Modèle de co-culture sans contact pour l’étude de l’activation des cellules immunitaires innées au cours d’une infection virale respiratoire

Résumé

Ce protocole détaille une étude des interactions précoces entre les cellules épithéliales nasales infectées par le virus et l’activation des cellules innées. Des sous-ensembles individuels de cellules immunitaires peuvent être distingués en fonction de leur activation en réponse à des infections virales. Ils peuvent ensuite être étudiés plus avant pour déterminer leurs effets sur les réponses antivirales précoces.

Résumé

Les premières interactions entre la couche épithéliale nasale et les cellules immunitaires innées lors d’infections virales restent un domaine sous-exploré. L’importance de la signalisation de l’immunité innée dans les infections virales a considérablement augmenté à mesure que les patients atteints d’infections respiratoires présentant une activation élevée des lymphocytes T innés montrent un meilleur résultat de la maladie. Par conséquent, la dissection de ces interactions immunitaires innées précoces permet d’élucider les processus qui les régissent et peut faciliter le développement de cibles thérapeutiques potentielles et de stratégies pour amortir ou même prévenir la progression précoce des infections virales. Ce protocole détaille un modèle polyvalent qui peut être utilisé pour étudier la diaphonie précoce, les interactions et l’activation des cellules immunitaires innées à partir de facteurs sécrétés par les cellules épithéliales des voies respiratoires infectées par le virus. En utilisant un virus de la grippe H3N2 (A/Aichi/2/1968) comme modèle de virus représentatif, l’activation cellulaire innée des cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) co-cultivées a été analysée à l’aide de la cytométrie en flux pour étudier les sous-ensembles de cellules qui sont activées par les facteurs solubles libérés par l’épithélium en réponse à l’infection virale. Les résultats démontrent la stratégie de contrôle pour différencier les sous-ensembles de cellules et révèlent les différences claires entre les populations activées de PBMC et leur diaphonie avec l’épithélium témoin et infecté. Les sous-ensembles activés peuvent ensuite être analysés plus avant pour déterminer leurs fonctions ainsi que les changements moléculaires spécifiques aux cellules. Les résultats d’une telle enquête de diaphonie peuvent révéler des facteurs importants pour l’activation des populations de cellules innées vitales, qui sont bénéfiques pour contrôler et supprimer la progression de l’infection virale. En outre, ces facteurs peuvent être universellement appliqués à différentes maladies virales, en particulier aux virus nouvellement émergents, afin d’atténuer l’impact de ces virus lorsqu’ils circulent pour la première fois dans des populations humaines naïves.

Introduction

Les virus respiratoires sont peut-être parmi les agents pathogènes les plus répandus, causant un lourd fardeau sanitaire et économique. Qu’il s’agisse des éclosions mondiales périodiques de souches épidémiques émergentes (p. ex., H1N1, H5N1, H3N2, MERS, COVID-19) ou des souches saisonnières de la grippe chaque année, les virus constituent une menace constante pour la santé publique. Bien que les vaccins constituent la majeure partie de la réponse à ces défis mondiaux de santé publique, il est désolant de noter que ces contre-mesures ne sont que réactives ^1,2. En outre, un délai entre l’émergence d’une nouvelle souche infectieuse et le développement réussi de son vaccin est inévitable³, conduisant à une période où les mesures disponibles pour freiner la propagation du virus sont très limitées.

Ces retards sont encore accentués par les coûts qui sont infligés à la société, économiquement et socialement. La grippe saisonnière à elle seule est responsable d’environ 8 milliards de dollars en coûts indirects, de 3,2 milliards de dollars en coûts médicaux et de 36,3 mille décès aux États-Unis d’Amérique chaque année⁴. Ceci avant d’examiner les coûts de recherche nécessaires pour financer le développement d’un vaccin. Les flambées épidémiques ont des effets encore plus graves sur la société, aggravés par le taux croissant de mondialisation chaque année, comme en témoignent les perturbations mondiales causées par l’émergence et la propagation rapide du coronovirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2)^5,6,7.

Des études récentes ont montré que les patients infectés ayant une plus grande population de lymphocytes T innés activés ont tendance à avoir un meilleur résultat de la maladie ^8,9,10. En outre, la population de lymphocytes T innés est classée en plusieurs sous-groupes: les cellules T invariantes associées aux muqueuses (MAIT), les cellules T Vδ1 γδ, les cellules T Vδ2 γδ et les cellules T tueuses naturelles (NKT). Ces sous-groupes de lymphocytes T innés présentent également une hétérogénéité au sein de leurs populations, ce qui augmente la complexité des interactions entre les populations cellulaires impliquées dans la réponse immunitaire innée¹¹. Par conséquent, le mécanisme qui active ces lymphocytes T innés et la connaissance des sous-groupes spécifiques de lymphocytes T innés peuvent fournir une autre voie de recherche pour réduire les effets infectieux de ces virus sur l’hôte humain, en particulier pendant la période de développement du vaccin.

