Doble etiquetado inmunofluorescencia utilizando anticuerpos de la misma especie para estudiar las interacciones huésped-patógeno

Resumen

Aquí, el protocolo describe cómo realizar la inmunofluorescencia de doble etiquetado utilizando anticuerpos primarios criados en la misma especie para estudiar las interacciones huésped-patógeno. Además, puede incluir el tercer anticuerpo de un huésped diferente en este protocolo. Este enfoque se puede hacer en cualquier tipo de célula y patógenos.

Resumen

Hoy en día, es posible encontrar una amplia gama de herramientas moleculares disponibles para estudiar las interacciones parásito-célula huésped. Sin embargo, existen algunas limitaciones para obtener anticuerpos monoclonales o policlonales comerciales que reconozcan estructuras celulares y proteínas específicas en los parásitos. Además, hay pocos anticuerpos comerciales disponibles para etiquetar tripanosomátidos. Por lo general, los anticuerpos policlonales contra los parásitos se preparan internamente y podrían ser más difíciles de usar en combinación con otros anticuerpos producidos en la misma especie. Aquí, el protocolo demuestra cómo usar anticuerpos policlonales y monoclonales criados en la misma especie para realizar inmunofluorescencia de doble etiquetado para estudiar las interacciones entre la célula huésped y el patógeno. Para lograr la inmunofluorescencia de doble etiquetado, es crucial incubar primero el anticuerpo policlonal de ratón y luego seguir la incubación con el anticuerpo IgG secundario de ratón conjugado a cualquier fluorocromo. Después de eso, es necesario un paso de bloqueo adicional para evitar que cualquier rastro del anticuerpo primario sea reconocido por el siguiente anticuerpo secundario. Luego, un anticuerpo monoclonal de ratón y su anticuerpo secundario de subclase IgG específico conjugado a un fluorocromo diferente se agregan a la muestra en los momentos apropiados. Además, es posible realizar un triple etiquetado de inmunofluorescencia utilizando un tercer anticuerpo criado en una especie diferente. Además, estructuras como los núcleos y la actina se pueden teñir posteriormente con sus compuestos o etiquetas específicas. Por lo tanto, estos enfoques presentados aquí se pueden ajustar para cualquier célula cuyas fuentes de anticuerpos primarios son limitadas.

Introducción

Estudiar la interacción del patógeno con la célula huésped a nivel celular proporciona información esencial sobre las causas subyacentes de la enfermedad, ya que diferentes grupos, como virus, bacterias y protozoos, pueden infectar a la mayoría de los tipos de células huésped1,2,3,4. También puede ayudar a desarrollar e identificar posibles objetivos terapéuticos que pueden retardar o inhibir el crecimiento del patógeno. En condiciones de vida, los anticuerpos producidos son responsables de reconocer autocomponentes, antígenos de virus, componentes o productos bacterianos, hongos, parásitos y ^otros5.

Para este propósito, los anticuerpos son herramientas ampliamente utilizadas, principalmente para comprender la ubicación y la función de las estructuras celulares y las proteínas. Varios estudios que utilizan el etiquetado de múltiples anticuerpos demuestran que los pasos de bloqueo adicionales contribuyen a la especificidad de la inmunolocalización. Además, la mayoría de los protocolos descritos utilizan anticuerpos monoclonales comerciales específicos, incluidos anticuerpos de la misma especie huésped6,7,8,9,10,11,12,13,14.

Por lo general, la inmunofluorescencia de doble etiquetado utiliza dos anticuerpos criados en diferentes especies para teñir las estructuras celulares de interés o los patógenos y las células huésped para ver la interacción entre ellos. Sin embargo, esto puede ser un problema cuando no hay anticuerpos monoclonales o policlonales comerciales específicos para algunos patógenos disponibles para realizar el doble etiquetado. Además, existen kits de conjugación de anticuerpos disponibles comercialmente, y es posible conjugar los anticuerpos primarios directamente al fluoróforo mediante una reacción de éster de succinimidil15. El problema es que estos kits suelen ser caros, y es necesario tener suficientes anticuerpos para etiquetarlos. Sabiendo esto, desarrollamos con éxito un método de doble inmunofluorescencia utilizando dos anticuerpos diferentes criados en la misma especie para estudiar la localización de proteínas en Trypanosoma brucei16. Sin embargo, para los parásitos intracelulares, incluido Trypanosoma cruzi, este enfoque no se ha demostrado. Aquí, mostramos cómo realizar la inmunofluorescencia de doble etiquetado para estudiar los parásitos intracelulares de T. cruzi y la célula huésped utilizando anticuerpos primarios criados en la misma especie sin reacciones cruzadas. Además de este método, se ha establecido un etiquetado de triple inmunofluorescencia con la adición del tercer anticuerpo de una especie diferente. Estos enfoques ayudan cuando la fuente de anticuerpos es limitada y se puede utilizar en cualquier tipo de célula.

Protocolo

1. Cultivos celulares y parasitarios

1. Cultivar células LLC-MK2 (Rhesus Monkey Kidney Epithelial) de la American Type Culture Collection (CCL-7) en un matraz de cultivo celular de ^{25 cm2} que contiene en medio RPMI suplementado con FBS (Fetal Bovine Serum) inactivado por calor al 10% y antibióticos (100 U/mL penicilina y 100 μg/mL de estreptomicina) a 37 °C en 5% _CO2 ¹⁷.
2. Infectar células LLC-MK2 con Trypanosoma cruzi (cepa Y) según un protocolo previo ¹⁸.
3. Recoger el sobrenadante de las células infectadas con LLC-MK2 (5 mL) en un tubo de centrífuga cónica de cultivo celular de 15 mL y centrífuga a 500 x g durante 10 minutos y 22 °C para reducir los restos celulares. Mantenga el tubo durante 10 minutos a 37 °C para permitir que los tripomastigotes naden hasta el sobrenadante.
4. Recoger el sobrenadante en un nuevo tubo cónico y centrifugar a 2500 x g durante 15 minutos a 22 °C. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el gránulo que contiene los parásitos en medio RPMI completo para determinar la densidad celular contando las células en una cámara de Neubauer.

2. Protocolo de inmunofluorescencia de control

NOTA: Una vez fijado, es posible almacenar placas que contengan recubiertas a 4 °C en 1x PBS (pH 7.2) durante una semana. Para ser almacenadas, es importante que las células no hayan pasado por el paso de permeabilización.

1. Asiente las células LLC-MK2 (2 x ¹⁰⁴) en 24 placas de pocillos que contienen fundas redondeadas esterilizadas por UV en medios RPMI durante 16 horas.
2. Para las células infectadas, añadir un sobrenadante que contenga T. cruzi (ítem 1.4) a cada pocillo en proporción (MOI 10:1) y dejar durante 6 h de infección. Lave las fundas que contienen células infectadas y no infectadas cinco veces con solución de PBS y fijada con paraformaldehído al 2% en 1x PBS (pH 7.2) durante 10 min a temperatura ambiente (RT).
3. Lave los cubrehojas tres veces durante 5 minutos cada una con 1x PBS (pH 7.2).
4. Permeabilizar las cubiertas con 0,2% IGEPAL CA-630 en 1x PBS (PH 7,2) durante 10 min a RT.
5. Lave las fundas tres veces durante 5 minutos cada una con 1x PBS.
6. Incubar los coverslips durante 30 min a RT con la solución de bloqueo (2% BSA en 1x PBS, pH 7.2).
7. Incubar los recubiertos durante 30 min a RT, ya sea con anticuerpos monoclonales anti-hnRNPA1 (dilución 1:200) o con anticuerpos anti-TcFAZ policlonales de ratón (dilución 1:100) diluidos en solución bloqueante.
8. Lave las fundas tres veces durante 5 minutos cada una con 1x PBS.
9. Incubar los coverslips durante 30 min a RT con IgG F (ab')2 (H+L) anti-ratón de cabra conjugado a Alexa Fluor 488 (1:600) junto con faloidina conjugada a Alexa 594 (1:300) para teñir filamentos de actina (F-actina) en la célula huésped diluida en la solución de bloqueo.
10. Lavar tres veces con 1x PBS (pH 7.2) durante 5 min cada uno.
11. Aplique una pequeña cantidad de reactivo de montaje antifade ProLong Gold con medio DAPI a la superficie de la corredera.
12. Con fórceps, incline suavemente la cubierta en el medio de montaje para evitar que se formen burbujas. Una vez seco, selle el cubrehojas si lo desea.

3. Protocolo de inmunofluorescencia de doble etiquetado utilizando anticuerpos monoclonales y policlonales criados en el mismo huésped

1. Repita los pasos 2.1 a 2.6 descritos anteriormente.
2. Incubar cápsulas que contengan células infectadas y no infectadas con anticuerpos policlonales anti-TcFAZ policlonales de ratón internos (1:100) diluidos en solución bloqueadora durante 30 min a RT.
3. Lave las fundas tres veces durante 5 minutos cada una con 1x PBS.
4. Incubar los cobertores durante 30 min a RT con IgG F (ab')2 (H+L) anti-ratón de cabra conjugado con Alexa Fluor 647 (1:600) diluido en la solución de bloqueo.
5. Lave las fundas tres veces durante 5 minutos cada una con 1x PBS.
6. Realice el segundo paso de bloqueo con AffiniPure conejo anti-ratón IgG (H + L) diluido (0.12 mg / ml) en solución de bloqueo durante 30 min a RT.
7. Lave los cubrehojas tres veces con 1x PBS (pH 7.2) durante 5 min cada uno. Luego incubar con anticuerpos monoclonales anti-hnRNP A1 IgG2b (1:200) de ratón durante 30 min a RT.
8. Lave las fundas tres veces durante 5 minutos cada una con 1x PBS.
9. Incubar los coverslips durante 30 min con anticuerpo IgG2b anti-ratón de cabra conjugado a Alexa Fluor 488 (1:600) y con faloidina conjugada a Alexa 594 (1:300) diluido en la solución de bloqueo.
10. Lave las fundas tres veces durante 5 minutos cada una con 1x PBS.
11. Repita los pasos 2.8 a 2.10 descritos anteriormente.

4. Protocolo de inmunofluorescencia de triple etiquetado con la adición del tercer anticuerpo policlonal de diferentes especies huésped

NOTA: Para el etiquetado adicional, tenga en cuenta las subclases de IgG, los isotipos de anticuerpos y siga el orden de los anticuerpos: 1. policlonal de ratón, 2. policlonal de conejo, 3. segundo bloque y 4. monoclonal de ratón. Considere el tipo de láseres disponibles en el microscopio confocal para elegir el anticuerpo secundario conjugado con fluoróforo correcto.

1. Repita los pasos 2.1 a 2.6 descritos anteriormente.
2. Después de los pasos 3.2 a 3.5 (paso de lavado), comience una nueva incubación con anticuerpos policlonales de conejo en solución bloqueadora durante 30 minutos a RT.
3. Lave los cubrehojas tres veces con 1x PBS (pH 7.2) durante 5 minutos cada uno.
4. Incubar los cobertores con anticuerpos igG anti-conejo de cabra conjugados a Alexa 647 (1:600) en solución de bloqueo durante 30 minutos.
5. Lave las fundas tres veces durante 5 minutos cada una con 1x PBS.
6. Realice un paso de bloqueo con AffiniPure conejo anti-ratón IgG (H + L) diluido (0.12 mg / ml) en solución de bloqueo durante 30 min a RT.
7. Lave los cubrehojas tres veces con 1 pbS (pH 7.2) durante 5 minutos cada uno e incube con cualquier anticuerpo monoclonal igG de ratón diluido en solución de bloqueo durante 30 minutos.
8. Lave las fundas tres veces durante 5 minutos cada una con 1x PBS.
9. Incubar los cubrehojas durante 30 minutos con un par específico de anticuerpos de la subclase IgG anti-ratón de cabra conjugados a Alexa 594 (1:600) en solución de bloqueo durante 30 minutos.
10. Lave las fundas tres veces durante 5 minutos cada una con 1x PBS.

5. Adquisición de imágenes confocales

1. Analizar las muestras de inmunofluorescencia utilizando un microscopio confocal, con un objetivo de inmersión en aceite 63X y detectar la fluorescencia con un tubo fotomultiplicador (PMT) y un detector híbrido (HyD).
   NOTA: Utilizamos la configuración del Laboratorio Multiusuario de Microscopía Confocal - LMMC, Facultad de Medicina Ribeirao Preto, Universidad de Sao Paulo.
2. Adquiere todas las imágenes confocales con canales separados. Realice el procesamiento de imágenes con Adobe Photoshop.

Resultados

Aquí, mostramos cómo estudiar las interacciones huésped-parásito por inmunofluorescencia cuando la fuente de anticuerpos es limitada debido a la falta de disponibilidad de anticuerpos comerciales que reconocen estructuras y proteínas específicas en tripanosomátidos.

Entre los tripanosomátidos, T. cruzi tiene uno de los ciclos de vida más complejos que involucran varias etapas de desarrollo entre vertebrados e invertebrados huéspedes ¹⁹. Durante el cic...

Discusión

Aquí, presentamos un protocolo para realizar un doble inmunoetiquetado en células infectadas por Trypanosoma cruzi utilizando dos anticuerpos diferentes de la misma especie huésped. Para estudiar, con más detalle, las implicaciones de la infección, se pueden etiquetar estructuras en la célula huésped como el núcleo u orgánulos citosólicos utilizando este protocolo. Además, se puede utilizar en el método de etiquetado de inmunogold de sección delgada posterior a la incrustación. Este enfoque ayuda a...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 488 - IgG2b antibody	Life technologies, USA	A21141	Goat anti-mouse
AffiniPure Rabbit anti-mouse IgG (H+L)	Jackson Immunoresearch, USA	315-005-003	Anti-mouse antibody
Alexa Fluor 488 - IgG F (ab')2 (H+L) antibody	Life technologies, USA	A11017	Goat anti mouse
Alexa Fluor 594 IgG1 antibody	Life technologies, USA	A21125	Goat anti-mouse
Alexa Fluor 647 - IgG F (ab')2 (H+L) antibody	Life technologies, USA	A21237	Goat anti-mouse
Anti-hnRNPA1 antibody IgG2b	Sigma-Aldrich, USA	R4528	Mouse antibody
anti-TcFAZ (T. cruzi FAZ protein) antibody	Our lab	In-house	Mouse antibody
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich, USA	A2153-10G	Albumin protein
Detergent Igepal CA-630	Sigma-Aldrich, USA	I3021	Nonionic Detergent
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco, Thermo fisher scientific, USA	12657-029	Serum
Penicillin Streptomycin	Gibco, Thermo fisher scientific, USA	15140-122	Antibiotic
Phalloidin Alexa Fluor 594	Life technologies, USA	A12381	Actin marker
ProLong Gold antifade with DAPI	Life technologies, USA	P36935	Mounting media reagent
RPMI 1640 1X with L-glutamine	Corning, USA	10-040-CV	Cell culture media
Trypsin-EDTA solution	Sigma-Aldrich, USA	T4049-100ML	Bioreagent