Solunum Virüsü Enfeksiyonu Sırasında Doğuştan İmmün Hücre Aktivasyonunun İncelenmesi için Temassız Ko-Kültür Modeli

Özet

Bu protokol, viral olarak enfekte olmuş nazal epitel hücreleri ile doğuştan gelen hücre aktivasyonu arasındaki erken etkileşimlerin araştırılmasını detaylandırır. Bağışıklık hücrelerinin bireysel alt kümeleri, viral enfeksiyonlara yanıt olarak aktivasyonlarına göre ayırt edilebilir. Daha sonra erken antiviral yanıtlar üzerindeki etkilerini belirlemek için daha fazla araştırılabilirler.

Özet

Viral enfeksiyonlar sırasında nazal epitel tabakası ile doğuştan gelen bağışıklık hücreleri arasındaki erken etkileşimler henüz keşfedilmemiş bir alan olmaya devam etmektedir. Viral enfeksiyonlarda doğuştan gelen bağışıklık sinyalizasyonunun önemi, yüksek doğuştan gelen T hücresi aktivasyonu sergileyen solunum yolu enfeksiyonlu hastalar daha iyi bir hastalık sonucu gösterdiğinden önemli ölçüde artmıştır. Bu nedenle, bu erken doğuştan gelen bağışıklık etkileşimlerini parçalara ayırmak, onları yöneten süreçlerin aydınlatılmasına izin verir ve viral enfeksiyonların erken ilerlemesini azaltmak veya hatta önlemek için potansiyel terapötik hedeflerin ve stratejilerin geliştirilmesini kolaylaştırabilir. Bu protokol, viral olarak enfekte olmuş hava yolu epitel hücreleri tarafından salgılanan faktörlerden doğuştan gelen bağışıklık hücrelerinin erken çapraz etkileşimini, etkileşimlerini ve aktivasyonunu incelemek için kullanılabilecek çok yönlü bir modeli detaylandırır. Temsili virüs modeli olarak bir H3N2 influenza virüsü (A / Aichi / 2 / 1968) kullanılarak, viral enfeksiyona yanıt olarak epitelden salınan çözünür faktörler tarafından aktive edilen hücrelerin alt kümelerini araştırmak için ko-kültürlü periferik kan mononükleer hücrelerinin (PBMC'ler) doğuştan gelen hücre aktivasyonu analiz edilmiştir. Sonuçlar, hücrelerin alt kümelerini ayırt etmek için geçit stratejisini göstermektedir ve PBMC'lerin aktive olmuş popülasyonları ile kontrol ve enfekte epitel ile çapraz etkileşimleri arasındaki açık farklılıkları ortaya koymaktadır. Aktive edilen alt kümeler daha sonra fonksiyonlarını ve hücrelere özgü moleküler değişiklikleri belirlemek için daha fazla analiz edilebilir. Böyle bir çapraz konuşma araştırmasından elde edilen bulgular, viral enfeksiyonun ilerlemesini kontrol etmede ve bastırmada yararlı olan hayati doğuştan gelen hücre popülasyonlarının aktivasyonu için önemli olan faktörleri ortaya çıkarabilir. Dahası, bu faktörler evrensel olarak farklı viral hastalıklara, özellikle de yeni ortaya çıkan virüslere, bu tür virüslerin naif insan popülasyonlarında ilk dolaşıma girdiklerinde etkilerini azaltmak için uygulanabilir.

Giriş

Solunum yolu virüsleri belki de ciddi sağlık ve ekonomik yüke neden olan en yaygın patojenler arasındadır. Ortaya çıkan salgın suşların (örneğin, H1N1, H5N1, H3N2, MERS, COVID-19) periyodik küresel salgınlarından, her yıl mevsimsel grip suşlarına kadar, virüsler halk sağlığı için sürekli bir tehdittir. Her ne kadar aşılar bu küresel halk sağlığı sorunlarına verilen yanıtın ana kütlesini oluştursa da, bu karşı önlemlerin sadece ^1,2'ye yanıt verdiğini belirtmek ^{ayıltıcıdır}. Ayrıca, yeni bir bulaşıcı suşun ortaya çıkması ile aşısının başarılı bir şekilde geliştirilmesi arasındaki gecikme kaçınılmazdır³ ve virüsün yayılmasını engellemek için mevcut önlemlerin oldukça sınırlı olduğu bir döneme yol açmaktadır.

Bu gecikmeler, ekonomik ve sosyal olarak topluma uygulanan maliyetlerle daha da vurgulanmaktadır. Sadece mevsimsel grip, dolaylı maliyetlerde yaklaşık 8 milyar dolardan, tıbbi maliyetlerde 3,2 milyar dolardan ve Amerika Birleşik Devletleri'nde yılda 36,3 bin ölümden sorumludur⁴. Bu, aşı geliştirmeyi finanse etmek için gerekli olan araştırma maliyetlerini dikkate almadan öncedir. Epidemik salgınlar, şiddetli akut solunum sendromu koronovirüs 2'nin (SARS-CoV-2) ortaya çıkması ve hızla yayılmasının neden olduğu küresel bozulmaların kanıtladığı gibi, her yıl artan küreselleşme hızıyla birleştiğinde, toplum üzerinde daha da ciddi etkilere ^{sahiptir5,6,7}.

Son zamanlarda yapılan çalışmalar, daha fazla aktive olmuş doğuştan gelen T hücresi popülasyonuna sahip enfekte hastaların daha iyi bir hastalık sonucuna sahip olma eğiliminde olduğunu göstermiştir ^8,9,10. Ayrıca, doğuştan gelen T hücresi popülasyonu birden fazla alt gruba ayrılır: mukozal ilişkili değişmez T (MAIT) hücreleri, Vδ1 γδ T hücreleri, Vδ2 γδ T hücreleri ve doğal öldürücü T (NKT) hücreleri. Doğuştan gelen T hücrelerinin bu alt grupları da popülasyonlarında heterojenlik sergiler ve doğuştan gelen bağışıklık tepkisinde yer alan hücre popülasyonları arasındaki etkileşimlerin karmaşıklığını arttırır¹¹. Bu nedenle, bu doğuştan gelen T hücrelerini aktive eden mekanizma ve doğuştan gelen T hücrelerinin spesifik alt gruplarının bilgisi, özellikle aşı geliştirme döneminde, bu virüslerin insan konakçısı üzerindeki bulaşıcı etkilerini azaltmak için farklı bir araştırma yolu sağlayabilir.