Les cellules épithéliales infectées par la grippe produisent des facteurs qui activent rapidement les lymphocytes T innés 12,13,14. S’appuyant sur cette découverte, ce modèle de co-culture air-liquide (ALI) sans contact vise à imiter les interactions chimiques précoces (médiées par des facteurs solubles libérés par la couche épithéliale infectée) entre la couche épithéliale nasale infectée et les PBMC au cours de l’infection précoce. La séparation physique entre la couche épithéliale nasale (cultivée sur des inserts membranaires) et les PBMC (dans la chambre en dessous) et l’intégrité épithéliale empêchent l’infection directe des PBMC par le virus, permettant une étude détaillée des effets des facteurs solubles dérivés de l’épithélium sur les PBMC. Les facteurs identifiés peuvent donc être étudiés plus avant pour leur potentiel thérapeutique dans l’induction de la population de lymphocytes T innée appropriée qui peut protéger contre l’infection grippale. Cet article a donc détaillé les méthodes d’établissement d’une co-culture pour l’étude de l’activation des lymphocytes T innés à partir de facteurs solubles dérivés de l’épithélium.

Protocole

REMARQUE : Reportez-vous au Tableau 1 pour connaître les recettes des supports utilisés dans ce protocole.
REMARQUE: Il a été constaté que les hNECS cultivés sur des puits transwell à 12 puits atteignent une épaisseur plus optimale pour que les facteurs solubles atteignent facilement la chambre basale lorsqu’ils sont infectés par le virus de la grippe. Par conséquent, l’utilisation de transwell de taille 12 puits pour la co-culture est recommandée.

1. Mise en place de la couche d’alimentation 3T3

1. Établissement à partir de stocks congelés
   1. Décongeler un cryovial de fibroblastes NIH/3T3 à partir de stocks congelés. Ajouter le contenu du cryovial à 2 mL de minimal essential media (DMEM) complet de Dulbecco et remettre les cellules en suspension.
   2. Centrifuger pendant 5 min à 300 × g et température/pression ambiante (rtp), et retirer le surnageant. Remettez en suspension les cellules dans un DMEM complet.
   3. Comptez les cellules en utilisant la coloration bleu trypan. Ajouter 10 μL de bleu de trypan à 10 μL de la suspension cellulaire remise en suspension. Bien mélanger et ajouter 10 μL de la suspension à un hémocytomètre pour compter les cellules.
   4. Cellules de semence à une densité de 1 × 10⁴ cellules/^cm2 dans une boîte de culture appropriée (p. ex. fiole de T75). Incuber la fiole de culture résultante pendant 3 jours à 37 °C dans une atmosphère de CO_{2 à} 5 %.
2. Traitement à la mitomycine C
   1. À 3 jours, assurez-vous que la confluence est de 60% à 80%, retirez le milieu et lavez les cellules avec 1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
      REMARQUE: Il est important que la couche d’alimentation 3T3 n’atteigne pas la pleine confluence; sinon, le traitement à la mitomycine C ne sera pas efficace.
   2. Ajouter le DMEM complet supplémenté à la mitomycine C dans la fiole et incuber pendant 3,5 h à 37 °C dans une atmosphère de CO_{2 à} 5 %. Retirez le milieu contenant de la mitomycine C et lavez les cellules 2x avec 1x PBS.
3. Ensemencement de cellules 3T3 dans des plaques à 6 puits
   1. Ajouter 3 mL de 1x trypsine-EDTA à la fiole pendant 3-5 min pour dissocier les cellules. Recueillir les cellules dissociées dans un tube frais de 15 mL. Centrifuger le tube de 15 mL pendant 5 min à 300 × g, rtp; jeter le surnageant. Remettez en suspension les cellules dans un DMEM complet.
   2. Comptez les cellules en utilisant la coloration bleu trypan. Ensemencez les cellules dans une plaque de 6 puits à 7,5 × 10 5-2,5 × 10⁶ cellules / puits. Incuber la plaque pendant la nuit à 37 °C dans une atmosphère à 5 % de CO₂.
      REMARQUE: La couche d’alimentation 3T3 est considérée comme prête si les cellules sont saines. À ce stade, ensemencez les cellules souches/progénitrices épithéliales nasales humaines (hNESPC) sur la couche nourricière pour l’expansion.
   3. Ajouter le DMEM complet à la fiole et incuber à 37 °C, 5 % de CO² pendant la nuit pour que les cellules 3T3 se remettent du traitement à la mitomycine C.

2. Mise en culture de cellules épithéliales nasales humaines (HNEC)

REMARQUE: Des échantillons cliniques doivent être obtenus auprès de patients exempts de symptômes d’infection des voies respiratoires supérieures.

