Doppelmarkierung der Immunfluoreszenz unter Verwendung von Antikörpern derselben Spezies zur Untersuchung von Wirt-Pathogen-Interaktionen

Zusammenfassung

Hier beschreibt das Protokoll, wie man eine doppelte Markierung der Immunfluoreszenz unter Verwendung von primären Antikörpern durchführt, die in derselben Spezies aufgezogen wurden, um Wirt-Pathogen-Interaktionen zu untersuchen. Es kann auch den dritten Antikörper von einem anderen Wirt in diesem Protokoll enthalten. Dieser Ansatz kann in jedem Zelltyp und Pathogen durchgeführt werden.

Zusammenfassung

Heutzutage ist es möglich, eine breite Palette von molekularen Werkzeugen zu finden, um Parasiten-Wirts-Zell-Interaktionen zu untersuchen. Es bestehen jedoch einige Einschränkungen, um kommerzielle monoklonale oder polyklonale Antikörper zu erhalten, die spezifische Zellstrukturen und Proteine in Parasiten erkennen. Außerdem gibt es nur wenige kommerzielle Antikörper zur Kennzeichnung von Trypanosomatiden. Normalerweise werden polyklonale Antikörper gegen Parasiten im eigenen Haus hergestellt und könnten in Kombination mit anderen Antikörpern, die in derselben Spezies produziert werden, schwieriger zu verwenden sein. Hier zeigt das Protokoll, wie polyklonale und monoklonale Antikörper, die in derselben Spezies gezüchtet wurden, verwendet werden, um eine Doppeltemarkierung der Immunfluoreszenz durchzuführen, um wirtszell- und pathogeninteraktionen zu untersuchen. Um die doppelmarkierende Immunfluoreszenz zu erreichen, ist es entscheidend, zuerst den polyklonalen Antikörper der Maus zu inkubieren und dann die Inkubation mit dem sekundären Maus-IgG-Antikörper zu verfolgen, der mit einem beliebigen Fluorochrom konjugiert ist. Danach ist ein zusätzlicher Blockierungsschritt notwendig, um zu verhindern, dass spuren des primären Antikörpers vom nächsten sekundären Antikörper erkannt werden. Dann werden ein monoklonaler Maus-Antikörper und sein spezifischer sekundärer IgG-Unterklasse-Antikörper, der an ein anderes Fluorochrom konjugiert ist, zu den geeigneten Zeitpunkten in die Probe gegeben. Darüber hinaus ist es möglich, eine dreifache Markierung der Immunfluoreszenz mit einem dritten Antikörper durchzuführen, der in einer anderen Spezies aufgezogen wurde. Auch Strukturen wie Kerne und Aktin können anschließend mit ihren spezifischen Verbindungen oder Markierungen gefärbt werden. Somit können diese hier vorgestellten Ansätze für jede Zelle angepasst werden, deren Primärantikörperquellen begrenzt sind.

Einleitung

Die Untersuchung der Interaktion des Erregers mit der Wirtszelle auf zellulärer Ebene liefert wesentliche Informationen über die zugrunde liegenden Ursachen der Krankheit, da verschiedene Gruppen wie Viren, Bakterien und Protozoen die meisten Wirtszelltypen infizieren können1,2,3,4. Es kann auch dazu beitragen, potenzielle therapeutische Ziele zu entwickeln und zu identifizieren, die das Wachstum des Erregers verlangsamen oder hemmen können. Unter Lebensbedingungen sind die produzierten Antikörper für die Erkennung von Selbstkomponenten, Antigenen von Viren, bakteriellen Komponenten oder Produkten, Pilzen, Parasiten und anderen ^{verantwortlich5}.

Zu diesem Zweck sind Antikörper weit verbreitete Werkzeuge, hauptsächlich zum Verständnis der Lage und Funktion zellulärer Strukturen und Proteine. Mehrere Studien mit multipler Antikörpermarkierung zeigen, dass zusätzliche Blockierungsschritte zur Spezifität der Immunlokalisierung beitragen. Darüber hinaus verwenden die meisten beschriebenen Protokolle spezifische kommerzielle monoklonale Antikörper, einschließlich Antikörper von derselben Wirtsspezies6,7,8,9,10,11,12,13,14.