İnfluenza ile enfekte olmuş epitel hücreleri, doğuştan gelen T hücrelerini hızla aktive eden faktörler üretir^12,13,14. Bu bulguya dayanarak, bu temassız Hava-Sıvı Arayüzü (ALI) ortak kültür modeli, erken enfeksiyon sırasında enfekte burun epitel tabakası ile PBMC'ler arasındaki erken kimyasal etkileşimleri (enfekte epitel tabakası tarafından salınan çözünür faktörlerin aracılık ettiği) taklit etmeyi amaçlamaktadır. Nazal epitel tabakası (membran eklerinde kültürlenmiş) ve PBMC'ler (altındaki odada) arasındaki fiziksel ayrım ve epitel bütünlüğü, PBMC'lerin virüs tarafından doğrudan enfeksiyonunu önler ve epitel kaynaklı çözünür faktörlerin PBMC'ler üzerindeki etkilerinin ayrıntılı bir şekilde incelenmesini sağlar. Bu nedenle, tanımlanan faktörler, influenza enfeksiyonuna karşı koruyabilecek uygun doğuştan gelen T hücresi popülasyonunu indüklemede terapötik potansiyelleri açısından daha fazla araştırılabilir. Bu nedenle bu yazıda, epitel kaynaklı çözünür faktörlerden doğuştan gelen T-hücresi aktivasyonunun incelenmesi için bir ko-kültür oluşturma yöntemleri ayrıntılı olarak açıklanmıştır.

Protokol

NOT: Bu protokolde kullanılan ortam tarifleri için Tablo 1'e bakın.
NOT: 12 kuyucuklu transwell'de yetiştirilen hNECS'in, Influenza virüsü ile enfekte olduğunda çözünür faktörlerin bazal odaya kolayca ulaşması için daha optimal kalınlığa dönüştüğü bulunmuştur. Bu nedenle, ko-kültür için 12 iyi boyutlu transwell kullanılması önerilir.

1. 3T3 besleyici katmanının kurulması

1. Dondurulmuş stoklardan kuruluş
   1. Dondurulmuş stoklardan bir kriyov / 3T3 fibroblastı çözün. Kriyovalin içeriğini 2 mL'lik tam Dulbecco'nun Minimal Esansiyel Ortamına (DMEM) ekleyin ve hücreleri yeniden askıya alın.
   2. 300 × g ve oda sıcaklığı/basıncında (rtp) 5 dakika santrifüj yapın ve süpernatanı çıkarın. Hücreleri tam DMEM'de yeniden askıya alın.
   3. Tripan mavisi boyama kullanarak hücreleri sayın. Yeniden askıya alınmış hücre süspansiyonunun 10 μL'sine 10 μL tripan mavisi ekleyin. İyice karıştırın ve hücreleri saymak için süspansiyonun 10 μL'sini bir hemositometreye ekleyin.
   4. 1 × 10⁴ hücre/^cm2 yoğunluktaki tohum hücreleri, uygun bir kültür kabında (örneğin, T75 şişesi). Elde edilen kültür şişesini% 5 CO 2 atmosferinde 37 ° C'de 3 gün boyunca_inkübe edin.
2. Mitomisin C tedavisi
   1. 3 günde, akıcılığın% 60 -% 80 olduğundan emin olun, ortamı çıkarın ve hücreleri 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın.
      NOT: 3T3 besleyici katmanının tam akıcılığa ulaşmaması önemlidir; aksi takdirde, mitomisin C tedavisi etkili olmayacaktır.
   2. Mitomisin C takviyeli tam DMEM'i şişeye ekleyin ve% 5 CO₂ atmosferinde 37 ° C'de 3.5 saat boyunca inkübe edin. Mitomisin C içeren ortamı çıkarın ve hücreleri 2x 1x PBS ile yıkayın.
3. 3T3 hücrelerinin 6 delikli plakalara ekilmesi
   1. Hücreleri ayırmak için şişeye 3-5 dakika boyunca 3 mL 1x tripsin-EDTA ekleyin. İlişkisiz hücreleri taze bir 15 mL tüpte toplayın. 15 mL tüpü 300 × g, rtp'de 5 dakika boyunca santrifüj yapın; süpernatantı atın. Hücreleri tam DMEM'de yeniden askıya alın.
   2. Tripan mavisi boyama kullanarak hücreleri sayın. Hücreleri 7.5 × 10 5-2.5 × 10 6 hücre / kuyuda 6 delikli bir^plakaya tohumlayın. Plakayı gece boyunca 37 ° C'de% 5 CO 2 atmosferinde_inkübe edin.
      NOT: 3T3 besleyici katmanı, hücreler sağlıklıysa hazır olarak kabul edilir. Bu noktada, insan burun epitel kök / progenitör hücrelerini (hNESPC'ler) genişleme için besleyici tabakaya tohumlayın.
   3. Şişeye Tam DMEM ekleyin ve mitomisin C tedavisinden iyileşmek için 3T3 hücreleri için gece boyunca% 5 CO² olan 37 ° C'de inkübe edin.

2. İnsan nazal epitel hücresi (hNEC) kültürünün oluşturulması

NOT: Üst solunum yolu enfeksiyonu semptomları olmayan hastalardan klinik örnekler alınmalıdır.