1. Transformation du tissu nasal en suspension unicellulaire
   1. Laver les tissus nasaux dans 1x PBS (dPBS) de Dulbecco (PBS sans Mg²⁺ et Ca²⁺) contenant 100 μL/mL d’un mélange antibiotique-antimycotique. Couper le tissu en petits fragments et traiter l’échantillon dans 10 mg/mL d’une protéase neutre pendant la nuit à 4 °C en agitant.
   2. Centrifuger pendant 5 min à 200 × g, et retirer le surnageant après centrifugation. Incuber la pastille dans 1-2 mL de 1x trypsine-EDTA (37 °C, 15 min), et éteindre en ajoutant un volume de sérum bovin fœtal égal à 10% du volume dans le tube.
   3. Dissocier mécaniquement le tissu digéré en agrégats unicellulaires par pipetage, puis faire passer la suspension résultante à travers une passoire cellulaire de 70 μm. Remettez en suspension les cellules dans un DMEM complet.
      REMARQUE: Après cette étape, la suspension cellulaire est un mélange de cellules différenciées en phase terminale et de cellules souches appelées cellules souches / progénitrices épithéliales nasales humaines (hNESPC). L’objectif des étapes suivantes est de sélectionner et d’enrichir la population hNESPC à partir du mélange de différentes populations cellulaires.
2. Ensemencement d’une suspension monocellulaire sur la couche d’alimentation 3T3 pour la sélection des hNESPC
   1. Centrifugez la suspension de la cellule à partir de l’étape 2.1.3 (300 × g, 5 min, rtp) et retirez le surnageant. Remettre en suspension les cellules dans 3-5 mL de milieu 3.
      NOTE: Medium 3 est formulé pour favoriser la croissance sélective des hNESPC.
   2. Comptez les cellules via la coloration bleu trypan. Ensemencez 1 x 10⁶ cellules dans 2 mL de milieu 3 par puits sur une plaque de 6 puits contenant une couche d’alimentation 3T3 préparée après avoir retiré le milieu dans la plaque de 6 puits. Incuber la co-culture résultante à 37 °C dans une atmosphère de CO_{2 à} 5 %.
      REMARQUE: Après l’ensemencement, veillez à ne pas agiter la plaque car cela affectera la fixation des hNESPC.
   3. Changez le milieu 3 (2 mL) tous les 2-4 jours en retirant complètement l’ancien milieu et en le remplaçant par un milieu frais 3.
      REMARQUE: Le milieu est modifié pour reconstituer les nutriments et empêcher les conditions trop acides d’influencer négativement la croissance des hNESPC. L’intervalle entre chaque changement de milieu dépend de l’acidité (jaune) du milieu. Les intervalles doivent être raccourcis si le milieu devient acide rapidement.
   4. Après 7 à 10 jours, observez que les hNESPC sont à une confluence appropriée pour les transférer sur des inserts membranaires. Voir la figure 1 pour la morphologie représentative des hNESPC à 3 points temporels différents (2 jours, 5 jours et 10 jours).
3. Transfert de hNESPC sur des inserts à membrane
   REMARQUE: En raison du traitement à la mitomycine C, la couche d’alimentation 3T3 se dégradera lentement au cours de la période d’expansion du hNESPC. Cela entraînera une adhérence affaiblie à la surface du puits, permettant leur délogement en rinçant avec une pipette, ne laissant derrière eux que les hNESPC sains.
   1. Retirez le milieu et ajoutez 500 μL de 1x dPBS à chaque puits. Rincez les cellules 3x avec une micropipette pour déloger les cellules 3T3, et jetez le 1x dPBS. Observez au microscope que les hNESPC ronds restent pendant que la couche d’alimentation 3T3 en forme de fuseau est délogée.
   2. Ajouter 500 μL d’un réactif de dissociation cellulaire par puits et incuber à 37 °C dans une atmosphère de CO₂ à 5 % pendant 5 à 10 min, ou jusqu’à ce que les hNESPC se soient détachés de la surface du puits.
   3. Prélever la suspension hNESPC, centrifuger (300 × g, 5 min, rtp) et retirer le surnageant.
   4. Remettre en suspension la pastille en milieu 3. Comptez les cellules via la coloration bleu trypan. La graine 3 × 10⁴ cellules dans 150 μL de milieu 3 par insert membranaire (plaque à 24 puits) ou 1 × 10⁵ cellules dans 300 μL de milieu 3 par insert membranaire (plaque à 12 puits) (figure 2). Incuber les cellules à 37 °C dans une atmosphère à 5 % de_CO2 .
   5. Changer le milieu (milieu 3) des chambres apicales et basales tous les 2 jours. Naviguez dans une pointe de pipette entre les bras de support de l’insert à membrane pour accéder à la chambre basale, retirez l’ancien milieu, puis réintroduisez le milieu frais par la même méthode. Bien que la chambre apicale soit facilement accessible, veillez à ne pas perturber la couche hNESPC en croissance.
      REMARQUE: Ne pas déranger le milieu dans la chambre apicale pendant au moins 2 jours après l’ensemencement car les cellules ont besoin de temps pour se fixer à la membrane.
4. Différenciation des hNESPC en hNECs
   1. Lorsque les hNESPC atteignent 100 % de confluence (environ 3 à 7 jours après l’ensemencement sur l’insert membranaire), commencez la culture ALI. Remplacez le milieu basal par milieu de différenciation et retirez le milieu de la chambre apicale. N’ajoutez du milieu à la chambre basale sans l’ajouter à la chambre apicale que lorsque vous changez le milieu tous les 2-3 jours, comme indiqué à la figure 3 et à l’étape 2.3.5.
      REMARQUE: Le milieu est remplacé par le milieu de différenciation pour favoriser la différenciation des hNESPC en hNECs dans ALI. Les hNESPC prennent environ 3 à 4 semaines pour atteindre leur pleine maturité et devenir des hNECs dans l’ALI, auquel cas les cellules se seraient développées en une multicouche avec différentes populations de cellules dans chaque couche. Les cils doivent également être observés à un grossissement de 400x (les cils peuvent être identifiés par leur mouvement de battement, ce qui donne l’impression que le champ du microscope vibre). À ce stade, les cellules sont prêtes à être utilisées pour les expériences de co-culture. Reportez-vous à la figure 4 pour connaître la section transversale d’une couche hNEC entièrement différenciée.
   2. Après avoir obtenu des HNEC matures, lavez les cellules dans la chambre apicale 3x avec 1x dPBS à des intervalles de 2-3 jours pendant 1 semaine avant l’expérience de co-culture. Mettez en synergie l’étape de lavage avec les changements de milieu basal et effectuez les lavages comme suit.
      1. Ajouter 50 μL (24 puits)/150 μL (12 puits) de 1x dPBS dans la chambre apicale de l’insert membranaire et incuber les cellules à 37 °C pendant 10 min. Retirez le dPBS après 10 minutes d’incubation pour éliminer le mucus accumulé et les cellules mortes au cours de la différenciation.
         REMARQUE: Selon la nature de l’expérience, la solution de bicarbonate de sodium peut être utilisée pour laver complètement la couche de mucus. Cependant, pour l’infection virale dans les expériences de co-culture, la couche de mucus est conservée et seul l’excès de mucus est éliminé avec un lavage dPBS. Cette rétention consiste à imiter la couche de mucus physiologique présente sur l’épithélium nasal qui interagira avec l’infection virale entrante.