Normalerweise verwendet die Doppelmarkierung der Immunfluoreszenz zwei Antikörper, die in verschiedenen Spezies aufgezogen werden, um die Zellstrukturen von Interesse oder die Krankheitserreger und die Wirtszellen zu färben, um die Interaktion zwischen ihnen zu sehen. Dies kann jedoch ein Problem sein, wenn keine kommerziellen monoklonalen oder polyklonalen Antikörper speziell für einige Krankheitserreger zur Verfügung stehen, um die Doppelmarkierung durchzuführen. Außerdem gibt es kommerziell erhältliche Antikörperkonjugationskits, und es ist möglich, die primären Antikörper durch eine Succinimidylesterreaktion direkt an das Fluorophor zu ^{konjugieren15}. Das Problem ist, dass diese Kits oft teuer sind und es notwendig ist, genügend Antikörper zu haben, um sie zu markieren. Mit diesem Wissen haben wir erfolgreich eine doppelte Immunfluoreszenzmethode entwickelt, bei der zwei verschiedene Antikörper verwendet werden, die in derselben Spezies gezüchtet wurden, um die Proteinlokalisation in Trypanosoma brucei16 zu ^untersuchen. Für intrazelluläre Parasiten, einschließlich Trypanosoma cruzi, wurde dieser Ansatz jedoch nicht nachgewiesen. Hier zeigen wir, wie man eine Doppelmarkierung der Immunfluoreszenz durchführt, um intrazelluläre T. cruzi-Parasiten und die Wirtszelle mit primären Antikörpern zu untersuchen, die in derselben Spezies ohne Kreuzreaktionen aufgezogen wurden. Neben dieser Methode wurde eine dreifache Immunfluoreszenzmarkierung unter Zugabe des dritten Antikörpers einer anderen Spezies etabliert. Diese Ansätze helfen, wenn die Quelle von Antikörpern begrenzt ist und kann in jedem Zelltyp verwendet werden.

Protokoll

1. Zell- und Parasitenkulturen

1. Züchten Sie LLC-MK2 -Zellen (Rhesus Monkey Kidney Epithelial) aus der American Type Culture Collection (CCL-7) in einem 25 ^cm2 Zellkulturkolben, der in RPMI-Medium enthalten ist, ergänzt mit 10% hitzeinaktiviertem FBS (Fetal Bovine Serum) und Antibiotika (100 U / ml Penicillin und 100 μg / ml Streptomycin) bei 37 ° C in 5% _CO2 ¹⁷.
2. Infizieren Sie LLC-MK2-Zellen mit Trypanosoma cruzi (Y-Stamm) gemäß einem früheren Protokoll ¹⁸.
3. Sammeln Sie den Überstand der LLC-MK2-infizierten Zellen (5 ml) in einem konischen Zentrifugenröhrchen mit 15 ml Zellkultur und zentrifugieren Sie bei 500 x g für 10 Minuten und 22 °C zu niedrigeren Zelltrümmern. Halten Sie die Röhre 10 Minuten bei 37 °C, damit Trypomastigoten zum Überstand schwimmen können.
4. Den Überstand in einem neuen konischen Rohr auffangen und bei 2500 x g 15 Minuten bei 22 °C zentrifugieren. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet, das die Parasiten enthält, in einem vollständigen RPMI-Medium, um die Zelldichte zu bestimmen, indem Zellen in einer Neubauer-Kammer gezählt werden.

2. Immunfluoreszenzprotokoll kontrollieren

HINWEIS: Einmal fixiert, ist es möglich, Platten mit Deckgläsern bei 4 °C in 1x PBS (pH 7,2) für eine Woche zu lagern. Um gespeichert zu werden, ist es wichtig, dass die Zellen den Permeabilisierungsschritt nicht durchlaufen haben.

1. LLC-MK2-Zellen (2 x ¹⁰⁴) werden 16 Stunden lang in 24 Well-Platten mit UV-sterilisierten abgerundeten Deckgläsern in RPMI-Medien abgesetzt.
2. Bei infizierten Zellen wird zu jeder Vertiefung im Verhältnis (MOI 10:1) ein Überstand gegeben, der T. cruzi (Punkt 1.4) enthält, und 6 h infektionsfrei stehen lassen. Deckgläser, die infizierte und nicht infizierte Zellen enthalten, fünfmal mit PBS-Lösung waschen und mit 2% Paraformaldehyd in 1x PBS (pH 7,2) für 10 min bei Raumtemperatur (RT) fixieren.
3. Waschen Sie die Deckgläser dreimal für jeweils 5 Minuten mit 1x PBS (pH 7,2).
4. Permeabilisieren Sie die Deckgläser mit 0,2% IGEPAL CA-630 in 1x PBS (PH 7,2) für 10 min bei RT.
5. Waschen Sie die Deckgläser dreimal für jeweils 5 Minuten mit 1x PBS.
6. Deckgläser für 30 min bei RT mit der Sperrlösung (2% BSA in 1x PBS, pH 7,2) inkubieren.
7. Inkubieren Sie Deckgläser für 30 min bei RT entweder mit monoklonalen Anti-hnRNPA1-Antikörpern der Maus (Verdünnung 1:200) oder mit polyklonalen Anti-TcFAZ-Antikörpern (Verdünnung 1:100) der Maus, die in Blocklösung verdünnt sind.
8. Waschen Sie die Deckgläser dreimal für jeweils 5 Minuten mit 1x PBS.
9. Inkubieren Sie die Deckgläser für 30 min bei RT mit Ziegen-Anti-Maus-IgG F (ab')2 (H + L), konjugiert mit Alexa Fluor 488 (1:600) zusammen mit Phalloidin, das an Alexa 594 (1:300) konjugiert ist, um Aktinfilamente (F-Aktin) in der in der Blocklösung verdünnten Wirtszelle zu färben.
10. Dreimal mit 1x PBS (pH 7,2) für jeweils 5 min waschen.
11. Tragen Sie eine kleine Menge ProLong Gold Antifade-Montagereagenz mit DAPI-Medium auf die Oberfläche des Objektträgers auf.
12. Kippen Sie den Deckstab mit einer Pinzette vorsichtig in das Montagemedium, um die Bildung von Blasen zu verhindern. Nach dem Trocknen den Deckglas auf Wunsch versiegeln.

3. Double Labeling Immunofluorescence Protocol unter Verwendung von monoklonalen und polyklonalen Antikörpern, die im selben Wirt aufgezogen wurden

1. Wiederholen Sie die oben beschriebenen Schritte 2.1 bis 2.6.
2. Inkubieren Sie Deckgläser, die infizierte und nicht infizierte Zellen enthalten, mit dem hauseigenen polyklonalen Anti-TcFAZ-Antikörper der Maus (1:100), verdünnt in Blocklösung für 30 min bei RT.
3. Waschen Sie die Deckgläser dreimal für jeweils 5 Minuten mit 1x PBS.
4. Coverlips für 30 min bei RT mit Ziegen-Anti-Maus-IgG F (ab')2 (H+L) konjugiert mit Alexa Fluor 647 (1:600) konjugiert in der Blockierlösung inkubieren.
5. Waschen Sie die Deckgläser dreimal für jeweils 5 Minuten mit 1x PBS.
6. Führen Sie den zweiten Blockierungsschritt mit AffiniPure Kaninchen-Anti-Maus-IgG (H+ L) verdünnt (0,12 mg/ml) in Blockierlösung für 30 min bei RT durch.
7. Waschen Sie die Deckgläser dreimal mit 1x PBS (pH 7,2) für jeweils 5 min. Anschließend mit dem monoklonalen Anti-hnRNP A1 IgG2b-Antikörper (1:200) der Maus für 30 min bei RT inkubieren.
8. Waschen Sie die Deckgläser dreimal für jeweils 5 Minuten mit 1x PBS.
9. Inkubieren Sie die Deckgläser für 30 min mit einem Ziegen-Anti-Maus-IgG2b-Antikörper, der mit Alexa Fluor 488 (1:600) konjugiert ist, und mit Phalloidin, das mit Alexa 594 (1:300) konjugiert ist, verdünnt in der Blockierungslösung.
10. Waschen Sie die Deckgläser dreimal für jeweils 5 Minuten mit 1x PBS.
11. Wiederholen Sie die oben beschriebenen Schritte 2.8 bis 2.10.

4. Triple-Labeling-Immunfluoreszenz-Protokoll mit dem Zusatz des dritten polyklonalen Antikörpers von verschiedenen Wirtsspezies

HINWEIS: Beachten Sie für die zusätzliche Markierung die IgG-Unterklassen, Antikörperisotypen und folgen Sie der Reihenfolge der Antikörper: 1. Maus polyklonal, 2. Kaninchen polyklonal, 3. zweiter Block und 4. Maus monoklonal. Berücksichtigen Sie die Art der im konfokalen Mikroskop verfügbaren Laser, um den richtigen fluorophorkonjugierten sekundären Antikörper auszuwählen.