1. Burun dokusunun tek hücreli süspansiyona işlenmesi
   1. Burun dokusunu, 100 μL / mL antibiyotik-antimikotik karışım içeren 1x Dulbecco PBS (dPBS) (Mg 2⁺ ve Ca^{2 +} olmadan PBS) içinde yıkayın. Dokuyu küçük parçalar halinde kesin ve numuneyi 4 ° C'de gece boyunca sallayarak 10 mg / mL'lik nötr bir proteaz içinde tedavi edin.
   2. 200 × g'da 5 dakika santrifüj yapın ve santrifüjlemeden sonra süpernatantı çıkarın. Peleti 1-2 mL 1x tripsin-EDTA (37 ° C, 15 dakika) içinde inkübe edin ve tüpteki hacmin% 10'una eşit bir fetal sığır serumu hacmi ekleyerek söndürün.
   3. Sindirilen dokuyu pipetleme yoluyla mekanik olarak tek hücreli agregalara ayırın ve ardından elde edilen süspansiyonu 70 μm'lik bir hücre süzgecinden geçirin. Hücreleri tam DMEM'de yeniden askıya alın.
      NOT: Bu adımdan sonra, hücre süspansiyonu, insan burun epitel kök / progenitör hücreleri (hNESPC'ler) olarak adlandırılan terminal olarak farklılaşmış hücrelerin ve kök hücrelerin bir karışımıdır. Sonraki adımların amacı, farklı hücre popülasyonlarının karışımından hNESPC popülasyonunu seçmek ve zenginleştirmektir.
2. hNESPC'lerin seçimi için 3T3 besleyici katmanına tek hücreli bir süspansiyonun tohumlanması
   1. Hücre süspansiyonunu adım 2.1.3'ten (300 × g, 5 dakika, rtp) santrifüj edin ve süpernatanı çıkarın. Hücreleri 3-5 mL'lik orta 3'te yeniden askıya alın.
      NOT: Orta 3, hNESPC'lerin seçici büyümesini teşvik etmek için formüle edilmiştir.
   2. Tripan mavisi boyama yoluyla hücreleri sayın. 6 kuyucuklu plakadaki ortamı çıkardıktan sonra hazırlanmış 3T3 besleyici tabakayı içeren 6 delikli plaka üzerine kuyucuk başına 2mL'lik orta^{3 hücrede} 1 x 10 6 hücreyi tohumlayın. Elde edilen ko-kültürü %5 CO 2 atmosferinde 37 °C'de_inkübe edin.
      NOT: Tohumlamadan sonra, hNESPC'lerin bağlanmasını etkileyeceğinden plakayı çalkalamamaya dikkat edin.
   3. Eski ortamı tamamen çıkarıp taze ortam 3 ile değiştirerek her 2-4 günde bir ortam 3'ü (2 mL) değiştirin.
      NOT: Besin maddelerini yenilemek ve aşırı asidik koşulların hNESPC'lerin büyümesini olumsuz yönde etkilemesini önlemek için ortam değiştirilir. Her ortam değişimi arasındaki aralık, ortamın ne kadar asidik (sarı) hale geldiğine bağlıdır. Ortam hızlı bir şekilde asidik hale gelirse aralıklar kısaltılmalıdır.
   4. 7-10 gün sonra, hNESPC'lerin membran eklerine aktarılması için uygun bir akıcılıkta olduğunu gözlemleyin. hNESPC'lerin 3 farklı zaman noktasında (2 gün, 5 gün ve 10 gün) temsili morfolojisi için Şekil 1'e bakın.
3. hNESPC'lerin membran kesici uçlara aktarılması
   NOT: Mitomisin C işlemi nedeniyle, 3T3 besleyici tabakası hNESPC genişleme periyodu boyunca yavaşça bozulacaktır. Bu, kuyunun yüzeyine zayıf bir yapışma ile sonuçlanacak ve bir pipetle kızararak yerinden çıkmalarına izin verecek ve sadece sağlıklı hNESPC'leri geride bırakacaktır.
   1. Ortamı çıkarın ve her bir kuyucuğa 500 μL 1x dPBS ekleyin. 3T3 hücrelerini yerinden çıkarmak için hücreleri 3 kat mikropipetle yıkayın ve 1x dPBS'yi atın. Mikroskop altında, iğ şeklindeki 3T3 besleyici tabakası yerinden çıkarken yuvarlak hNESPC'lerin kaldığını gözlemleyin.
   2. Kuyu başına 500 μL hücre ayrışma reaktifi ekleyin ve 37 ° C'de % 5 CO₂ atmosferinde 5-10 dakika boyunca veya hNESPC'ler kuyu yüzeyinden ayrılana kadar inkübe edin.
   3. hNESPC süspansiyonunu, santrifüjü (300 × g, 5 dakika, rtp) toplayın ve süpernatanı çıkarın.
   4. Peleti orta 3'te yeniden askıya alın. Tripan mavisi boyama yoluyla hücreleri sayın. Tohum 3×, membran eki başına 150 μL orta 3 (²⁴ delikli plaka) içinde 10 4 hücre veya membran eki başına 300 μL orta 3 (12 delikli plaka) içinde 1 × 10⁵ hücre (Şekil 2). Hücreleri% 5'lik bir CO 2 atmosferinde 37 ° C'de_inkübe edin.
   5. Her 2 günde bir apikal ve bazal odaların ortamını (orta 3) değiştirin. Bazal hazneye erişmek için membran ucunun destek kolları arasında bir pipet ucunda gezinin, eski ortamı çıkarın ve ardından aynı yöntemle taze ortamı yeniden takın. Apikal odaya kolayca erişilebilmesine rağmen, büyüyen hNESPC tabakasını rahatsız etmemeye dikkat edin.
      NOT: Hücrelerin membrana yapışması için zamana ihtiyaç duyduğundan, tohumlamadan sonra apikal odadaki ortamı en az 2 gün boyunca rahatsız etmeyin.
4. hNESPC'lerin hNEC'lere farklılaşması
   1. hNESPC'ler %100 akıcılığa ulaştığında (membran ekinde tohumlamadan yaklaşık 3-7 gün sonra), ALI kültürünü başlatın. Bazal ortamı farklılaşma ortamına değiştirin ve ortamı apikal odadan çıkarın. Ortam her 2-3 günde bir değiştirirken, Şekil 3 ve adım 2.3.5'te belirtildiği gibi, apikal odaya eklemeden sadece bazal odaya orta ekleyin.
      NOT: Ortam, hNESPC'lerin ALI'deki hNEC'lere farklılaşmasını teşvik etmek için farklılaştırma ortamına dönüştürülür. hNESPC'lerin ALI'de hNEC olmak için tam olgunluğa ulaşması yaklaşık 3-4 hafta sürer, bu noktada hücreler her katmanda farklı hücre popülasyonları ile çok katmanlı bir şekilde büyümüş olur. Kirpikler ayrıca 400x'lik bir büyütmede de gözlenmelidir (kirpikler, mikroskop alanının titreşiyormuş gibi görünmesine neden olan dayak hareketleriyle tanımlanabilir). Bu noktada, hücreler ko-kültür deneyleri için kullanılmaya hazırdır. Tamamen farklılaştırılmış bir hNEC katmanının kesiti için Şekil 4'e bakın.
   2. Olgun hNEC'ler elde ettikten sonra, ko-kültür deneyinden önce 1 hafta boyunca 2-3 günlük aralıklarla apikal oda 3x'teki hücreleri 1x dPBS ile yıkayın. Yıkama adımını bazal ortam değişiklikleri ile sinerjik hale getirin ve yıkamaları aşağıdaki gibi yapın.
      1. Membran ekinin apikal odasına 50 μL (24 kuyulu)/150 μL (12 kuyulu) 1x dPBS ekleyin ve hücreleri 10 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Farklılaşma sırasında biriken mukus ve ölü hücreleri çıkarmak için 10 dakikalık inkübasyondan sonra dPBS'yi çıkarın.
         NOT: Deneyin niteliğine bağlı olarak, mukus tabakasını tamamen yıkamak için sodyum bikarbonat çözeltisi kullanılabilir. Bununla birlikte, ko-kültür deneylerinde viral enfeksiyon için, mukus tabakası korunur ve dPBS yıkama ile sadece fazla mukus çıkarılır. Bu retansiyon, gelen viral enfeksiyonla etkileşime girecek olan nazal epitelde bulunan fizyolojik mukus tabakasını taklit etmektir.