3. Mesure de la résistance électrique transépithéliale (TEER)

REMARQUE: La confirmation de l’intégrité épithéliale est importante pour s’assurer qu’une couche épithéliale intacte et saine est obtenue. Une couche épithéliale intacte est déterminée par mesure TEER effectuée sur 4 puits aléatoires à l’aide d’un voltohmmètre.

1. Rincez l’électrode avec de l’éthanol à 70% et stérilisez-la à la lumière ultraviolette pendant 15 minutes avant utilisation pour assurer la stérilité. Rincer avec 1x dPBS après stérilisation.
2. Ajouter 100 μL (pour 24 puits) ou 300 μL (pour 12 puits) de 1x dPBS à la chambre apicale de l’insert membranaire. Incuber la plaque à 37 °C pendant 10 min; ensuite, supprimez le dPBS.
3. Pour chaque puits à mesurer, préparer un puits inutilisé avec 1 mL (pour 24 puits) ou 3 mL (pour 12 puits) de milieu de différenciation préavertissé (jusqu’à 37 °C). Placer l’insert membranaire dans le puits préparé et ajouter 200 μL (pour 24 puits) ou 600 μL (pour 12 puits) de milieu de différenciation préavertissé à la chambre apicale. Équilibrer à 37 °C (sous réserve de la température d’incubation du type de virus ajouté, p. ex. 35 °C pour la grippe) pendant 15 min.
   REMARQUE: Préparez un blanc (insert à membrane vide) de la même manière pour le calcul du TEER.
4. Équilibrez un tube de 15 mL de milieu de différenciation préavertissé à la même température pendant 15 min également. Placez les électrodes dans le tube de 15 mL et allumez le voltohmmètre.
   REMARQUE: À ce stade, la lecture doit être de 0 résistance, car les électrodes sont dans le même milieu. Si une autre lecture est obtenue, équilibrez l’électrode dans le tube de 15 mL jusqu’à ce que la lecture soit 0.
5. En partant de l’ébauche, positionnez les électrodes dans chaque puits de manière à ce qu’une électrode soit immergée dans le milieu de la chambre apicale et l’autre dans le milieu de la chambre basale. Enregistrez la lecture uniquement lorsqu’une lecture constante est obtenue pendant une période d’au moins 5 min.
6. Après chaque mesure, lavez l’électrode avec PBS avant la mesure suivante. Pour chaque puits testé, prenez des mesures pour trois échantillons à différentes positions de la membrane. Pour calculer le TEER net de chaque échantillon, soustrayez la résistance de fond, donnée par l’insert de membrane vierge, de chaque mesure.
7. Calculez la lecture TEER totale d’un puits à l’aide de l’équation suivante :
   Intégrité épithéliale (Ωcm²) = NET TEER(ohms) × Surface de la membrane (cm²)
   REMARQUE: Les valeurs TEER des HNEC pour les expériences d’infection virale doivent être >1000 Ωcm² 13,15,16. 

4. Isolement des monocytes du sang périphérique et des cellules NK

REMARQUE: Les échantillons de sang doivent être prélevés sur des volontaires sains et utilisés le jour même de l’isolement.

1. Prélever 30 à 40 mL de sang total de chaque donneur dans des tubes de prélèvement sanguin de 10 mL.
2. Isolez les PBMC à l’aide de la centrifugation par gradient de densité et obtenez des PBMC à partir de la couche bouffante après les étapes suivantes (voir également la Table des matériaux).
   1. Bien mélanger ~ 10 mL de sang du tube de prélèvement sanguin dans un vacutainer avant de diluer avec un volume égal de solution saline équilibrée (PBS).
   2. Ajouter 15 mL de milieu de gradient de densité à la base d’un tube de 50 mL.
      REMARQUE: Le rapport entre le milieu de gradient de densité et le sang dilué doit être de 2: 3-3,5.
   3. Déposer 35 mL de sang dilué sur le milieu de gradient de densité à l’aide d’un pistolet à pipette (avec le réglage du distributeur réglé au plus bas possible) en inclinant le tube de 45° et en laissant le sang dilué tomber goutte à goutte sur la paroi interne du tube afin que la couche de milieu de gradient de densité ne soit pas perturbée.
   4. Centrifuger le lysat à 500 × g, 18-20 °C pendant 30 min (frein : désactivé). Retirez et jetez soigneusement la couche de plasma supérieure sans perturber la couche inférieure.
   5. Transférez la couche de buffy dans un nouveau tube sans mélanger la couche de globules rouges, la couche de milieu de densité de gradient ou la couche de buffy. Une fois que la couche bouffante a été recueillie dans un nouveau tube de 50 mL, augmentez le volume à 50 mL avec 1x PBS.
   6. Centrifuger le lysat à 800 × g, 18-20 °C, 8 min (frein : désactivé), et retirer le surnageant à l’aide d’un pistolet à pipette. Remettre en suspension la pastille de la cellule avec 50 mL de 1x PBS, et centrifuger à 120 × g, 18-20 °C, 10 min pour enlever les plaquettes.
   7. Jetez le surnageant par pipetage, sans déranger la pastille de cellule.
      REMARQUE: Comme la pastille de cellule peut être lâche, il est déconseillé de jeter le surnageant en versant.
   8. Remettre en suspension la pastille cellulaire avec un milieu RPMI (Roswell Park Memorial Institute) complet. Effectuer un comptage cellulaire en ajoutant 10 μL d’acide acétique à 3 % avec du bleu de méthylène à 10 μL de la suspension cellulaire remise en suspension. Bien mélanger et ajouter 10 μL du mélange à un hémocytomètre pour compter les cellules.
3. Diluer les PBMC avec un milieu RPMI complet à une densité de 2 × 10⁶/mL (pour 24 puits) ou 4 × 10⁶/mL (pour 12 puits).