1. Wiederholen Sie die oben beschriebenen Schritte 2.1 bis 2.6.
2. Nach den Schritten 3.2 bis 3.5 (Waschschritt) beginnen Sie eine neue Inkubation mit einem polyklonalen Kaninchen-Antikörper in Blockierlösung für 30 Minuten bei RT.
3. Waschen Sie die Deckgläser dreimal mit 1x PBS (pH 7,2) für jeweils 5 Minuten.
4. Inkubieren Sie die Deckgläser mit dem an Alexa 647 (1:600) konjugierten Ziegen-Anti-Kaninchen-Antikörper IgG in Blocklösung für 30 Minuten.
5. Waschen Sie die Deckgläser dreimal für jeweils 5 Minuten mit 1x PBS.
6. Führen Sie einen Blockierungsschritt mit AffiniPure Kaninchen-Anti-Maus-IgG (H + L) verdünnt (0,12 mg /ml) in Blockierlösung für 30 min bei RT durch.
7. Waschen Sie die Deckgläser dreimal mit 1x PBS (pH 7,2) für jeweils 5 Minuten und inkubieren Sie mit einem beliebigen monoklonalen IgG-Subklassen-Antikörper der Maus, der in Blocklösung verdünnt ist, für 30 Minuten.
8. Waschen Sie die Deckgläser dreimal für jeweils 5 Minuten mit 1x PBS.
9. Inkubieren Sie die Deckgläser für 30 Minuten mit einem bestimmten Paar Ziegen-Anti-Maus-IgG-Subklassen-Antikörper, der mit Alexa 594 (1:600) konjugiert ist, in Blocklösung für 30 Minuten.
10. Waschen Sie die Deckgläser dreimal für jeweils 5 Minuten mit 1x PBS.

5. Konfokale Bildgebung

1. Analysieren Sie die Immunfluoreszenzproben mit einem konfokalen Mikroskop mit einem 63-fachen Ölimmersionsobjektiv und detektieren Sie die Fluoreszenz mit einem Photomultiplierrohr (PMT) und einem Hybriddetektor (HyD).
   HINWEIS: Wir haben das Setup des Multiuser Laboratory of Confocal Microscopy - LMMC, Ribeirao Preto Medical School, University of Sao Paulo, verwendet.
2. Erfassen Sie alle konfokalen Bilder mit getrennten Kanälen. Führen Sie die Bildverarbeitung mit Adobe Photoshop durch.

Ergebnisse

Hier zeigen wir, wie wir Wirt-Parasiten-Interaktionen durch Immunfluoreszenz untersuchen können, wenn die Quelle von Antikörpern aufgrund der Nichtverfügbarkeit kommerzieller Antikörper, die spezifische Strukturen und Proteine in Trypanosomatiden erkennen, begrenzt ist.

Unter den Trypanosomatiden hat T. cruzi einen der komplexesten Lebenszyklen mit verschiedenen Entwicklungsstadien zwischen Wirbeltieren und wirbellosen Wirten ¹⁹. Während des Lebenszykl...

Diskussion

Hier stellen wir ein Protokoll zur Durchführung einer doppelten Immunmarkierung in mit Trypanosoma cruzi infizierten Zellen mit zwei verschiedenen Antikörpern derselben Wirtsspezies vor. Um die Auswirkungen der Infektion genauer zu untersuchen, können Strukturen in der Wirtszelle wie der Zellkern oder zytosolische Organellen mit diesem Protokoll markiert werden. Es kann auch in der Post-Embedding-Dünnschnitt-Immunogold-Markierungsmethode verwendet werden. Dieser Ansatz hilft, das Hindernis zu überwinden, nu...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 488 - IgG2b antibody	Life technologies, USA	A21141	Goat anti-mouse
AffiniPure Rabbit anti-mouse IgG (H+L)	Jackson Immunoresearch, USA	315-005-003	Anti-mouse antibody
Alexa Fluor 488 - IgG F (ab')2 (H+L) antibody	Life technologies, USA	A11017	Goat anti mouse
Alexa Fluor 594 IgG1 antibody	Life technologies, USA	A21125	Goat anti-mouse
Alexa Fluor 647 - IgG F (ab')2 (H+L) antibody	Life technologies, USA	A21237	Goat anti-mouse
Anti-hnRNPA1 antibody IgG2b	Sigma-Aldrich, USA	R4528	Mouse antibody
anti-TcFAZ (T. cruzi FAZ protein) antibody	Our lab	In-house	Mouse antibody
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich, USA	A2153-10G	Albumin protein
Detergent Igepal CA-630	Sigma-Aldrich, USA	I3021	Nonionic Detergent
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco, Thermo fisher scientific, USA	12657-029	Serum
Penicillin Streptomycin	Gibco, Thermo fisher scientific, USA	15140-122	Antibiotic
Phalloidin Alexa Fluor 594	Life technologies, USA	A12381	Actin marker
ProLong Gold antifade with DAPI	Life technologies, USA	P36935	Mounting media reagent
RPMI 1640 1X with L-glutamine	Corning, USA	10-040-CV	Cell culture media
Trypsin-EDTA solution	Sigma-Aldrich, USA	T4049-100ML	Bioreagent