3. Transepitelyal elektrik direnci (TEER) ölçümü

NOT: Epitel bütünlüğünün doğrulanması, sağlam ve sağlıklı bir epitel tabakasının elde edilmesini sağlamak için önemlidir. Sağlam bir epitel tabakası, bir voltohmmetre kullanılarak 4 rastgele kuyu üzerinde gerçekleştirilen TEER ölçümü ile belirlenir.

1. Elektrotu% 70 etanol ile durulayın ve steriliteyi sağlamak için kullanmadan önce 15 dakika boyunca ultraviyole ışıkla sterilize edin. Sterilizasyondan sonra 1x dPBS ile durulayın.
2. Membran ekinin apikal odasına 100 μL (24 kuyucuk için) veya 300 μL (12 delikli için) 1x dPBS ekleyin. Plakayı 10 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin; ardından dPBS'yi kaldırın.
3. Ölçülecek her kuyu için, önceden ısıtılmış (37 ° C'ye kadar) farklılaşma ortamının 1 mL (24 kuyucuk için) veya 3 mL (12 kuyucuk için) ile kullanılmayan bir kuyu hazırlayın. Membran ekini hazırlanan kuyuya yerleştirin ve apikal odaya 200 μL (24 kuyucuk için) veya 600 μL (12 kuyucuk için) önceden ısıtılmış farklılaşma ortamı ekleyin. 15 dakika boyunca 37 ° C'de denge (eklenen virüs türünün kuluçka sıcaklığına bağlı olarak, örneğin, İnfluenza için 35 ° C).
   NOT: TEER'in hesaplanması için aynı şekilde boş (boş membran girişi) hazırlayın.
4. Önceden ısıtılmış farklılaşma ortamının 15 mL'lik bir tüpünü de aynı sıcaklıkta 15 dakika boyunca dengeleyin. Elektrotları 15 mL tüpe yerleştirin ve voltohmmetreyi açın.
   NOT: Bu noktada, elektrotlar aynı ortamda olduğu için okuma 0 direnç olmalıdır. Başka bir okuma elde edilirse, okuma 0 olana kadar 15 mL tüpteki elektrodu dengeleyin.
5. Boşluktan başlayarak, elektrotları her bir kuyucuğa, bir elektrot apikal oda ortamına, diğeri bazal oda ortamına batırılacak şekilde konumlandırın. Okumayı yalnızca en az 5 dakikalık bir süre boyunca sürekli bir okuma elde edildiğinde kaydedin.
6. Her ölçümden sonra, bir sonraki ölçümden önce elektrodu PBS ile yıkayın. İyi test edilen her bir numune için, membranın farklı konumlarında üç numune için ölçümler yapın. Her numunenin net TEER'sini hesaplamak için, boş membran eki tarafından verilen arka plan direncini her ölçümden çıkarın.
7. Aşağıdaki denklemi kullanarak bir kuyu için toplam TEER okumasını hesaplayın:
   Epitel Bütünlüğü (Ωcm²) = Net TEER (ohm) × Membran Alanı (^cm2)
   NOT: Viral enfeksiyon deneyleri için hNEC'lerin TEER değerleri >1000 Ωcm^213,15,16 olmalıdır. 

4. Periferik kan monositlerinin ve NK hücrelerinin izolasyonu

NOT: Kan örnekleri sağlıklı gönüllülerden alınmalı ve izolasyonun aynı gününde kullanılmalıdır.