5. hNEC Infection virale et transition vers la co-culture hNEC:PBMC

NOTE: H3N2 (A/Aichi/2/1968) est utilisé comme souche représentative de l’infection dans ce protocole. La multiplicité d’infection (MOI) de 0,1 est utilisée comme MOI représentative dans ce protocole.

1. Jour 0 (Infection des HCNH)
   REMARQUE: Un puits des hNECs cultivés à partir du même donneur est utilisé pour obtenir un nombre représentatif de cellules pour chaque puits utilisé dans l’expérience.
   1. Dans le puits représentatif, ajouter 150 μL de 1x trypsine-EDTA à la chambre apicale de l’insert membranaire et 350 μL de 1x trypsine-EDTA à la chambre basale, et incuber à 37 °C pendant 10 min, ou jusqu’à ce que les cellules se détachent de la membrane.
   2. Rincez les cellules sur la membrane en pipetant de haut en bas et recueillez la suspension dans un tube de centrifugeuse de 1,5 mL. Ajouter 200 μL de DMEM complet pour éteindre l’activité de la trypsine. Comptez les cellules via la coloration bleu trypan pour obtenir le nombre de cellules par puits.
   3. Calculer le MOI requis du virus en fonction du nombre de cellules par puits et diluer le stock de virus en conséquence avec un RPMI complet sur glace.
      NOTE : MOI 0,1 de 1,26 × 10⁶ hNECs par puits = 1,26 × 10⁵ particules virales H3N2 par puits dans 30 μL (pour 24 puits)/100 μL (pour 12 puits)
   4. Pour les puits restants pour l’expérience d’infection, ajouter 50 μL (pour 24 puits)/150 μL (pour 12 puits) de 1x dPBS dans les chambres apicales des inserts membranaires, incuber à 37 °C pendant 10 min et retirer le 1x dPBS.
   5. Changer le milieu basal dans les inserts membranaires pour compléter le milieu RPMI en transférant les inserts sur une nouvelle plaque avec RPMI complet ajouté aux puits (350 μL (pour 24 puits) / 700 μL (pour 12 puits)).
      REMARQUE: Lorsque les hNESPC se sont complètement différenciés des hNEC, ils sont tolérants/permissifs à différents milieux jusqu’à 72 h, sans modification de la morphologie ou de l’organisation lorsque le milieu est basculé vers RPMI¹². RPMI est utilisé pour soutenir la croissance et le maintien de la population PBMC.
   6. Ajouter les 30 μL (pour 24 puits)/100 μL (pour 12 puits) préparés de l’inoculum du virus dans la chambre apicale de l’insert membranaire, incuber à 35 °C dans une atmosphère de CO_{2 à} 5 % pendant 1 h et retirer l’inoculum viral de la chambre apicale.
   7. Changer le milieu basal de l’insert membranaire en milieu RPMI complet frais et incuber à 35 °C dans une atmosphère de CO_{2 à} 5 % pendant 24 h.
2. Jour 1 (mise en place de la co-culture hNECs + PBMC)
   1. Ensemencez le nombre requis de PBMC dans 150 μL (pour 24 puits)/300 μL (pour 12 puits) de milieu RPMI complet en ajoutant directement la suspension PBMC dans la chambre basale de chaque puits de CESH non infectés ou infectés à partir du jour 0 (1,5 × 10⁶ pour les plaques de 24 puits et 3 × 10⁶ pour les plaques de 12 puits). Incuber à 37 °C pendant 24/48 h.
      NOTE: Le volume final dans la chambre basale après l’établissement de la co-culture est de 500 μL (pour 24 puits)/1000 μL (pour 12 puits).
3. Jours 2-3 (récolte des PBMC 48/72 h après l’infection virale)
   1. Collecte de surnageants apicaux (48/72 h post-infection virale)
      1. Ajouter 50 μL (pour 24 puits)/150 μL (pour 12 puits) de 1x dPBS à chaque chambre apicale, et incuber à 37 °C pendant 10 min. Recueillir le 1x dPBS dans des tubes de 1,5 mL. Aliquote 25 μL (pour 24 puits)/50 μL (pour 12 puits) du surnageant pour le dosage de la plaque dans un nouveau tube de 1,5 mL, et congeler immédiatement le stock et les aliquotes à -80 °C.
   2. Collecte d’ARN cellulaire à partir de HNEC (48/72 h post-infection virale)
      1. Transférer l’insert membranaire dans un puits propre, ajouter 300 μL (pour 24 puits)/600 μL (pour 12 puits) de tampon de lyse d’ARN à la chambre apicale et incuber à rtp pendant 5 min. Recueillir le surnageant dans un tube centrifuge de 1,5 mL et le stocker à -80 °C jusqu’à l’extraction de l’ARN pour analyse moléculaire.
   3. Récolte des PBMC (48/72 h post-infection virale)
      1. Avec la large base d’une pointe de pipette stérile, grattez doucement la surface du puits pour déloger les PBMC activés qui peuvent adhérer à la surface du puits. Recueillir le milieu basal contenant des PBMC dans un tube centrifuge de 2 mL.
      2. Rincez les puits 2x avec 300 μL de 1x dPBS et collectez le lavage dans le même tube de 2 mL. Centrifuger le tube de 2 mL (500 × g, 5 min, rtp) et recueillir le surnageant dans un tube frais de 2 mL sans perturber la pastille cellulaire. Conserver le surnageant à -80 °C pour l’analyse des cytokines et des chimiokines; remettre en suspension la pastille de la cellule dans 200 μL de 1x dPBS.

