同種の抗体を用いた二重標識免疫蛍光による宿主と病原体の相互作用の研究

要約

ここで、プロトコルは、宿主と病原体の相互作用を研究するために同じ種で生起される一次抗体を用いて二重標識免疫蛍光を行う方法を説明する。また、このプロトコルには、別の宿主からの第3の抗体を含むことができる。このアプローチは、任意の細胞型および病原体で行うことができる。

要約

今日では、寄生虫と宿主の細胞相互作用を研究するために利用可能な幅広い分子ツールを見つけることが可能です。しかし、寄生虫の中で特定の細胞構造およびタンパク質を認識する商業的なモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を得るためにいくつかの制限がある。また、トリパノソマチドの標識に利用できる市販の抗体はほとんどありません。通常、寄生虫に対するポリクローナル抗体は、社内で調製され、同じ種で産生される他の抗体と組み合わせて使用することはより困難である可能性があります。ここで、プロトコルは、同じ種で育てられたポリクローナルおよびモノクローナル抗体を使用して、宿主細胞および病原体相互作用を研究するために二重標識免疫蛍光を行う方法を示す。二重標識免疫蛍光を達成するためには、まずマウスポリクローナル抗体をインキュベートし、次に二次マウスIgG抗体を任意の蛍光色に結合してインキュベーションに従うことは重要です。その後、次の二次抗体によって一次抗体の痕跡が認識されるのを防ぐために、追加のブロッキングステップが必要です。次に、マウスモノクローナル抗体とその特異的IgGサブクラス二次抗体を別のフルオロクロームに結合させ、適宜にサンプルに添加する。さらに、異なる種で上げられた第3の抗体を用いて三重標識免疫蛍光を行うことが可能である。また、核やアクチンなどの構造は、その後、それらの特定の化合物またはラベルで染色することができます。したがって、ここで提示されるこれらのアプローチは、一次抗体の供給源が限られている任意の細胞に対して調整することができる。

概要

病原体と宿主細胞との相互作用を細胞レベルで研究するために、ウイルス、細菌、原虫などの異なるグループがほとんどの宿主細胞タイプ^1,2,3,4に感染する可能性があるため、疾患の根本的な原因に関する必須情報を提供する。また、病原体の成長を遅らせるか阻害する可能性のある治療標的を開発し、同定するのにも役立ちます。生きた条件では、産生された抗体は自己成分、ウイルスからの抗原、細菌成分または製品、真菌、寄生虫、および他の人を認識する責任がある⁵。

このため、抗体は、主に細胞構造およびタンパク質の位置および機能を理解するために広く使用されているツールである。複数の抗体標識を用いたいくつかの研究は、追加のブロッキングステップが免疫局在の特異性に寄与することを示している。さらに、ほとんどの記載されたプロトコルは、同じ宿主種からの抗体を含む特定の商業的モノクローナル抗体を使用する^{6,7,8,9,10,11,12,13,14}。

通常、二重標識免疫蛍光は、異なる種で生起された2つの抗体を使用して、目的の細胞構造または病原体および宿主細胞間の相互作用を見るために染色する。しかし、これは、一部の病原体に特異的な市販のモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体が二重標識を行う利用できない場合に問題となる可能性がある。また、市販の抗体コンジュゲーションキットがあり、かつ、一次抗体をスクシニミジルエステル反応¹⁵によって直接フルオロフォアに結合させることができる。問題は、これらのキットはしばしば高価であり、ラベルを付けるのに十分な抗体が必要であるということです。これを知りながら、トリパノソーマbrucei16でタンパク質の局在を研究するために、同じ種で育てられた2つの異なる抗体を用いた二重免疫蛍光法の開発に成功しました。しかし、トリパノソーマクルシを含む細胞内寄生虫については、このアプローチは実証されていない。ここでは、クロス反応を伴わずに同種で生起した一次抗体を用いて細胞内T.クルジ寄生虫および宿主細胞を研究するために二重標識免疫蛍光を行う方法を示す。この方法に加えて、異なる種からの第3抗体を添加して三重免疫蛍光標識が確立されている。これらのアプローチは、抗体の供給源が限られており、任意の細胞タイプで使用できる場合に役立ちます。

プロトコル

1. 細胞培養と寄生虫培養

1. 10% のヒートインを添加したRPMI培地中の^25cm2細胞培養フラスコで、アメリカ型培養コレクション(CCL-7)からLLC-MK2(アカゲザル腎臓上皮)細胞を増殖させる 活性FBS(ウシ胎児血清)および抗生物質(100 U/mLペニシリンおよび100 μg/mLストレプトマイシン)を5%_CO2 ¹⁷で37°Cで活性化した。
2. LLC-MK2細胞を以前のプロトコル¹⁸に従ってトリパノソーマ・クルジ(Y株)で感染させる。
3. LLC-MK2感染細胞(5mL)の上清を15mLの細胞培養円錐遠心分離管と遠心分離機で500xgで10分間、22°Cで細胞デブリを下げる。37°Cでチューブを10分間保ち、トリポマスティゴテが上清まで泳がせます。
4. 22°Cで15分間、2500 x gで新しい円錐形管と遠心分離機に上清を集めます。 上清を捨て、完全なRPMI培地中に寄生虫を含むペレットを再懸濁し、ノイバウアーチャンバー内の細胞を計数して細胞密度を決定します。

2. 免疫蛍光プロトコルの制御

メモ:一度固定すると、カバーリップを含むプレートを1x PBS(pH 7.2)で4°Cで1週間保存することができます。保存するには、細胞が透過性のステップを経ていないことが重要です。

1. LLC-MK2細胞(2 x ¹⁰⁴)を、RPMI培地中のUV殺菌された丸めたカバーリップを含む24のウェルプレートに16時間沈着させる。
2. 感染した細胞の場合、 T.クルジ (項目1.4)を含む上清を各ウェルに比例して加え(MOI 10:1)、感染の6時間放置します。PBS溶液で感染細胞および非感染細胞を5回含むカバースリップを洗浄し、室温(RT)で10分間1x PBS(pH 7.2)で2%パラホルムアルデヒドで固定した。
3. カバーリップを1x PBS(pH 7.2)でそれぞれ5分間3回洗います。
4. 1x PBS (PH 7.2) で 0.2% IGEPAL CA-630 で、RT で 10 分間、カバーリップを透過させます。
5. カバーリップを1倍のPBSでそれぞれ5分間3回洗います。
6. ブロッキング溶液(1x PBSでは2%BSA、pH 7.2)を用いてRTで30分間カバーリップをインキュベートする。
7. インキュベートは、マウスモノクローナル抗hnRNPA1(希釈1:200)またはマウスポリクローナル抗TcFAZ(希釈1:100)抗体をブロッキング溶液で希釈した抗体を用いて、RTで30分間カバーリップを行う。
8. カバーリップを1倍のPBSでそれぞれ5分間3回洗います。
9. アレクサフルオール488(1:600)にコンジュゲートされたヤギ抗マウスIgG F(H+L)と共に、アレクサ594(1:300)に結合してアクチンフィラメント(F-actin)を染色して、ラットを希釈して30分間RTでカバーリップをインキュベートします。
10. 1x PBS(pH 7.2)をそれぞれ5分間3回洗浄します。
11. スライドの表面にDAPI培地を用いたProLongゴールドアンチフェード付き試薬を少量塗布します。
12. 鉗子を使用して、気泡が形成されるのを防ぐために取り付け媒体のカバースリップを静かに傾ける。乾いたら、必要に応じてカバースリップを密封します。

3. 同じ宿主で上げられたモノクローナルおよびポリクローナル抗体を用いた二重標識免疫蛍光プロトコル

1. 上記の手順 2.1 ~ 2.6 を繰り返します。
2. インキュベートは、インハウスマウスポリクローナル抗TcFAZ抗体(1:100)を用いた感染細胞および非感染細胞を含むカバースリップを、RTで30分間ブロッキング溶液に希釈した。
3. カバーリップを1倍のPBSでそれぞれ5分間3回洗います。
4. インキュベートは、ラットで30分間カバーリップをラットで覆い、ヤギの抗マウスIgG F(ab')2(H+L)をアレクサフルオール647(1:600)に結合し、ブロッキング溶液で希釈した。
5. カバーリップを1倍のPBSでそれぞれ5分間3回洗います。
6. 2回目のブロッキングステップを、AffiniPureウサギの抗マウスIgG(H+L)希釈(0.12 mg/mL)で、RTで30分間ブロッキング溶液で行います。
7. カバーリップを1x PBS(pH 7.2)で3回洗浄し、それぞれ5分間洗います。次にマウスモノクローナル抗hnRNP A1 IgG2b抗体(1:200)をRTで30分間インキュベートします。
8. カバーリップを1倍のPBSでそれぞれ5分間3回洗います。
9. アレクサFluor 488(1:600)に結合したヤギの抗マウスIgG2b抗体と、ブロッキング溶液で希釈されたアレクサ594(1:300)に結合したファロジンで30分間カバースリップをインキュベートします。
10. カバーリップを1倍のPBSでそれぞれ5分間3回洗います。
11. 上記の手順 2.8 ~ 2.10 を繰り返します。

4. 異なる宿主種からの第3ポリクローナル抗体を添加したトリプル標識免疫蛍光プロトコル

注:追加のラベリングについては、IgGサブクラス、抗体アイソタイプに注意し、抗体の順序に従ってください:1.マウスポリクローナル、2.ウサギポリクローナル、3. 第2ブロック、および4.コンフォーカル顕微鏡で利用可能なレーザーの種類を検討して、正しいフルオロフォア共役二次抗体を選択します。

1. 上記の手順 2.1 ~ 2.6 を繰り返します。
2. ステップ3.2〜3.5(洗浄工程)の後、RTで30分間ブロッキング溶液中のウサギポリクローナル抗体で新しいインキュベーションを開始します。
3. カバーリップを1x PBS(pH 7.2)でそれぞれ5分間3回洗います。
4. ラットの抗ウサギ抗体 IgG をアレクサ 647 (1:600) に結合して 30 分間ブロック溶液にインキュベートします。
5. カバーリップを1倍のPBSでそれぞれ5分間3回洗います。
6. AFFINIPureウサギ抗マウスIgG(H+L)希釈(0.12 mg/mL)でRTで30分間ブロッキング溶液でブロッキングステップを実行します。
7. カバーリップを1x PBS(pH 7.2)でそれぞれ5分間3回洗浄し、ブロック溶液中で希釈した任意のマウスモノクローナルIgGサブクラス抗体で30分間インキュベートします。
8. カバーリップを1倍のPBSでそれぞれ5分間3回洗います。
9. カバーリップを、アレクサ594(1:600)に結合したヤギの抗マウスIgGサブクラス抗体を30分間インキュベートします。
10. カバーリップを1倍のPBSでそれぞれ5分間3回洗います。

5. 共焦点イメージング取得

1. 63X油浸漬目的で、共焦点顕微鏡を用いて蛍光検査サンプルを分析し、光増倍管(PMT)とハイブリッド検出器(HyD)で蛍光を検出します。
   注:私たちは、共焦点顕微鏡のマルチユーザー研究所からのセットアップを使用しました - LMMC、リベイランプレト医学部、サンパウロ大学。
2. 分離されたチャネルを持つすべての共焦点画像を取得します。アドビフォトショップを使用して画像処理を実行します。

結果

ここでは、トリパノソマチド中の特異的構造およびタンパク質を認識する市販の抗体の利用不能により抗体の供給源が制限される場合の免疫蛍光による宿主寄生虫相互作用を研究する方法を示す。

トリパノソマチドの中で、T.クルシは脊椎動物と無脊椎動物の宿主19の間の様々な発達段階を含む最も複雑なライフサイクル^の1つを有する。T.クル...

ディスカッション

ここでは、同じ宿主種の2つの異なる抗体を用いて 、トリパノソーマ・クルジ 感染細胞において二重免疫標識を行うプロトコルを提示する。研究するために、より詳細に、感染の影響を、核または細胞質小器官などの宿主細胞内の構造は、このプロトコルを用いて標識することができる。また、後埋め薄いセクション免疫金標識法にも使用できる。このアプローチは、トリパノソマチ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 488 - IgG2b antibody	Life technologies, USA	A21141	Goat anti-mouse
AffiniPure Rabbit anti-mouse IgG (H+L)	Jackson Immunoresearch, USA	315-005-003	Anti-mouse antibody
Alexa Fluor 488 - IgG F (ab')2 (H+L) antibody	Life technologies, USA	A11017	Goat anti mouse
Alexa Fluor 594 IgG1 antibody	Life technologies, USA	A21125	Goat anti-mouse
Alexa Fluor 647 - IgG F (ab')2 (H+L) antibody	Life technologies, USA	A21237	Goat anti-mouse
Anti-hnRNPA1 antibody IgG2b	Sigma-Aldrich, USA	R4528	Mouse antibody
anti-TcFAZ (T. cruzi FAZ protein) antibody	Our lab	In-house	Mouse antibody
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich, USA	A2153-10G	Albumin protein
Detergent Igepal CA-630	Sigma-Aldrich, USA	I3021	Nonionic Detergent
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco, Thermo fisher scientific, USA	12657-029	Serum
Penicillin Streptomycin	Gibco, Thermo fisher scientific, USA	15140-122	Antibiotic
Phalloidin Alexa Fluor 594	Life technologies, USA	A12381	Actin marker
ProLong Gold antifade with DAPI	Life technologies, USA	P36935	Mounting media reagent
RPMI 1640 1X with L-glutamine	Corning, USA	10-040-CV	Cell culture media
Trypsin-EDTA solution	Sigma-Aldrich, USA	T4049-100ML	Bioreagent