1. 10 mL kan alma tüplerinde her donörden 30-40 mL tam kan toplayın.
2. PBMC'leri yoğunluk gradyanı santrifüjleme kullanarak izole edin ve aşağıdaki adımlardan sonra PBMC'leri buffy kattan elde edin (ayrıca Malzeme Tablosu'na bakın).
   1. Eşit hacimli dengeli tuz çözeltisi (PBS) ile seyreltmeden önce kan toplama tüpünden ~ 10 mL kanı bir vakumlayıcıda iyice karıştırın.
   2. 50 mL'lik bir tüpün tabanına 15 mL yoğunluk gradyanı ortamı ekleyin.
      NOT: Yoğunluk gradyanı ortamının seyreltilmiş kana oranı 2:3-3.5 olmalıdır.
   3. Tüpü 45° eğerek ve seyreltilmiş kanın tüpün iç duvarına damla damla düşmesine izin vererek bir pipet tabancası ile yoğunluk gradyanı ortamında (dağıtım ayarı mümkün olan en düşük seviyeye ayarlanmış) 35 mL seyreltilmiş kan tabakası, böylece yoğunluk gradyan ortamının tabakası bozulmaz.
   4. Santrifüj lizatı 500 × g, 18-20 °C'de 30 dakika boyunca (fren: kapalı). Alt tabakayı rahatsız etmeden üst plazma tabakasını dikkatlice çıkarın ve atın.
   5. Buffy ceketi, kırmızı kan hücresi tabakasını, gradyan yoğunluğu orta tabakasını veya buffy ceketini karıştırmadan yeni bir tüpe aktarın. Buffy ceket yeni bir 50 mL tüpte toplandıktan sonra, hacmi 1x PBS ile 50 mL'ye yükseltin.
   6. Santrifüj, 800 × g, 18-20 °C, 8 dakika (fren: kapalı) hızında lizat yapın ve süpernatantı bir pipet tabancasıyla çıkarın. Hücre peletini 50 mL 1x PBS ile yeniden askıya alın ve trombositleri çıkarmak için 120 × g, 18-20 ° C, 10 dakika santrifüj yapın.
   7. Süpernatantı pipetleyerek, hücre peletini rahatsız etmeden atın.
      NOT: Hücre peleti gevşek olabileceğinden, süpernatantın dökülerek atılması tavsiye edilmez.
   8. Hücre peletini tam RPMI (Roswell Park Memorial Institute) ortamı ile yeniden askıya alın. Yeniden askıya alınan hücre süspansiyonunun 10 μL'sine metilen mavisi ile% 3 asetik asitten 10 μL ekleyerek bir hücre sayımı yapın. İyice karıştırın ve hücreleri saymak için karışımın 10 μL'sini bir hemositometreye ekleyin.
3. Tam RPMI ortamına sahip PBMC'leri 2 × 10 6/mL (24 kuyucuk için) veya 4 × 10⁶/mL (12 kuyucuk için) yoğunluğa kadar seyreltin.

5. hNEC Viral enfeksiyon ve hNEC'ye geçiş: PBMC ko-kültürü

NOT: H3N2 (A/Aichi/2/1968) bu protokolde enfeksiyonun temsili suşu olarak kullanılmıştır. Bu protokolde temsili MOI olarak 0.1 enfeksiyon çokluğu (MOI) kullanılmıştır.

1. 0. Gün (hNEC'lerin enfeksiyonu)
   NOT: Aynı donörden yetiştirilen hNEC'lerden bir kuyu, deneyde kullanılan her kuyu için temsili bir hücre sayısı elde etmek için kullanılır.
   1. Temsili kuyuda, membran ekinin apikal odasına 150 μL 1x tripsin-EDTA ve bazal odaya 350 μL 1x tripsin-EDTA ekleyin ve 10 dakika boyunca veya hücreler zardan ayrılana kadar 37 ° C'de inkübe edin.
   2. Membran üzerindeki hücreleri yukarı ve aşağı pipetleyerek yıkayın ve süspansiyonu 1,5 mL'lik bir santrifüj tüpünde toplayın. Tripsin aktivitesini söndürmek için 200 μL tam DMEM ekleyin. Kuyucuk başına hücre sayısını elde etmek için tripan mavisi boyama yoluyla hücreleri sayın.
   3. Kuyucuk başına hücre sayısına göre virüsün gerekli MOI'sini hesaplayın ve virüs stokunu buz üzerinde tam RPMI ile buna göre seyreltin.
      NOT: MOI 0.1 × 10 kuyu başına⁶ hNEC = 1.26 × 30 μL'de kuyu başına 10⁵ H3N2 viral partikül (24 kuyucuk için)/100 μL (12 kuyucuk için)
   4. Enfeksiyon deneyi için kalan kuyucuklar için, membran eklerinin apikal odalarına 50 μL (24 kuyucuk için) / 150 μL (12 kuyucuk için) 1x dPBS ekleyin, 10 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin ve 1x dPBS'yi çıkarın.
   5. Membran uçlarındaki bazal ortamı, uçları kuyucuklara tam RPMI eklenmiş yeni bir plakaya aktararak RPMI ortamını tamamlamak için değiştirin (350 μL (24 delikli için)/700 μL (12 delikli için)).
      NOT: hNESPC'ler hNEC'lere tamamen farklılaştığında, ortam RPMI 12'ye geçirildiğinde morfolojide veya organizasyonda herhangi bir değişiklik olmadan,⁷² saate kadar farklı ortamlara toleranslıdır / izin verir. RPMI, PBMC popülasyonunun büyümesini ve bakımını desteklemek için kullanılır.
   6. Virüs inokulunun hazırlanan 30 μL (24 kuyucuklu) / 100 μL (12 kuyucuklu için) membran ekinin apikal odasına ekleyin, 35 ° C'de% 5 CO₂ atmosferinde 1 saat boyunca inkübe edin ve viral inokulu apikal odadan çıkarın.
   7. Membran kesici ucun bazal ortamını taze tam RPMI ortamına değiştirin ve 24 saat boyunca %5 CO 2 atmosferinde 35 °_C'de inkübe edin.
2. 1. Gün (hNEC'lerin + PBMC'lerin ortak kültürünün kurulması)
   1. PBMC süspansiyonunu 0. Gün'den itibaren enfekte olmamış veya enfekte olmuş hNEC'lerin her bir kuyucuğunun bazal odasına doğrudan ekleyerek (24 kuyucuklu plakalar için 150 μL (24 kuyucuklu) / 300 μL (12 kuyucuklu için) tam RPMI ortamının 150 μL'sinde (24 kuyucuklu plakalar için 10 6 ve 12 delikli plakalar için 3 ×× 10⁶) gerekli PBMC sayısını tohumlayın. 24/48 saat boyunca 37 °C'de inkübe edin.
      NOT: Ko-kültürün kurulmasından sonra bazal odadaki son hacim 500 μL (24 kuyu için)/1000 μL'dir (12 kuyucuk için).
3. 2-3. Gün (PBMC'lerin 48/72 saat viral enfeksiyon sonrası toplanması)
   1. Apikal süpernatantların toplanması (48/72 saat post-viral enfeksiyon)
      1. Her apikal odaya 50 μL (24 kuyucuk için)/150 μL (12 kuyucuk için) 1x dPBS ekleyin ve 10 dakika boyunca 37 °C'de inkübe edin. 1x dPBS'yi 1,5 mL tüplerde toplayın. Yeni bir 1.5 mL tüpte plak testi için süpernatantın Aliquot 25 μL (24 kuyucuk için) / 50 μL (12 kuyucuk için) ve hemen hem stoğu hem de alikotları -80 ° C'de dondurun.
   2. hNEC'lerden hücresel RNA toplanması (48/72 h post-viral enfeksiyon)
      1. Membran ekini temiz bir kuyucuğa aktarın, apikal odaya 300 μL (24 kuyucuk için)/600 μL (12 kuyucuk için) RNA lizis tamponu ekleyin ve 5 dakika boyunca rtp'de inkübe edin. Süpernatantı 1.5 mL'lik bir santrifüj tüpünde toplayın ve moleküler analiz için RNA ekstraksiyonuna kadar -80 ° C'de saklayın.
   3. PBMC'lerin toplanması (48/72 saat post-viral enfeksiyon)
      1. Steril pipet ucunun geniş tabanıyla, kuyu yüzeyine yapışmış olabilecek aktif PBMC'leri yerinden çıkarmak için kuyunun yüzeyini yavaşça kazıyın. PBMC'leri içeren bazal ortamı 2 mL'lik bir santrifüj tüpünde toplayın.
      2. Kuyucukları 300 μL 1x dPBS ile 2 kat yıkayın ve yıkamayı aynı 2 mL tüpte toplayın. 2 mL tüpü (500 × g, 5 dakika, rtp) santrifüj edin ve süpernatantı hücre peletini rahatsız etmeden taze bir 2 mL tüpte toplayın. Sitokin ve kemokin analizi için süpernatantı -80 ° C'de saklayın; hücre peletini 200 μL 1x dPBS'de yeniden askıya alın.

