Imunofluorescência de rotulagem dupla usando anticorpos da mesma espécie para estudar interações hospedeiro-patógeno

Resumo

Aqui, o protocolo descreve como realizar a dupla rotulagem de imunofluorescência usando anticorpos primários criados na mesma espécie para estudar interações hospedeiro-patógeno. Além disso, ele pode incluir o terceiro anticorpo de um host diferente neste protocolo. Esta abordagem pode ser feita em qualquer tipo de célula e patógenos.

Resumo

Hoje em dia, é possível encontrar uma ampla gama de ferramentas moleculares disponíveis para estudar interações células parasitas-hospedeiras. No entanto, existem algumas limitações para a obtenção de anticorpos monoclonais ou policlonais comerciais que reconheçam estruturas celulares específicas e proteínas em parasitas. Além disso, há poucos anticorpos comerciais disponíveis para rotular trypanosomatids. Normalmente, anticorpos policlonais contra parasitas são preparados internamente e poderiam ser mais desafiadores de usar em combinação com outros anticorpos produzidos na mesma espécie. Aqui, o protocolo demonstra como usar anticorpos policlonais e monoclonais criados na mesma espécie para realizar a dupla rotulagem de imunofluorescência para estudar interações entre células hospedeiras e patógenos. Para alcançar a imunofluorescência de rotulagem dupla, é crucial incubar primeiro o anticorpo policlonal do camundongo e, em seguida, seguir a incubação com o anticorpo secundário IgG conjugado a qualquer fluorocromo. Depois disso, uma etapa de bloqueio adicional é necessária para evitar que qualquer vestígio do anticorpo primário seja reconhecido pelo próximo anticorpo secundário. Em seguida, um anticorpo monoclonal do rato e seu anticorpo secundário subclasse IgG específico conjugado a um fluorocromo diferente são adicionados à amostra nos momentos apropriados. Além disso, é possível realizar imunofluorescência de rotulagem tripla usando um terceiro anticorpo criado em uma espécie diferente. Além disso, estruturas como núcleos e actina podem ser manchadas posteriormente com seus compostos ou rótulos específicos. Assim, essas abordagens aqui apresentadas podem ser ajustadas para qualquer célula cujas fontes de anticorpos primários sejam limitadas.

Introdução

Estudar a interação do patógeno com a célula hospedeira no nível celular fornece informações essenciais sobre as causas subjacentes da doença, uma vez que diferentes grupos, como vírus, bactérias e protozoários, podem infectar a maioria dos tipos de células hospedeiras1,2,3,4. Também pode ajudar a desenvolver e identificar potenciais alvos terapêuticos que podem retardar ou inibir o crescimento do patógeno. Em condições vivas, os anticorpos produzidos são responsáveis pelo reconhecimento de autocomponmentos, antígenos de vírus, componentes ou produtos bacterianos, fungos, parasitas e ^outros5.

Para isso, os anticorpos são ferramentas amplamente utilizadas, principalmente para a compreensão da localização e função das estruturas celulares e proteínas. Vários estudos utilizando rotulagem múltipla de anticorpos demonstram que etapas adicionais de bloqueio contribuem para a especificidade da imunolocalização. Além disso, a maioria dos protocolos descritos utiliza anticorpos monoclonais comerciais específicos, incluindo anticorpos das mesmas espécies hospedeiras6^, 7,8,9,10,11,12,13,14.

Normalmente, a dupla rotulagem imunofluorescência usa dois anticorpos criados em diferentes espécies para manchar as estruturas celulares de interesse ou os patógenos e as células hospedeiras para ver a interação entre eles. No entanto, isso pode ser um problema quando não há anticorpos monoclonais ou policlonais comerciais específicos para alguns patógenos disponíveis para realizar a rotulagem dupla. Além disso, existem kits de conjugação de anticorpos disponíveis comercialmente, e é possível conjugar os anticorpos primários diretamente ao fluoróforo por uma reação de éster succinimidyl15. O problema é que esses kits são muitas vezes caros, e é necessário ter anticorpos suficientes para rotulá-los. Sabendo disso, desenvolvemos com sucesso um método de dupla imunofluorescência usando dois anticorpos diferentes criados na mesma espécie para estudar a localização de proteínas em Trypanosoma brucei16. No entanto, para parasitas intracelulares, incluindo Trypanosoma cruzi, essa abordagem não foi demonstrada. Aqui, mostramos como realizar a dupla rotulagem de imunofluorescência para estudar parasitas intracelulares T. cruzi e a célula hospedeira usando anticorpos primários criados na mesma espécie sem reações cruzadas. Além desse método, foi estabelecida uma rotulagem tripla de imunofluorescência com a adição do terceiro anticorpo de uma espécie diferente. Essas abordagens ajudam quando a fonte de anticorpos é limitada e pode ser usada em qualquer tipo de célula.