6. Cytométrie en flux

REMARQUE : Cette section du protocole est reprise directement de la section précédente à l’aide de la suspension de cellule PBMC de l’étape 5.3.3.2. Assurez-vous d’une exposition minimale à la lumière au cours des étapes suivantes de cette section. Un exemple de panneau de marqueurs de coloration de surface se trouve dans le tableau 2.

1. Coloration de surface
   1. Transférer la pastille de cellule PBMC remise en suspension dans une plaque de puits inférieure de 96 V. Centrifuger le lysat à 800 × g pendant 3 min, et retirer le surnageant.
   2. Incuber tous les PBMC (à l’exception des « non colorés ») avec 100 μL d’une tache de viabilité pendant 15 min à rtp. Rechargez jusqu’à 200 μL avec 150 μL de tampon MACS (Magnetic-Activated Cell Sorting). Centrifuger le lysat à 800 × g pendant 3 min, et jeter le surnageant.
   3. Préparer un panel d’anticorps de coloration de surface d’intérêt avec des taux de dilution appropriés et un volume final de 50 μL par réaction (compléter avec un tampon MACS pour obtenir le volume final). Effectuer une coloration de surface en ajoutant 50 μL du mélange d’anticorps préparé aux cellules à l’aide d’une pipette multicanal. Incuber à 4 °C pendant 15 min dans l’obscurité.
   4. Laver en ajoutant 150 μL de tampon MACS. Centrifuger le lysat à 800 × g pendant 3 min, et jeter le surnageant. Si une coloration intracellulaire n’est pas nécessaire, passez directement à l’incubation de 15 minutes à l’étape 6.3.
2. Coloration intracellulaire (si nécessaire)
   1. Ajouter 100 μL d’une solution de fixation et de perméabilisation à chaque puits. Incuber à 4 °C pendant 20 min dans l’obscurité. Complétez les puits avec 100 μL de tampon MACS 1x.
   2. Centrifuger (800 × g, 3 min, 25 °C) et retirer le surnageant. Répétez le lavage en ajoutant 200 μL de 1x tampon de lavage de perméabilisation. Centrifuger (500 × g, 3 min, 25 °C) et retirer le surnageant.
   3. Préparer les dilutions pour le panel d’anticorps d’intérêt afin d’obtenir un volume final de 50 μL en utilisant 1x tampon de lavage de perméabilisation. Incuber sur de la glace pendant 30 min dans l’obscurité. Ajouter 200 μL de 1x tampon de lavage de perméabilisation.
   4. Centrifuger les cellules (800 × g, 3 min, 4 °C) et retirer le surnageant. Remettre en suspension les cellules dans 100 μL de tampon de tri cellulaire activé par fluorescence.
3. Pipeter 200 μL d’une solution de lysage dans chaque puits. Incuber pendant 15 min à rtp. Centrifuger le lysat à 800 × g pendant 3 min et jeter le surnageant.
4. Remettre en suspension les pastilles de cellule dans 200 μL de tampon MACS. Effectuer une cytométrie en flux conformément aux paramètres décrits précédemment¹³, ou stocker à 4 °C dans l’obscurité.

7. Détermination des taux de cytokines et de chimiokines

1. Traiter 25 μL du surnageant de la chambre basale à l’aide d’un test multiplex d’immunologie selon le protocole¹⁸ du fabricant.
2. Calculez la concentration de chaque analyte à l’aide d’un logiciel de gestion multiplex à l’aide d’un algorithme d’ajustement de courbe (5 paramètres) pour la courbe standard.

