидкой накладки на каждую лунку. Инкубировать при 35 °C в атмосфере 5% CO2 в течение 72 ч.
  3. День 4 (72 ч после заражения): визуализация зубного налета
    1. Удалите жидкое наложение и зафиксируйте клетки 4% формальдегидом в 1x PBS в течение 1 ч. Удалите раствор формальдегида и промыть один раз 1x PBS или дистиллированной водой.
    2. Окрашивают неподвижные клетки, добавляя 1% кристаллический фиолетовый раствор в течение 15 мин. Удалите кристаллический фиолетовый краситель и промойте клетки проточной водой. Высушите пластину при RTP.
    3. После высыхания подсчитайте бляшки и рассчитайте титр вируса по следующей формуле:
      Количество бляшек × коэффициент разбавления = количество бляшек - образующих единиц в 100 мкл

Результаты

Хотя обычные Т-клетки образуют основной репертуар адаптивного иммунного ответа против вирусной инфекции для облегчения вирусного клиренса, врожденная популяция Т-клеток работает по всему более широкому спектру, чтобы подавить вирусную нагрузку для эффективного кли...

Обсуждение

Врожденные иммунные реакции против вирусов являются недостаточно изученной областью исследований в области противовирусного лечения. Эпителиальные клетки дыхательных путей и врожденные иммунные клетки работают согласованно, чтобы подавить репликацию вируса во время инфекции, поми...

Раскрытие информации

Все авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить научных сотрудников кафедры отоларингологии NUS и кафедры микробиологии и иммунологии за их помощь в работе, связанной с культурой hNEC и вирусной культурой. Мы также хотели бы поблагодарить хирургов и хирургическую бригаду в Национальной университетской больнице, отделение отоларингологии, за их помощь в предоставлении образцов клеток и крови, необходимых для исследования.
Это исследование финансировалось Национальным советом по медицинским исследованиям, Сингапур No. NMRC/CIRG/1458/2016 (Де Юн Вану) и MOH-OFYIRG19may-0007 (Кай Сен Тану). Кай Сен Тан является получателем стипендиальной поддержки от Европейской исследовательской стипендии по аллергии и клинической иммунологии (EAACI) 2019 года.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
0.5% Trypsin-EDTAGibco15400-054
0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), pH 8.0, RNase-freeThermofisherAM9260G0.5M EDTA
1.5 mL SafeLock TubesEppendorf00301200861.5mL Centrifuge Tube
10 mL K3EDTA Vacutainer TubesBD36664310mL Blood Collection Tubes
10x dPBSGibco14200-075
10x PBSVivantisPC0711
12-well PlateCorning 3513
12-well Transwell InsertCorning 3460membrane insert
1x FACS Lysing SolutionBD349202
2.0 mL SafeLock TubesEppendorf00301200942 mL centrifuge tube
24-well PlateCorning 3524
24-well Transwell InsertCorning 3470
3% Acetic Acid with Methylene BlueSTEMCELL Technologies07060
3,3',5-triiodo-l-thyronineSigmaT-074
37% Formaldehyde Solution w 15% Methanol as Stabilizer in H2OSigma533998
5810R CentrifugeEppendorf5811000320
5 mL polypropylene tubes (flow tubes)BD352058
70 µm Cell StrainerCorning 431751
A-4-62 RotorEppendorf5810709008
AccutaseGibcoA1110501Cell Dissociation Reagent
Antibiotic-AntimycoticGibco15240-062
Avicel CL-611FMC BiopolymerNALiquid Overlay
Bio-Plex Manager 6.2 Standard SoftwareBio-Rad Laboratories, Inc171STND01Multiplex Manager Software
Butterfly Needle 21 GBD367287
Cholera ToxinSigmaC8052
Crystal Violet MerckC6158
Cytofix/Cytoperm SolutionBD554722Fixation and Permeabilization Solution
Dispase IISigmaD4693Neutral Protease
DMEM/High GlucoseGE Healthcare Life SciencesSH30243.01
DMEM/Nutrient Mixture F-12Gibco-Invitrogen11320033
dNTP MixPromegaU1515dNTP Mix
EMEM (w L-Glutamine)ATCC30-2003
EVOM voltohmmeter deviceWPI, Sarasota, FL, USA300523
FACS Lysing SolutionBD3492021x Lysing Solution
Falcon tube 15 mLCellStar18827115 mL tube
Falcon tube 50 mLCellStar22726150 mL Tube
Fast Start Essential DNA Probes MasterRoche6402682001qPCR Master Mix
Ficoll Paque PremiumResearch Instruments17544203Density Gradient Media
H3N2 (A/Aichi/2/1968) ATCCVR547
H3N2 M1 Forward Primer SequenceSigma5'- ATGGTTCTGGCCAGCACTAC-3'
H3N2 M1 Reverse Primer SequenceSigma5'- ATCTGCACCCCCATTCGTTT-3'
H3N2 NS1 Forward Primer SequenceSigma5'- ACCCGTGTTGGAAAGCAGAT-3'
H3N2 NS1 Reverse Primer SequenceSigma5'- CCTCTTCGGTGAAAGCCCTT-3'
Heat Inactivated Fetal Bovine SerumGibco10500-064
hNESPCsHuman DonorsNA
Human Epithelial Growth FactorGibco-InvitrogenPHG0314
HydrocortisoneSTEMCELL Techonologies7925Collected from nasal biopsies during septal deviation surgeries
InsulinSigmaI3536
Lightcycler 96Roche5815916001qPCR Instrument
Live/DEAD Blue Cell Stain Kit *for UV ExcitationThermofisherL23105Viability Stain
MILLIPLEX MAP Human Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel II - Premixed 23 PlexMerck Pte LtdHCP2MAG-62K-PX23Immunology Multiplex Assay
Mitomycin CSigmaM4287
M-MLV 5x BufferPromegaM1705RT-PCR 5x Buffer
M-MLV Reverse TranscriptasePromegaM1706Reverse Transcriptase
N-2 supplementGibco-Invitrogen17502-048
NIH/3T3ATCCCRL1658
Perm/Wash BufferBD554723Permeabilization Wash Buffer
PneumaCult-ALI 10x SupplementSTEMCELL Techonologies5001
PneumaCult-ALI Basal MediumSTEMCELL Techonologies5001
PneumaCult-ALI Maintenance Supplement (100x)STEMCELL Techonologies5001
Random PrimersPromegaC1181Random Primers
Recombinant Rnasin Rnase InhibitorPromegaN2511RNase Inhibitor
RNA Lysis BufferQiagenPart of 52904
RPMI 1640 (w L-Glutamine)ATCC30-2001
STX2 electrodesWPI, Sarasota, FL, USASTX2Electrode
T25 FlaskCorning430639
T75 FlaskCorning430641U
TPCK TrypsinSigmaT1426
Trypan BlueHycloneSV30084.01
Viral RNA Extraction KitQiagen52904Viral RNA Extraction Kit
V-Shaped 96-well PlateCorning3894

