呼吸器ウイルス感染時の自然免疫細胞活性化研究のための非接触共培養モデル

要約

このプロトコルは、ウイルス感染した鼻上皮細胞と先天性細胞活性化との間の初期の相互作用の調査を詳述する。免疫細胞の個々のサブセットは、ウイルス感染に応答したそれらの活性化に基づいて区別することができる。その後、それらをさらに調査して、早期の抗ウイルス反応に対するそれらの効果を決定することができる。

要約

ウイルス感染中の鼻上皮層と自然免疫細胞との間の初期の相互作用は、依然として未調査の領域である。ウイルス感染における自然免疫シグナル伝達の重要性は、高い先天性T細胞活性化を示す呼吸器感染症の患者がより良い疾患転帰を示すにつれて大幅に増加している。したがって、これらの初期の自然免疫相互作用を解剖することは、それらを支配するプロセスの解明を可能にし、ウイルス感染の早期進行を抑制または予防するための潜在的な治療標的および戦略の開発を促進する可能性がある。このプロトコルは、ウイルス感染気道上皮細胞によって分泌される因子からの自然免疫細胞の早期クロストーク、相互作用、および活性化を研究するために使用できる汎用性の高いモデルを詳述しています。H3N2インフルエンザウイルス(A/Aichi/2/1968)を代表的なウイルスモデルとして用い、共培養末梢血単核球(PBMC)の先天性細胞活性化をフローサイトメトリーを用いて解析し、ウイルス感染に応答して上皮から放出される可溶性因子によって活性化される細胞のサブセットを調べた。この結果は、細胞のサブセットを分化させるためのゲーティング戦略を実証し、PBMCの活性化集団と、対照および感染した上皮とのクロストークとの間の明確な違いを明らかにした。活性化されたサブセットをさらに分析して、それらの機能および細胞に特異的な分子変化を決定することができる。このようなクロストーク調査からの知見は、ウイルス感染の進行を制御および抑制するのに有益である重要な先天性細胞集団の活性化に重要な因子を明らかにする可能性がある。さらに、これらの要因は、異なるウイルス疾患、特に新たに出現したウイルスに普遍的に適用され、そのようなウイルスが素朴なヒト集団で最初に循環するときの影響を和らげることができる。

概要

呼吸器ウイルスは、おそらく深刻な医療と経済的負担を引き起こす最も広範な病原体の1つです。新興流行株(H1N1、H5N1、H3N2、MERS、COVID-19など)の定期的な世界的な流行から、毎年のインフルエンザの季節性株まで、ウイルスは公衆衛生にとって絶え間ない脅威です。ワクチンは、これらの世界的な公衆衛生上の課題に対する対応の主な部分を占めていますが、これらの対策が単に応答性が高いことに注意するのは冷静です^1,2。さらに、新しい感染株の出現とそのワクチンの開発の成功との間の遅れは避けられず³、ウイルスの拡散を抑制するために利用可能な措置が非常に限られている期間につながる。

これらの遅れは、社会経済的および社会的に負わされるコストによってさらに強調されています。季節性インフルエンザだけでも、米国では年間約80億ドルの間接費、32億ドルの医療費、363万人の死亡の原因^{となっています4}。これは、ワクチン開発に資金を提供するために必要な研究費を考慮する前のことです。重症急性呼吸器症候群コロノウイルス2(SARS-CoV-2)^5,6,7

プロトコル

メモ: このプロトコルで使用されるメディアのレシピについては、 表 1 を参照してください。
注:12ウェルトランスウェルで増殖したhNECSは、インフルエンザウイルスに感染すると可溶性因子が基底チャンバーに容易に到達するために、より最適な厚さに成長することが分かっている。したがって、共培養には12ウェルサイズのトランスウェルの使用が推奨されます。

1. 3T3フィーダ層の確立

1. 冷凍在庫からの設立
   1. 凍結ストックからNIH/3T3線維芽細胞の凍結卵を解凍する。クライオビアルの内容物を2mLの完全ダルベッコ最小必須培地(DMEM)に加え、細胞を再懸濁する。
   2. 300 × g および室温/圧力(rtp)で5分間遠心分離し、上清を除去する。完全なDMEMで細胞を再懸濁する。
   3. トリパンブルー染色を用いて細胞を計数する。再懸濁した細胞懸濁液10 μLに10 μLのトリパンブルーを加える。十分に混合し、懸濁液10μLを血球計数器に加えて細胞を計数する。
   4. 適切な培養皿(例えば、T75フラスコ)中の1×¹⁰⁴ 細胞/^cm2 の密度の種子細胞。得られた培養フラスコを5%CO2雰囲気中37°Cで3日間インキュベー_トする 。
2. マイトマ....

結果

従来のT細胞はウイルス感染に対する適応免疫応答の主なレパートリーを形成してウイルスクリアランスを促進するが、先天的T細胞集団はより広いスペクトルにわたって働き、後の段階で効果的なクリアランスのためにウイルス負荷を抑制する。したがって、このプロトコルは、同じドナーからの上皮および免疫細胞サンプルを必要とせずに、インフルエンザ感染後?.......