6. Akış sitometrisi

NOT: Protokolün bu bölümü, adım 5.3.3.2'deki PBMC hücre askıya alma işlemi kullanılarak doğrudan önceki bölümden devam ettirilir. Bu bölümdeki aşağıdaki adımlarda ışığa en az düzeyde maruz kaldığınızdan emin olun. Yüzey boyama işaretleyicilerinden oluşan örnek bir panel Tablo 2'de bulunabilir.

1. Yüzey boyama
   1. Yeniden askıya alınmış PBMC hücre peletini 96 V'luk bir alt kuyu plakasına aktarın. Santrifüj, 3 dakika boyunca 800 × g'da lizat yapın ve süpernatanı çıkarın.
   2. Tüm PBMC'leri ("lekesiz" hariç) rtp'de 15 dakika boyunca 100 μL canlılık lekesi ile inkübe edin. 150 μL Manyetik-Aktif Hücre Sıralama (MACS) tamponu ile 200 μL'ye kadar doldurun. Santrifüj, 3 dakika boyunca 800 × g'da lizat yapar ve süpernatanı atın.
   3. Uygun seyreltme oranlarına ve reaksiyon başına 50 μL'lik bir son hacme sahip ilgili yüzey boyama antikorlarından oluşan bir panel hazırlayın (son hacmi elde etmek için MACS tamponu ile doldurun). Çok kanallı pipet kullanarak hazırlanan antikor karışımının 50 μL'sini hücrelere ekleyerek yüzey boyama işlemini gerçekleştirin. Karanlıkta 15 dakika boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
   4. 150 μL MACS tamponu ekleyerek yıkayın. Santrifüj, 3 dakika boyunca 800 × g'da lizat yapın ve süpernatanı atın. Hücre içi boyama gerekli değilse, adım 6.3'te doğrudan 15 dakikalık inkübasyona geçin.
2. Hücre içi boyama (Gerekirse)
   1. Her bir oyuğa 100 μL sabitleme ve geçirgenlik çözeltisi ekleyin. Karanlıkta 20 dakika boyunca 4 ° C'de inkübe edin. Kuyucukları 100 μL 1x MACS tamponuyla doldurun.
   2. Santrifüj (800 × g, 3 dk, 25 °C) ve süpernatanı çıkarın. 200 μL 1x Permeabilizasyon Yıkama tamponu ekleyerek yıkamayı tekrarlayın. Santrifüj (500 × g, 3 dk, 25 °C) ve süpernatanı çıkarın.
   3. 1x Permeabilizasyon Yıkama tamponu kullanarak 50 μL'lik son bir hacim elde etmek için ilgili antikor panelinin seyreltmelerini hazırlayın. Karanlıkta 30 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatın. 200 μL 1x Geçirgenleştirme Yıkama tamponu ekleyin.
   4. Hücreleri santrifüj edin (800 × g, 3 dakika, 4 ° C) ve süpernatanı çıkarın. Hücreleri 100 μL floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama tamponunda yeniden askıya alın.
3. Pipet, her bir kuyucuğun içine 200 μL'lik bir lizör çözeltisi yerleştirin. RTP'de 15 dakika boyunca kuluçkaya yatırın. Santrifüj, 3 dakika boyunca 800 × g'da lizat eder ve süpernatanı atar.
4. Hücre peletlerini 200 μL MACS tamponunda yeniden askıya alın. Daha önce¹³ olarak belirtilen ayarlara uygun olarak akış sitometrisi yapın veya karanlıkta 4 ° C'de saklayın.

7. Sitokin ve kemokin düzeylerinin belirlenmesi

1. Üreticinin protokolü^18'e göre bir immünoloji multipleks testi kullanarak bazal oda süpernatanının 25 μL'sini işleyin.
2. Standart eğri için eğriye uyan bir algoritma (5 parametre) kullanan multipleks yönetici yazılımını kullanarak her analitin konsantrasyonunu hesaplayın.