Ссылки

  1. Monto, A. S. Vaccines and antiviral drugs in pandemic preparedness. Emerging Infectious Diseases. 12 (1), 55-60 (2006).
  2. Lightfoot, N., Rweyemamu, M., Heymann, D. L. Preparing for the next pandemic. The British Medical Journal. 346, 364 (2013).
  3. Gerdil, C. The annual production cycle for influenza vaccine. Vaccine. 21 (16), 1776-1779 (2003).
  4. Putri, W., Muscatello, D. J., Stockwell, M. S., Newall, A. T. Economic burden of seasonal influenza in the United States. Vaccine. 36 (27), 3960-3966 (2018).
  5. Mas-Coma, S., Jones, M. K., Marty, A. M. COVID-19 and globalization. One Health. 9, 100132 (2020).
  6. Guo, Y. R., et al. The origin, transmission and clinical therapies on coronavirus disease 2019 (COVID-19) outbreak - an update on the status. Military Medical Research. 7 (1), 11 (2020).
  7. Guan, W. J., et al. Clinical characteristics of coronavirus disease 2019 in China. New England Journal of Medicine. 382, 1708-1720 (2020).
  8. van Wilgenburg, B., et al. MAIT cells are activated during human viral infections. Nature Communications. 7, 11653 (2016).
  9. Chien, Y. H., Meyer, C., Bonneville, M. Gammadelta T cells: first line of defense and beyond. Annual Review of Immunology. 32, 121-155 (2014).
  10. van Wilgenburg, B., et al. MAIT cells contribute to protection against lethal influenza infection in vivo. Nature Communications. 9 (1), 4706 (2018).
  11. Dias, J., Leeansyah, E., Sandberg, J. K. Multiple layers of heterogeneity and subset diversity in human MAIT cell responses to distinct microorganisms and to innate cytokines. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (27), 5434-5443 (2017).
  12. Yan, Y., et al. Human nasal epithelial cells derived from multiple individuals exhibit differential responses to H3N2 influenza virus infection in vitro. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 138 (1), 276-281 (2016).
  13. Luukkainen, A., et al. A co-culture model of PBMC and stem cell derived human nasal epithelium reveals rapid activation of NK and innate T cells upon Influenza A virus infection of the nasal epithelium. Frontiers in Immunology. 9, 2514 (2018).
  14. Tan, K. S., et al. RNA sequencing of H3N2 influenza virus-infected human nasal epithelial cells from multiple subjects reveals molecular pathways associated with tissue injury and complications. Cells. 8 (9), 986 (2019).
  15. Kim, N., et al. Effect of lipopolysaccharide on diesel exhaust particle-induced junctional dysfunction in primary human nasal epithelial cells. Environmental Pollution. 248, 736-742 (2019).
  16. Tan, K., et al. In vitro model of fully differentiated human nasal epithelial cells infected with rhinovirus reveals epithelium-initiated immune responses. Journal of Infectious Diseases. 217 (6), 906-915 (2018).
  17. Tan, K. S., et al. Comparative transcriptomic and metagenomic analyses of influenza virus-infected nasal epithelial cells from multiple individuals reveal specific nasal-initiated signatures. Frontiers in Microbiology. 9, 2685 (2018).
  18. Cytokine /Chemokine Panel II 96 Well Plate Assay. Millipore Corporation Available from: https://www.merckmillipore.com/SG/en/product/MILLIPLEX-MAP-Human-Cytokine-Chemokine-Magnetic-Bead-Panel-II-Premixed-23-Plex-Immunology-Multiplex-Assay (2020)
  19. Gamage, A. M., et al. Infection of human nasal epithelial cells with SARS-CoV-2 and a 382-nt deletion isolate lacking ORF8 reveals similar viral kinetics and host transcriptional profiles. PLoS Pathogens. 16 (12), 1009130 (2020).
  20. Zhao, X. N., et al. The use of nasal epithelial stem/progenitor cells to produce functioning ciliated cells in vitro. American Journal of Rhinology & Allergy. 26 (5), 345-350 (2012).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

168

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены