Двойная маркировка иммунофлуоресценции с использованием антител одного и того же вида для изучения взаимодействий хозяина и патогена

Резюме

Здесь протокол описывает, как выполнить двойную маркировку иммунофлуоресценции с использованием первичных антител, выращенных у одного и того же вида, для изучения взаимодействий хозяина и патогена. Кроме того, он может включать третье антитело от другого хозяина в этот протокол. Такой подход может быть выполнен в любом типе клеток и патогенов.

Аннотация

В настоящее время можно найти широкий спектр молекулярных инструментов, доступных для изучения взаимодействия паразитов и клеток-хозяев. Однако существуют некоторые ограничения для получения коммерческих моноклональных или поликлональных антител, которые распознают специфические клеточные структуры и белки у паразитов. Кроме того, существует мало коммерческих антител, доступных для маркировки трипаносоматидов. Обычно поликлональные антитела против паразитов готовятся собственными силами и могут быть более сложными для использования в сочетании с другими антителами, продуцируемыми у того же вида. Здесь протокол демонстрирует, как использовать поликлональные и моноклональные антитела, выращенные у одного и того же вида, для выполнения двойной маркировки иммунофлуоресценции для изучения взаимодействия клеток хозяина и патогенов. Для достижения двойной маркировки иммунофлуоресценции крайне важно инкубировать сначала поликлональное антитело мыши, а затем следовать за инкубацией с вторичным мышиным антителом IgG, конъюгированным с любым фторхромом. После этого необходим дополнительный блокирующий этап, чтобы предотвратить распознавание любого следа первичного антитела следующим вторичным антителом. Затем к образцу добавляют моноклональное антитело мыши и его специфическое вторичное антитело подкласса IgG, конъюгированное с другим фторхромом. Кроме того, можно выполнить тройную маркировку иммунофлуоресценции с использованием третьего антитела, выращенного у другого вида. Кроме того, такие структуры, как ядра и актин, могут быть окрашены впоследствии их специфическими соединениями или метками. Таким образом, представленные здесь подходы могут быть скорректированы для любой клетки, источники первичных антител которой ограничены.

Введение

Изучение взаимодействия патогена с клеткой-хозяином на клеточном уровне предоставляет важную информацию об основных причинах заболевания, поскольку различные группы, такие как вирусы, бактерии и простейшие, могут заражать большинство типов клеток-хозяев 1,2,3,4. Это также может помочь разработать и идентифицировать потенциальные терапевтические цели, которые могут замедлить или ингибировать рост патогена. В живых условиях вырабатываемые антитела отвечают за распознавание самокомпонентов, антигенов из вирусов, бактериальных компонентов или продуктов, грибков, паразитов и ^др.5.

Для этой цели антитела широко используются инструментами, в основном для понимания расположения и функции клеточных структур и белков. Несколько исследований с использованием множественной маркировки антител показывают, что дополнительные блокирующие этапы способствуют специфичности иммунолокализации. Кроме того, в большинстве описанных протоколов используются специфические коммерческие моноклональные антитела, включая антитела от одного и того же вида хозяина6,7,8,9,10,11,12,13,14.

Обычно двойная маркировка иммунофлуоресценции использует два антитела, выращенных у разных видов, чтобы окрашивать интересующие клеточные структуры или патогены и клетки-хозяева, чтобы увидеть взаимодействие между ними. Однако это может быть проблемой, когда коммерческие моноклональные или поликлональные антитела, специфичные для некоторых патогенов, недоступны для выполнения двойной маркировки. Кроме того, существуют коммерчески доступные наборы конъюгации антител, и можно конъюгировать первичные антитела непосредственно к флуорофору с помощью реакции сукцинимидилового ^эфира15. Проблема в том, что эти наборы часто дорогие, и необходимо иметь достаточно антител, чтобы маркировать их. Зная это, мы успешно разработали метод двойной иммунофлуоресценции с использованием двух разных антител, выращенных у одного и того же вида, для изучения локализации белка в Trypanosoma brucei16. Однако для внутриклеточных паразитов, включая Trypanosoma cruzi, такой подход не был продемонстрирован. Здесь мы покажем, как выполнить двойную маркировку иммунофлуоресценции для изучения внутриклеточных паразитов T. cruzi и клетки-хозяина с использованием первичных антител, выращенных у одного и того же вида без перекрестных реакций. Кроме этого метода установлена тройная иммунофлуоресцентная маркировка с добавлением третьего антитела от другого вида. Эти подходы помогают, когда источник антител ограничен и может быть использован в любом типе клеток.