ディスカッション

ウイルスに対する自然免疫応答は、抗ウイルス管理における研究の過小評価されている分野です。気道上皮細胞と自然免疫細胞は、ウイルス量がチェックにとどまらない場合、過活動適応応答の決定因子として機能するだけでなく、感染中のウイルス複製を抑制するために協調して働く^12,13,17。しかしながら、適切な抗ウ?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5% Trypsin-EDTA	Gibco	15400-054
0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), pH 8.0, RNase-free	Thermofisher	AM9260G	0.5M EDTA
1.5 mL SafeLock Tubes	Eppendorf	0030120086	1.5mL Centrifuge Tube
10 mL K3EDTA Vacutainer Tubes	BD	366643	10mL Blood Collection Tubes
10x dPBS	Gibco	14200-075
10x PBS	Vivantis	PC0711
12-well Plate	Corning	3513
12-well Transwell Insert	Corning	3460	membrane insert
1x FACS Lysing Solution	BD	349202
2.0 mL SafeLock Tubes	Eppendorf	0030120094	2 mL centrifuge tube
24-well Plate	Corning	3524
24-well Transwell Insert	Corning	3470
3% Acetic Acid with Methylene Blue	STEMCELL Technologies	07060
3,3',5-triiodo-l-thyronine	Sigma	T-074
37% Formaldehyde Solution w 15% Methanol as Stabilizer in H2O	Sigma	533998
5810R Centrifuge	Eppendorf	5811000320
5 mL polypropylene tubes (flow tubes)	BD	352058
70 µm Cell Strainer	Corning	431751
A-4-62 Rotor	Eppendorf	5810709008
Accutase	Gibco	A1110501	Cell Dissociation Reagent
Antibiotic-Antimycotic	Gibco	15240-062
Avicel CL-611	FMC Biopolymer	NA	Liquid Overlay
Bio-Plex Manager 6.2 Standard Software	Bio-Rad Laboratories, Inc	171STND01	Multiplex Manager Software
Butterfly Needle 21 G	BD	367287
Cholera Toxin	Sigma	C8052
Crystal Violet	Merck	C6158
Cytofix/Cytoperm Solution	BD	554722	Fixation and Permeabilization Solution
Dispase II	Sigma	D4693	Neutral Protease
DMEM/High Glucose	GE Healthcare Life Sciences	SH30243.01
DMEM/Nutrient Mixture F-12	Gibco-Invitrogen	11320033
dNTP Mix	Promega	U1515	dNTP Mix
EMEM (w L-Glutamine)	ATCC	30-2003
EVOM voltohmmeter device	WPI, Sarasota, FL, USA	300523
FACS Lysing Solution	BD	349202	1x Lysing Solution
Falcon tube 15 mL	CellStar	188271	15 mL tube
Falcon tube 50 mL	CellStar	227261	50 mL Tube
Fast Start Essential DNA Probes Master	Roche	6402682001	qPCR Master Mix
Ficoll Paque Premium	Research Instruments	17544203	Density Gradient Media
H3N2 (A/Aichi/2/1968)	ATCC	VR547
H3N2 M1 Forward Primer Sequence	Sigma	5'- ATGGTTCTGGCCAGCACTAC-3'
H3N2 M1 Reverse Primer Sequence	Sigma	5'- ATCTGCACCCCCATTCGTTT-3'
H3N2 NS1 Forward Primer Sequence	Sigma	5'- ACCCGTGTTGGAAAGCAGAT-3'
H3N2 NS1 Reverse Primer Sequence	Sigma	5'- CCTCTTCGGTGAAAGCCCTT-3'
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum	Gibco	10500-064
hNESPCs	Human Donors	NA
Human Epithelial Growth Factor	Gibco-Invitrogen	PHG0314
Hydrocortisone	STEMCELL Techonologies	7925	Collected from nasal biopsies during septal deviation surgeries
Insulin	Sigma	I3536
Lightcycler 96	Roche	5815916001	qPCR Instrument
Live/DEAD Blue Cell Stain Kit *for UV Excitation	Thermofisher	L23105	Viability Stain
MILLIPLEX MAP Human Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel II - Premixed 23 Plex	Merck Pte Ltd	HCP2MAG-62K-PX23	Immunology Multiplex Assay
Mitomycin C	Sigma	M4287
M-MLV 5x Buffer	Promega	M1705	RT-PCR 5x Buffer
M-MLV Reverse Transcriptase	Promega	M1706	Reverse Transcriptase
N-2 supplement	Gibco-Invitrogen	17502-048
NIH/3T3	ATCC	CRL1658
Perm/Wash Buffer	BD	554723	Permeabilization Wash Buffer
PneumaCult-ALI 10x Supplement	STEMCELL Techonologies	5001
PneumaCult-ALI Basal Medium	STEMCELL Techonologies	5001
PneumaCult-ALI Maintenance Supplement (100x)	STEMCELL Techonologies	5001
Random Primers	Promega	C1181	Random Primers
Recombinant Rnasin Rnase Inhibitor	Promega	N2511	RNase Inhibitor
RNA Lysis Buffer	Qiagen	Part of 52904
RPMI 1640 (w L-Glutamine)	ATCC	30-2001
STX2 electrodes	WPI, Sarasota, FL, USA	STX2	Electrode
T25 Flask	Corning	430639
T75 Flask	Corning	430641U
TPCK Trypsin	Sigma	T1426
Trypan Blue	Hyclone	SV30084.01
Viral RNA Extraction Kit	Qiagen	52904	Viral RNA Extraction Kit
V-Shaped 96-well Plate	Corning	3894