8. Viral kontaminasyonun değerlendirilmesi

1. 4 set çözelti üzerinde bir ekstraksiyon kiti kullanarak viral RNA'yı ekstrakte edin: stok H3N2 çözeltisi, enfeksiyon için MOI 0.1 seyreltme, MOI 0.1'in 10x seri seyreltilmesi ve örneklerden bazal ortam (hem 48 hem de 72 saat viral enfeksiyon sonrası)¹².
2. Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) için hedef olarak yapısal olmayan gen (NS1) ve matrisi (M1) seçin (temsili deneyde kullanılan primerler için Malzeme Tablosuna bakınız).
3. NS1 ve M1 seviyelerini viral mevcudiyet için bir vekil olarak ölçmek üzere kantitatif PCR (qPCR) gerçekleştirmeden önce viral RNA'yı cDNA'ya dönüştürmek için ters transkripsiyon-PCR (RT-PCR) (42 ° C, 60 dakika) gerçekleştirin ve seviyeleri MOI 0.1 aliquot'un 10x seri seyreltilmesinde gerçekleştirilen RT-qPCR'den elde edilen standart eğri ile ilişkilendirin. Reaksiyon karışımlarının bileşimi için Tablo 3'e bakın ve aşağıdaki koşulları kullanın: 10 dakika boyunca 95 ° C'de ön inkübasyon, ardından 40 döngü için 3 adımlı bir amplifikasyon: 10 s için 95 ° C, 10 s için 60 ° C, 30 s için 72 ° C; erime eğrisi: 10 s için 95 °C, 60 s için 65 °C ve 1 s için 97 °C.

9. Plak tahlili

1. 0. Gün: MDCK'nin (Madin Darby Canine Böbrek) 24 kuyucuklu plakalara ekilmesi
   1. Ortamı, birleşik MDCK hücrelerinin T75 Flask'ından çıkarın. Tüm serum izlerini gidermek için 2x'i 1x PBS ile yıkayın. MDCK hücrelerini, 10 mL tripsin ekleyerek ve hücreler ayrılana kadar 20-30 dakika boyunca% 5 CO₂ atmosferinde 37 ° C'de inkübe ederek tripsinize edin.
      NOT: Şişeye dokunmayın, çünkü bu durum kümelenmeye neden olabilir.
   2. Hücre süspansiyonunu, 2 mL'lik tam Eagle's Minimal Essential Medium (EMEM) içeren 15 mL'lik bir tüpe pipetleyin. Santrifüj (300 × g, 5 dakika, rtp) ve süpernatanı çıkarın.
   3. Hücreleri 6 mL'lik tam EMEM'de yeniden askıya alın. Tripan mavisi boyama ile hücreleri sayın.
   4. MDCK hücre süspansiyonunu 1 × 10⁵ hücre / mL konsantrasyona kadar seyreltin ve steril 24 delikli bir plakanın her bir kuyucuğunda seyreltilmiş süspansiyonun 1 mL'sini tohumlayın. Her bir kuyucukta birleştirilmiş bir tek katmanlı MDCK hücresi elde etmek için₂₄ saat boyunca% 5'lik bir CO 2 atmosferinde 37 ° C'de inkübe edin.
2. 1. Gün: MDCK hücrelerinin enfeksiyonu
   1. Enfeksiyon ortamını hazırlayın. Ortamı 24 delikli plakadaki MDCK tek katmanından çıkarın ve 2x'i 1x dPBS ile yıkayın. İkinci yıkama için, virüsün seri seyreltmelerini hazırlarken PBS'yi kuyucuklarda bırakın.
   2. Virüs örneklerini buz üzerinde çözün ve 10-1'den ^10-6'ya kadar seri seyreltmeler elde etmek için 24 delikli bir plakada seri olarak seyreltin.
      NOT: Örnek olarak, her bir oyuğun 270 μL enfeksiyon ortamı içeren 24 delikli bir plakaya doldurun.
   3. Sıradaki ilk kuyucuğa 30 μL virüs örneği ekleyin. Yeni bir pipet ucu ile iyice karıştırın ve numuneyi 10 kat seyreltmek için sıradaki bir sonraki kuyucuğa aktarın. ^10-6 seyreltme elde edilene kadar devam edin; Tüm virüs örnekleri için 9.2.1-9.2.3 adımlarını uygulayın.
   4. PBS'yi MDCK plakasından çıkarın ve hazırlanan viral seyreltmelerin 100 μL'si ile çift olarak enfekte edin. Kontrol kuyuları için, enfeksiyon ortamının 100 μL'sini ekleyin (viral numune olmadan). 35 °C'de %5 CO₂ atmosferinde 1 saat boyunca inkübe edin ve her 15 dakikada bir kuru lekeleri ortadan kaldırmak için plakayı sallayın.
   5. Viral inokulumu çıkarın ve her kuyucuk için 1 mL sıvı kaplama ekleyin. 35 °C'de %5 CO₂ atmosferinde 72 saat boyunca inkübe edin.
3. 4. Gün (enfeksiyon sonrası 72 saat): plak görselleştirme
   1. Sıvı kaplamayı çıkarın ve hücreleri% 4 formaldehit ile 1 saat boyunca 1x PBS'de sabitleyin. Formaldehit çözeltisini çıkarın ve 1x PBS veya damıtılmış su ile bir kez yıkayın.
   2. 15 dakika boyunca% 1 kristal menekşe çözeltisi ekleyerek sabit hücreleri lekeleyin. Kristal menekşe boyasını çıkarın ve hücreleri akan suyla yıkayın. Plakayı rtp'de kurulayın.
   3. Kuruduktan sonra, plakları sayın ve viral titreyi aşağıdaki formüle göre hesaplayın:
      Seyreltme faktörü × plak sayısı = 100 μL'de plak - şekillendirme ünitelerinin sayısı

Sonuçlar

Konvansiyonel T hücreleri, viral klirensi kolaylaştırmak için viral enfeksiyona karşı adaptif immün yanıtın ana repertuarını oluştursa da, doğuştan gelen T hücresi popülasyonu, daha sonraki bir aşamada etkili klirens için viral yükü bastırmak için daha geniş bir spektrumda çalışır. Bu nedenle, bu protokol özellikle doğuştan gelen T hücrelerini, aktivasyonlarını ve influenza enfeksiyonunu takiben fonksiyonel popülasyonlarını, aynı donörden epitel ve ba...

Tartışmalar

Virüslere karşı doğuştan gelen immün yanıtlar, antiviral yönetimde az araştırılan bir çalışma alanıdır. Hava yolu epitel hücreleri ve doğuştan gelen bağışıklık hücreleri, bir enfeksiyon sırasında viral replikasyonu baskılamak için uyum içinde çalışır, ayrıca viral yük kontrol altında tutulmazsa aşırı aktif adaptif yanıtın belirleyicisi olarak hizmet eder^12,13,17. Bununla birlikte, uygun ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5% Trypsin-EDTA	Gibco	15400-054
0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), pH 8.0, RNase-free	Thermofisher	AM9260G	0.5M EDTA
1.5 mL SafeLock Tubes	Eppendorf	0030120086	1.5mL Centrifuge Tube
10 mL K3EDTA Vacutainer Tubes	BD	366643	10mL Blood Collection Tubes
10x dPBS	Gibco	14200-075
10x PBS	Vivantis	PC0711
12-well Plate	Corning	3513
12-well Transwell Insert	Corning	3460	membrane insert
1x FACS Lysing Solution	BD	349202
2.0 mL SafeLock Tubes	Eppendorf	0030120094	2 mL centrifuge tube
24-well Plate	Corning	3524
24-well Transwell Insert	Corning	3470
3% Acetic Acid with Methylene Blue	STEMCELL Technologies	07060
3,3',5-triiodo-l-thyronine	Sigma	T-074
37% Formaldehyde Solution w 15% Methanol as Stabilizer in H2O	Sigma	533998
5810R Centrifuge	Eppendorf	5811000320
5 mL polypropylene tubes (flow tubes)	BD	352058
70 µm Cell Strainer	Corning	431751
A-4-62 Rotor	Eppendorf	5810709008
Accutase	Gibco	A1110501	Cell Dissociation Reagent
Antibiotic-Antimycotic	Gibco	15240-062
Avicel CL-611	FMC Biopolymer	NA	Liquid Overlay
Bio-Plex Manager 6.2 Standard Software	Bio-Rad Laboratories, Inc	171STND01	Multiplex Manager Software
Butterfly Needle 21 G	BD	367287
Cholera Toxin	Sigma	C8052
Crystal Violet	Merck	C6158
Cytofix/Cytoperm Solution	BD	554722	Fixation and Permeabilization Solution
Dispase II	Sigma	D4693	Neutral Protease
DMEM/High Glucose	GE Healthcare Life Sciences	SH30243.01
DMEM/Nutrient Mixture F-12	Gibco-Invitrogen	11320033
dNTP Mix	Promega	U1515	dNTP Mix
EMEM (w L-Glutamine)	ATCC	30-2003
EVOM voltohmmeter device	WPI, Sarasota, FL, USA	300523
FACS Lysing Solution	BD	349202	1x Lysing Solution
Falcon tube 15 mL	CellStar	188271	15 mL tube
Falcon tube 50 mL	CellStar	227261	50 mL Tube
Fast Start Essential DNA Probes Master	Roche	6402682001	qPCR Master Mix
Ficoll Paque Premium	Research Instruments	17544203	Density Gradient Media
H3N2 (A/Aichi/2/1968)	ATCC	VR547
H3N2 M1 Forward Primer Sequence	Sigma	5'- ATGGTTCTGGCCAGCACTAC-3'
H3N2 M1 Reverse Primer Sequence	Sigma	5'- ATCTGCACCCCCATTCGTTT-3'
H3N2 NS1 Forward Primer Sequence	Sigma	5'- ACCCGTGTTGGAAAGCAGAT-3'
H3N2 NS1 Reverse Primer Sequence	Sigma	5'- CCTCTTCGGTGAAAGCCCTT-3'
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum	Gibco	10500-064
hNESPCs	Human Donors	NA
Human Epithelial Growth Factor	Gibco-Invitrogen	PHG0314
Hydrocortisone	STEMCELL Techonologies	7925	Collected from nasal biopsies during septal deviation surgeries
Insulin	Sigma	I3536
Lightcycler 96	Roche	5815916001	qPCR Instrument
Live/DEAD Blue Cell Stain Kit *for UV Excitation	Thermofisher	L23105	Viability Stain
MILLIPLEX MAP Human Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel II - Premixed 23 Plex	Merck Pte Ltd	HCP2MAG-62K-PX23	Immunology Multiplex Assay
Mitomycin C	Sigma	M4287
M-MLV 5x Buffer	Promega	M1705	RT-PCR 5x Buffer
M-MLV Reverse Transcriptase	Promega	M1706	Reverse Transcriptase
N-2 supplement	Gibco-Invitrogen	17502-048
NIH/3T3	ATCC	CRL1658
Perm/Wash Buffer	BD	554723	Permeabilization Wash Buffer
PneumaCult-ALI 10x Supplement	STEMCELL Techonologies	5001
PneumaCult-ALI Basal Medium	STEMCELL Techonologies	5001
PneumaCult-ALI Maintenance Supplement (100x)	STEMCELL Techonologies	5001
Random Primers	Promega	C1181	Random Primers
Recombinant Rnasin Rnase Inhibitor	Promega	N2511	RNase Inhibitor
RNA Lysis Buffer	Qiagen	Part of 52904
RPMI 1640 (w L-Glutamine)	ATCC	30-2001
STX2 electrodes	WPI, Sarasota, FL, USA	STX2	Electrode
T25 Flask	Corning	430639
T75 Flask	Corning	430641U
TPCK Trypsin	Sigma	T1426
Trypan Blue	Hyclone	SV30084.01
Viral RNA Extraction Kit	Qiagen	52904	Viral RNA Extraction Kit
V-Shaped 96-well Plate	Corning	3894