протокол

1. Культуры клеток и паразитов

1. Выращивайте клетки LLC-MK2 (Rhesus Monkey Kidney Epithelial) из Американской коллекции культур типа (CCL-7) в колбе для клеточной культуры объемом ^{25 см2}, содержащейся в среде RPMI, дополненной 10% термоинактивированным FBS (фетальная бычья сыворотка) и антибиотиками (100 ЕД / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина) при 37 ° C в 5% _CO2 ¹⁷.
2. Инфицировать клетки LLC-MK2 Trypanosoma cruzi (штамм Y) в соответствии с предыдущим протоколом ¹⁸.
3. Соберите супернатант инфицированных LLC-MK2 клеток (5 мл) в 15 мл клеточной культуры конической центрифужной трубки и центрифугу при 500 х г в течение 10 минут и 22 °C для снижения клеточного мусора. Держите трубку в течение 10 минут при температуре 37 °C, чтобы трипомастиготы доплыли до надосадочного вещества.
4. Соберите супернатант в новую коническую трубку и центрифугу при 2500 х г в течение 15 минут при 22 °C. Выбросьте супернатант и повторно суспендируйте гранулу, содержащую паразитов, в полной среде RPMI, чтобы определить плотность клеток путем подсчета клеток в камере Нойбауэра.

2. Контрольный протокол иммунофлуоресценции

ПРИМЕЧАНИЕ: После фиксации можно хранить пластины, содержащие крышки при 4 °C в 1x PBS (pH 7,2) в течение одной недели. Для хранения важно, чтобы клетки не прошли стадию пермеабилизации.

1. Размещать ячейки ООО-МК2 (2 х ¹⁰⁴) в 24 пластинах скважины, содержащих УФ-стерилизованные округлые покровы, в средах RPMI в течение 16 часов.
2. Для инфицированных клеток добавьте супернатант, содержащий T. cruzi (пункт 1.4), к каждой лунке в пропорции (MOI 10: 1) и оставьте на 6 ч инфекции. Промыть крышки, содержащие инфицированные и неинфицированные клетки, пять раз раствором PBS и зафиксировать 2% параформальдегидом в 1x PBS (pH 7,2) в течение 10 мин при комнатной температуре (RT).
3. Промывайте крышки три раза в течение 5 минут каждый с 1 pBS (pH 7,2).
4. Пермеабилизируйте обшивки 0,2% IGEPAL CA-630 в 1x PBS (PH 7.2) в течение 10 мин при RT.
5. Вымойте крышки три раза в течение 5 минут каждый с 1x PBS.
6. Инкубировать крышки в течение 30 мин на RT блокирующим раствором (2% BSA в 1x PBS, рН 7,2).
7. Инкубировать покровы в течение 30 мин на RT либо с мышиными моноклональными анти-hnRNPA1 (разведение 1:200), либо с мышиными поликлональными анти-TcFAZ (разведение 1:100) антителами, разведенными в блокирующем растворе.
8. Вымойте крышки три раза в течение 5 минут каждый с 1x PBS.
9. Инкубируют покровы в течение 30 мин при RT с козьим антимышевым IgG F (ab')2 (H+L), конъюгированным с Alexa Fluor 488 (1:600) вместе с фаллоидином, конъюгированным с Alexa 594 (1:300) для окрашивания актиновых нитей (F-актина) в клетке-хозяине, разведенной в блокирующем растворе.
10. Промыть три раза с 1x PBS (pH 7,2) в течение 5 минут каждый.
11. Нанесите небольшое количество антизатухающего монтажного реагента ProLong Gold со средой DAPI на поверхность слайда.
12. С помощью щипцов осторожно наклоните крышку в монтажной среде, чтобы предотвратить образование пузырьков. После высыхания при желании запечатайте крышку.

3. Протокол двойной маркировки иммунофлуоресценции с использованием моноклональных и поликлональных антител, выращенных у одного и того же хозяина

1. Повторите шаги с 2.1 по 2.6, описанные выше.
2. Инкубировать покровные листы, содержащие инфицированные и неинфицированные клетки, с собственным мышиным поликлональным анти-TcFAZ антителом (1:100), разбавленным в блокирующем растворе в течение 30 мин при РТ.
3. Вымойте крышки три раза в течение 5 минут каждый с 1x PBS.
4. Инкубировать крышки в течение 30 мин при RT с козьим антимышевым IgG F (ab')2 (H+L), конъюгированным с Alexa Fluor 647 (1:600), разведенным в блокирующем растворе.
5. Вымойте крышки три раза в течение 5 минут каждый с 1x PBS.
6. Выполните второй блокирующий этап с помощью антимышечного антимышечного препарата AffiniPure (H+L), разбавленного (0,12 мг/мл) в блокирующем растворе в течение 30 мин при РТ.
7. Трижды вымойте крышки с 1 pBS (pH 7,2) в течение 5 минут каждая. Затем инкубируют с мышиным моноклональным анти-hnRNP A1 IgG2b антителом (1:200) в течение 30 мин при RT.
8. Вымойте крышки три раза в течение 5 минут каждый с 1x PBS.
9. Инкубируют покровы в течение 30 мин с козьим антимышиным антителом IgG2b, конъюгированным с Alexa Fluor 488 (1:600) и с фаллоидином, конъюгированным с Alexa 594 (1:300), разбавленным в блокирующем растворе.
10. Вымойте крышки три раза в течение 5 минут каждый с 1x PBS.
11. Повторите шаги с 2.8 по 2.10, описанные выше.