Protocolo

1. Culturas celulares e parasitas

1. Grow LLC-MK2 (Resus Monkey Kidney Epithelial) células da American Type Culture Collection (CCL-7) em um frasco de cultura celular de 25 ^cm2 contendo em meio RPMI suplementado com 10% de calor-in FBS ativados (Soro Bovino Fetal) e antibióticos (Penicilina U/mL 100 U/mL e 100 μg/mL Streptomicin) a 37 °C em 5% DE _CO2 ¹⁷.
2. Infectar células LLC-MK2 com Trypanosoma cruzi (cepa Y) de acordo com um protocolo anterior ¹⁸.
3. Colete o supernatante das células infectadas LLC-MK2 (5 mL) em um tubo de centrífuga cônica de cultura cônica de 15 mL e centrífuga a 500 x g por 10 minutos e 22 °C para diminuir os detritos celulares. Mantenha o tubo por 10 minutos a 37 °C para permitir que os trypomastigotes nade até o sobrenatário.
4. Colete o supernatante em um novo tubo cônico e centrífuga a 2500 x g por 15 minutos a 22 °C. Descarte o supernasce e resuspenque a pelota contendo os parasitas em meio RPMI completo para determinar a densidade celular contando células em uma câmara de Neubauer.

2. Controle do protocolo de imunofluorescência

NOTA: Uma vez fixado, é possível armazenar placas contendo tampas a 4 °C em 1x PBS (pH 7.2) por uma semana. Para serem armazenadas, é importante que as células não tenham passado pela etapa de permeabilização.

1. Instale células LLC-MK2 (2 x ¹⁰⁴) em 24 placas de poço contendo tampas arredondadas UV esterilizadas em mídia RPMI por 16 horas.
2. Para células infectadas, adicione um supernacante contendo T. cruzi (item 1.4) a cada poço em proporção (MOI 10:1) e deixe por 6h de infecção. As tampas de lavagem contendo células infectadas e não infectadas cinco vezes com solução PBS e fixadas com 2% de paraformaldeído em 1x PBS (pH 7.2) por 10 minutos à temperatura ambiente (TR).
3. Lave as tampas três vezes por 5 minutos cada com 1x PBS (pH 7.2).
4. Permeabilize as tampas com 0,2% IGEPAL CA-630 em 1x PBS (PH 7.2) por 10 min na RT.
5. Lave as tampas três vezes por 5 minutos cada com 1x PBS.
6. Incubar tampas por 30 min na RT com a solução de bloqueio (2% BSA em 1x PBS, pH 7.2).
7. Incubar tampas por 30 min no RT, seja com anticorpos anti-hnRNPA1 monoclonais do rato (diluição 1:200) ou com anticorpos anti-TcFAZ policlonais do camundongo (diluição 1:100) diluídos na solução de bloqueio.
8. Lave as tampas três vezes por 5 minutos cada com 1x PBS.
9. Incubar as tampas por 30 minutos no RT com anti-rato de cabra IgG F (ab')2 (H+L) conjugado à Alexa Fluor 488 (1:600) juntamente com a fhalloidina conjugada à Alexa 594 (1:300) para manchar filamentos de actina (F-actin) na célula hospedeira diluída na solução de bloqueio.
10. Lave três vezes com 1x PBS (pH 7.2) por 5 min cada.
11. Aplique uma pequena quantidade de reagente de montagem antifade ProLong Gold com meio DAPI na superfície do slide.
12. Com fórceps, incline suavemente a mancha no meio de montagem para evitar que as bolhas se formem. Uma vez seco, sele a tampa se desejar.

3. Protocolo de imunofluorescência de rotulagem dupla usando anticorpos monoclonais e policlonais levantados no mesmo hospedeiro

1. Repetir as etapas 2.1 a 2.6 descritas acima.
2. Incubar tampas contendo células infectadas e não infectadas com anticorpo anti-TcFAZ policlonal do camundongo interno (1:100) diluído em solução de bloqueio por 30 minutos no RT.
3. Lave as tampas três vezes por 5 minutos cada com 1x PBS.
4. Incubar tampas por 30 min no RT com anti-rato de cabra IgG F (ab')2 (H+L) conjugado à Alexa Fluor 647 (1:600) diluída na solução de bloqueio.
5. Lave as tampas três vezes por 5 minutos cada com 1x PBS.
6. Realize a segunda etapa de bloqueio com IgG anti-rato de coelho AffiniPure (H+L) diluído (0,12 mg/mL) na solução de bloqueio por 30 min na RT.
7. Lave as tampas três vezes com 1x PBS (pH 7.2) por 5 min cada. Em seguida, incubar com anticorpo anti-hnRNP A1 IgG2b (1:200) por 30 min no RT.
8. Lave as tampas três vezes por 5 minutos cada com 1x PBS.
9. Incubar as tampas por 30 minutos com anticorpo IgG2b anti-rato de cabra conjugado à Alexa Fluor 488 (1:600) e com faloide conjugada à Alexa 594 (1:300) diluída na solução de bloqueio.
10. Lave as tampas três vezes por 5 minutos cada com 1x PBS.
11. Repetir passos 2.8 a 2.10 descritos acima.