8. Évaluation de la contamination virale

1. Extraire l’ARN viral à l’aide d’un kit d’extraction sur 4 ensembles de solutions : la solution mère H3N2, la dilution MOI 0.1 pour l’infection, les dilutions série 10x de la MOI 0.1 et le milieu basal des échantillons (infection post-virale 48 et 72 h)¹².
2. Sélectionner le gène non structurel (NS1) et la matrice (M1) comme cibles pour la réaction en chaîne par polymérase (PCR) (voir le tableau des matériaux pour les amorces utilisées dans l’expérience représentative).
3. Effectuer une PCR à transcription inverse (RT-PCR) (42 °C, 60 min) pour convertir l’ARN viral en ADNc avant d’effectuer une PCR quantitative (qPCR) pour mesurer les niveaux de NS1 et M1 comme indicateur de la présence virale, et corréler les niveaux à la courbe standard obtenue à partir de la RT-qPCR effectuée sur la dilution en série 10x de l’aliquote MOI 0,1. Reportez-vous au tableau 3 pour la composition des mélanges réactionnels et utilisez les conditions suivantes: préincubation à 95 °C pendant 10 min, suivie d’une amplification en 3 étapes pendant 40 cycles : 95 °C pendant 10 s, 60 °C pendant 10 s, 72 °C pendant 30 s ; courbe de fusion : 95 °C pendant 10 s, 65 °C pendant 60 s et 97 °C pendant 1 s.

9. Dosage de la plaque

1. Jour 0 : ensemencement de MDCK (Madin Darby Canine Kidney) dans des assiettes de 24 puits
   1. Retirer le milieu d’une fiole T75 de cellules MDCK confluentes. Laver 2x avec 1x PBS pour enlever toute trace de sérum. Trypsiniser les cellules MDCK en ajoutant 10 mL de trypsine et en incubant à 37 °C dans une atmosphère de CO 2 à 5 % pendant₂₀ à 30 min jusqu’à ce que les cellules se détachent.
      REMARQUE: Ne tapez pas sur la fiole car cela pourrait entraîner un agglutination.
   2. Pipettez la suspension cellulaire dans un tube de 15 mL contenant 2 mL de milieu essentiel minimal (EMEM) complet d’Eagle. Centrifuger (300 × g, 5 min, rtp) et retirer le surnageant.
   3. Remettre en suspension les cellules dans 6 mL d’EMEM complet. Comptez les cellules par coloration bleu trypan.
   4. Diluer la suspension de cellules MDCK à une concentration de 1 × 10⁵ cellules/mL, et ensemencer 1 mL de la suspension diluée dans chaque puits d’une plaque stérile de 24 puits. Incuber à 37 °C dans une atmosphère à 5 % de_CO2 pendant 24 h pour obtenir une monocouche confluente de cellules MDCK dans chaque puits.
2. Jour 1 : infection des cellules MDCK
   1. Préparez le milieu d’infection. Retirez le milieu de la monocouche MDCK dans la plaque à 24 puits et lavez 2x avec 1x dPBS. Pour le deuxième lavage, laissez le PBS dans les puits tout en préparant des dilutions en série du virus.
   2. Décongeler les échantillons de virus sur la glace et les diluer en série dans une plaque de 24 puits pour obtenir des dilutions en série de ^10-1 à ^10-6.
      REMARQUE: À titre d’exemple, remplissez chaque puits dans une plaque de 24 puits avec 270 μL de milieu infectieux.
   3. Ajouter 30 μL de l’échantillon de virus au premier puits de la rangée. Avec une nouvelle pointe de pipette, bien mélanger et transférer au puits suivant de la rangée pour diluer l’échantillon de 10x. Procéder jusqu’à ce que la dilution ^10-6 ait été atteinte; effectuer les étapes 9.2.1 à 9.2.3 pour tous les échantillons de virus.
   4. Retirer le PBS de la plaque MDCK et infecter en double exemplaire avec 100 μL des dilutions virales préparées. Pour les puits de contrôle, ajouter 100 μL du milieu infectieux (sans l’échantillon viral). Incuber à 35 °C dans une atmosphère à 5 % de_CO2 pendant 1 h, en agitant la plaque pour éliminer les taches sèches toutes les 15 minutes.
   5. Retirez l’inoculum viral et ajoutez 1 mL de superposition de liquide pour chaque puits. Incuber à 35 °C dans une atmosphère à 5 % de_CO2 pendant 72 h.
3. Jour 4 (72 h après l’infection) : visualisation de la plaque
   1. Retirez la superposition de liquide et fixez les cellules contenant 4% de formaldéhyde dans 1x PBS pendant 1 h. Retirez la solution de formaldéhyde et lavez une fois avec 1x PBS ou de l’eau distillée.
   2. Tacher les cellules fixes en ajoutant une solution de violet cristallin à 1% pendant 15 min. Retirez le colorant violet cristallin et lavez les cellules à l’eau courante. Séchez la plaque à rtp.
   3. Une fois sec, comptez les plaques et calculez le titre viral selon la formule suivante:
      Nombre de plaques × Facteur de dilution = Nombre d’unités de formation de plaque en 100 μL

Résultats

Bien que les lymphocytes T conventionnels forment le principal répertoire de réponse immunitaire adaptative contre l’infection virale pour faciliter la clairance virale, la population innée de lymphocytes T agit sur un spectre plus large pour supprimer la charge virale pour une clairance efficace à un stade ultérieur. Par conséquent, ce protocole crée spécifiquement une condition robuste pour étudier les lymphocytes T innés, leur activation et leur population fonctionnelle apr...

Discussion

Les réponses immunitaires innées contre les virus sont un domaine d’étude sous-étudié dans la gestion antivirale. Les cellules épithéliales des voies respiratoires et les cellules immunitaires innées agissent de concert pour supprimer la réplication virale pendant une infection, en plus de servir de déterminant de la réponse adaptative hyperactive si la charge virale n’est pas maîtrisée 12,13,17. Cependant, le d...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5% Trypsin-EDTA	Gibco	15400-054
0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), pH 8.0, RNase-free	Thermofisher	AM9260G	0.5M EDTA
1.5 mL SafeLock Tubes	Eppendorf	0030120086	1.5mL Centrifuge Tube
10 mL K3EDTA Vacutainer Tubes	BD	366643	10mL Blood Collection Tubes
10x dPBS	Gibco	14200-075
10x PBS	Vivantis	PC0711
12-well Plate	Corning	3513
12-well Transwell Insert	Corning	3460	membrane insert
1x FACS Lysing Solution	BD	349202
2.0 mL SafeLock Tubes	Eppendorf	0030120094	2 mL centrifuge tube
24-well Plate	Corning	3524
24-well Transwell Insert	Corning	3470
3% Acetic Acid with Methylene Blue	STEMCELL Technologies	07060
3,3',5-triiodo-l-thyronine	Sigma	T-074
37% Formaldehyde Solution w 15% Methanol as Stabilizer in H2O	Sigma	533998
5810R Centrifuge	Eppendorf	5811000320
5 mL polypropylene tubes (flow tubes)	BD	352058
70 µm Cell Strainer	Corning	431751
A-4-62 Rotor	Eppendorf	5810709008
Accutase	Gibco	A1110501	Cell Dissociation Reagent
Antibiotic-Antimycotic	Gibco	15240-062
Avicel CL-611	FMC Biopolymer	NA	Liquid Overlay
Bio-Plex Manager 6.2 Standard Software	Bio-Rad Laboratories, Inc	171STND01	Multiplex Manager Software
Butterfly Needle 21 G	BD	367287
Cholera Toxin	Sigma	C8052
Crystal Violet	Merck	C6158
Cytofix/Cytoperm Solution	BD	554722	Fixation and Permeabilization Solution
Dispase II	Sigma	D4693	Neutral Protease
DMEM/High Glucose	GE Healthcare Life Sciences	SH30243.01
DMEM/Nutrient Mixture F-12	Gibco-Invitrogen	11320033
dNTP Mix	Promega	U1515	dNTP Mix
EMEM (w L-Glutamine)	ATCC	30-2003
EVOM voltohmmeter device	WPI, Sarasota, FL, USA	300523
FACS Lysing Solution	BD	349202	1x Lysing Solution
Falcon tube 15 mL	CellStar	188271	15 mL tube
Falcon tube 50 mL	CellStar	227261	50 mL Tube
Fast Start Essential DNA Probes Master	Roche	6402682001	qPCR Master Mix
Ficoll Paque Premium	Research Instruments	17544203	Density Gradient Media
H3N2 (A/Aichi/2/1968)	ATCC	VR547
H3N2 M1 Forward Primer Sequence	Sigma	5'- ATGGTTCTGGCCAGCACTAC-3'
H3N2 M1 Reverse Primer Sequence	Sigma	5'- ATCTGCACCCCCATTCGTTT-3'
H3N2 NS1 Forward Primer Sequence	Sigma	5'- ACCCGTGTTGGAAAGCAGAT-3'
H3N2 NS1 Reverse Primer Sequence	Sigma	5'- CCTCTTCGGTGAAAGCCCTT-3'
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum	Gibco	10500-064
hNESPCs	Human Donors	NA
Human Epithelial Growth Factor	Gibco-Invitrogen	PHG0314
Hydrocortisone	STEMCELL Techonologies	7925	Collected from nasal biopsies during septal deviation surgeries
Insulin	Sigma	I3536
Lightcycler 96	Roche	5815916001	qPCR Instrument
Live/DEAD Blue Cell Stain Kit *for UV Excitation	Thermofisher	L23105	Viability Stain
MILLIPLEX MAP Human Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel II - Premixed 23 Plex	Merck Pte Ltd	HCP2MAG-62K-PX23	Immunology Multiplex Assay
Mitomycin C	Sigma	M4287
M-MLV 5x Buffer	Promega	M1705	RT-PCR 5x Buffer
M-MLV Reverse Transcriptase	Promega	M1706	Reverse Transcriptase
N-2 supplement	Gibco-Invitrogen	17502-048
NIH/3T3	ATCC	CRL1658
Perm/Wash Buffer	BD	554723	Permeabilization Wash Buffer
PneumaCult-ALI 10x Supplement	STEMCELL Techonologies	5001
PneumaCult-ALI Basal Medium	STEMCELL Techonologies	5001
PneumaCult-ALI Maintenance Supplement (100x)	STEMCELL Techonologies	5001
Random Primers	Promega	C1181	Random Primers
Recombinant Rnasin Rnase Inhibitor	Promega	N2511	RNase Inhibitor
RNA Lysis Buffer	Qiagen	Part of 52904
RPMI 1640 (w L-Glutamine)	ATCC	30-2001
STX2 electrodes	WPI, Sarasota, FL, USA	STX2	Electrode
T25 Flask	Corning	430639
T75 Flask	Corning	430641U
TPCK Trypsin	Sigma	T1426
Trypan Blue	Hyclone	SV30084.01
Viral RNA Extraction Kit	Qiagen	52904	Viral RNA Extraction Kit
V-Shaped 96-well Plate	Corning	3894