4. Протокол тройной маркировки иммунофлуоресценции с добавлением третьего поликлонального антитела от разных видов хозяев

ПРИМЕЧАНИЕ: Для дополнительной маркировки обратите внимание на подклассы IgG, изотипы антител и следуйте порядку антител: 1. мышиный поликлональный, 2. кроличий поликлональный, 3. второй блок и 4. мышиный моноклональный. Рассмотрим тип лазеров, доступных в конфокальном микроскопе, чтобы выбрать правильное флуорофорно-конъюгированное вторичное антитело.

1. Повторите шаги с 2.1 по 2.6, описанные выше.
2. После шагов с 3,2 по 3,5 (этап промывки) начинают новую инкубацию с кроличьим поликлональным антителом в блокирующем растворе в течение 30 минут при РТ.
3. Вымойте крышки три раза с 1 pBS (pH 7,2) в течение 5 минут каждый.
4. Инкубируют покровы с козьим анти-кроликовым антителом IgG, конъюгированным с Alexa 647 (1:600) в блокирующем растворе в течение 30 минут.
5. Вымойте крышки три раза в течение 5 минут каждый с 1x PBS.
6. Выполните блокирующий этап с помощью антимышечного антимышечного препарата AffiniPure (H+L), разбавленного (0,12 мг/мл) в блокирующем растворе в течение 30 мин при РТ.
7. Промыть крышки три раза с 1x PBS (рН 7,2) в течение 5 минут каждый и инкубировать с любым мышиным моноклональным антителом подкласса IgG, разведенным в блокирующем растворе в течение 30 минут.
8. Вымойте крышки три раза в течение 5 минут каждый с 1x PBS.
9. Инкубируйте крышки в течение 30 минут со специфической парой антимышьих антител против мыши IgG, конъюгированных с Alexa 594 (1:600) в блокирующем растворе в течение 30 минут.
10. Вымойте крышки три раза в течение 5 минут каждый с 1x PBS.

5. Получение конфокальных изображений

1. Проанализируйте образцы иммунофлуоресценции с помощью конфокального микроскопа с масляным погружным объективом 63X и обнаружите флуоресценцию с помощью фотоумножителя (PMT) и гибридного детектора (HyD).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мы использовали установку из Многопользовательской лаборатории конфокальной микроскопии - LMMC, Медицинская школа Рибейрао Прету, Университет Сан-Паулу.
2. Получайте все конфокальные изображения с помощью отдельных каналов. Выполняйте обработку изображений с помощью Adobe Photoshop.

Результаты

Здесь мы покажем, как изучать взаимодействия хозяин-паразит путем иммунофлуоресценции, когда источник антител ограничен из-за отсутствия коммерческих антител, которые распознают специфические структуры и белки в трипаносоматидах.

Среди трипаносоматидов T. cruzi име?...

Обсуждение

Здесь мы представляем протокол для выполнения двойной иммуномаркировки инфицированных Trypanosoma cruzi клеток с использованием двух разных антител от одного и того же вида-хозяина. Чтобы изучить более подробно последствия инфекции, структуры в клетке-хозяине, такие как ядро или цитозол...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 488 - IgG2b antibody	Life technologies, USA	A21141	Goat anti-mouse
AffiniPure Rabbit anti-mouse IgG (H+L)	Jackson Immunoresearch, USA	315-005-003	Anti-mouse antibody
Alexa Fluor 488 - IgG F (ab')2 (H+L) antibody	Life technologies, USA	A11017	Goat anti mouse
Alexa Fluor 594 IgG1 antibody	Life technologies, USA	A21125	Goat anti-mouse
Alexa Fluor 647 - IgG F (ab')2 (H+L) antibody	Life technologies, USA	A21237	Goat anti-mouse
Anti-hnRNPA1 antibody IgG2b	Sigma-Aldrich, USA	R4528	Mouse antibody
anti-TcFAZ (T. cruzi FAZ protein) antibody	Our lab	In-house	Mouse antibody
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich, USA	A2153-10G	Albumin protein
Detergent Igepal CA-630	Sigma-Aldrich, USA	I3021	Nonionic Detergent
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco, Thermo fisher scientific, USA	12657-029	Serum
Penicillin Streptomycin	Gibco, Thermo fisher scientific, USA	15140-122	Antibiotic
Phalloidin Alexa Fluor 594	Life technologies, USA	A12381	Actin marker
ProLong Gold antifade with DAPI	Life technologies, USA	P36935	Mounting media reagent
RPMI 1640 1X with L-glutamine	Corning, USA	10-040-CV	Cell culture media
Trypsin-EDTA solution	Sigma-Aldrich, USA	T4049-100ML	Bioreagent