4. Protocolo de imunofluorescência de rotulagem tripla com a adição do terceiro anticorpo policlonal de diferentes espécies hospedeiras

NOTA: Para a rotulagem adicional, observe as subclasses IgG, isótipos de anticorpos e siga a ordem dos anticorpos: 1. policlonal do rato, 2. polclonal de coelho, 3. segundo bloco e 4. monoclonal do rato. Considere o tipo de lasers disponíveis no microscópio confocal para escolher o anticorpo secundário conjugado por fluorohore correto.

1. Repetir as etapas 2.1 a 2.6 descritas acima.
2. Após as etapas 3.2 a 3.5 (etapa de lavagem), inicie uma nova incubação com anticorpo policlonal de coelho na solução de bloqueio por 30 minutos na RT.
3. Lave as tampas três vezes com 1x PBS (pH 7.2) por 5 minutos cada.
4. Incubar as tampas com anticorpo anti-coelho de cabra IgG conjugado à Alexa 647 (1:600) em solução de bloqueio por 30 minutos.
5. Lave as tampas três vezes por 5 minutos cada com 1x PBS.
6. Execute uma etapa de bloqueio com IgG anti-rato de coelho AffiniPure (H+L) diluído (0,12 mg/mL) na solução de bloqueio por 30 min no RT.
7. Lave as tampas três vezes com 1x PBS (pH 7.2) por 5 minutos cada e incuba com qualquer anticorpo monoclonal IgG do mouse diluído em solução de bloqueio por 30 minutos.
8. Lave as tampas três vezes por 5 minutos cada com 1x PBS.
9. Incubar as tampas por 30 minutos com um par específico de anticorpos de subclasse IgG anti-rato de cabra conjugados à Alexa 594 (1:600) em solução de bloqueio por 30 minutos.
10. Lave as tampas três vezes por 5 minutos cada com 1x PBS.

5. Aquisição de imagens confocal

1. Analise as amostras de imunofluorescência utilizando um microscópio confocal, com um objetivo de imersão de óleo 63X e detecte a fluorescência com um tubo fotomultiplier (PMT) e detector híbrido (HyD).
   NOTA: Utilizamos a instalação do Laboratório Multiusuário de Microscopia Confocal - LMMC, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo.
2. Adquira todas as imagens confocal com canais separados. Realize o processamento de imagens usando o Adobe Photoshop.

Resultados

Aqui, mostramos como estudar interações hospedeiro-parasita por imunofluorescência quando a fonte de anticorpos é limitada devido à indisponibilidade de anticorpos comerciais que reconhecem estruturas e proteínas específicas em tripanosomatidas.

Entre os trypanosomatids, T. cruzi possui um dos ciclos de vida mais complexos envolvendo vários estágios de desenvolvimento entre vertebrados e hospedeiros invertebrados ¹⁹. Durante o ciclo de vida de T. c...

Discussão

Aqui, apresentamos um protocolo para realizar imunolabécimo duplo em células infectadas trypanosoma cruzi usando dois anticorpos diferentes da mesma espécie hospedeira. Para estudar, com mais detalhes, as implicações da infecção, estruturas na célula hospedeira, como o núcleo ou organelas citosóicas podem ser rotuladas usando este protocolo. Além disso, pode ser usado no método de rotulagem de imunogold de seção fina pós-incorporação. Essa abordagem ajuda a superar o obstáculo de ter poucos ant...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 488 - IgG2b antibody	Life technologies, USA	A21141	Goat anti-mouse
AffiniPure Rabbit anti-mouse IgG (H+L)	Jackson Immunoresearch, USA	315-005-003	Anti-mouse antibody
Alexa Fluor 488 - IgG F (ab')2 (H+L) antibody	Life technologies, USA	A11017	Goat anti mouse
Alexa Fluor 594 IgG1 antibody	Life technologies, USA	A21125	Goat anti-mouse
Alexa Fluor 647 - IgG F (ab')2 (H+L) antibody	Life technologies, USA	A21237	Goat anti-mouse
Anti-hnRNPA1 antibody IgG2b	Sigma-Aldrich, USA	R4528	Mouse antibody
anti-TcFAZ (T. cruzi FAZ protein) antibody	Our lab	In-house	Mouse antibody
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich, USA	A2153-10G	Albumin protein
Detergent Igepal CA-630	Sigma-Aldrich, USA	I3021	Nonionic Detergent
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco, Thermo fisher scientific, USA	12657-029	Serum
Penicillin Streptomycin	Gibco, Thermo fisher scientific, USA	15140-122	Antibiotic
Phalloidin Alexa Fluor 594	Life technologies, USA	A12381	Actin marker
ProLong Gold antifade with DAPI	Life technologies, USA	P36935	Mounting media reagent
RPMI 1640 1X with L-glutamine	Corning, USA	10-040-CV	Cell culture media
Trypsin-EDTA solution	Sigma-Aldrich, USA	T4049-100ML	Bioreagent