JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada protokol, konak-patojen etkileşimlerini incelemek için aynı türde yetiştirilen birincil antikorları kullanarak çift etiketleme immünofluoresansının nasıl gerçekleştirildiğini açıklar. Ayrıca, bu protokole farklı bir konaktan gelen üçüncü antikorları da içerebilir. Bu yaklaşım herhangi bir hücre tipinde ve patojende yapılabilir.

Özet

Günümüzde, parazit konak hücre etkileşimlerini incelemek için çok çeşitli moleküler araçlar bulmak mümkündür. Bununla birlikte, parazitlerdeki belirli hücre yapılarını ve proteinleri tanıyan ticari monoklonal veya poliklonal antikorlar elde etmek için bazı sınırlamalar vardır. Ayrıca, tripozosatomatidleri etiketlemek için çok az ticari antikor vardır. Genellikle, parazitlere karşı poliklonal antikorlar şirket içinde hazırlanır ve aynı türde üretilen diğer antikorlarla birlikte kullanılması daha zor olabilir. Burada protokol, konak hücre ve patojen etkileşimlerini incelemek için çift etiketleme immünofluoresansı gerçekleştirmek için aynı türde yetiştirilen poliklonal ve monoklonal antikorların nasıl kullanılacağını göstermektedir. Çift etiketleme immünoflorooresansı elde etmek için, önce fare poliklonal antikorunu kuluçkaya yatırmak ve daha sonra herhangi bir florroma konjuge edilen ikincil fare IgG antikoru ile inkübasyonu takip etmek çok önemlidir. Bundan sonra, birincil antikorun herhangi bir izinin bir sonraki ikincil antikor tarafından tanınmasını önlemek için ek bir engelleme adımı gereklidir. Daha sonra, bir fare monoklonal antikoru ve farklı bir florokroma konjuge edilen spesifik IgG alt sınıfı ikincil antikor uygun zamanlarda numuneye eklenir. Ek olarak, farklı bir türde yetiştirilen üçüncü bir antikor kullanarak üçlü etiketleme immünofluoresans yapmak mümkündür. Ayrıca, çekirdek ve aksin gibi yapılar daha sonra özel bileşikleri veya etiketleri ile lekelenebilir. Böylece, burada sunulan bu yaklaşımlar, birincil antikor kaynakları sınırlı olan herhangi bir hücre için ayarlanabilir.

Giriş

Patojenin hücresel düzeyde konak hücre ile etkileşimini incelemek için, virüsler, bakteriler ve protozoa gibi farklı gruplar çoğu konak hücre tipini enfekte edebileceğinden, hastalığın altında kalan nedenler hakkında temel bilgiler sağlar1,2,3,4. Ayrıca patojenin büyümesini yavaşlatabilecek veya inhibe edebilecek potansiyel terapötik hedeflerin geliştirilmesine ve tanımlanmasına yardımcı olabilir. Canlı koşullarda, üretilen antikorlar öz bileşenleri, virüslerden antijenleri, bakteriyel bileşenleri veya ürünleri, mantarları, parazitleri ve diğerlerini tanımaktan sorumludur5.

Bu amaçla, antikorlar, esas olarak hücresel yapıların ve proteinlerin yerini ve işlevini anlamak için yaygın olarak kullanılan araçlardır. Çoklu antikor etiketlemesi kullanılarak yapılan çeşitli çalışmalar, ek engelleme adımlarının immünolokalizasyonun özgüllüğüne katkıda bulunduğunu göstermektedir. Buna ek olarak, açıklanan protokollerin çoğu, aynı konak türlerinden antikorlar da dahil olmak üzere belirli ticari monoklonal antikorlar kullanır6,7,8,9,10,11,12,13,14.

Genellikle, çift etiketleme immünofluoresans, ilgi çekici hücre yapılarını veya patojenleri ve konak hücreleri aralarındaki etkileşimi görmek için lekelamak için farklı türlerde yetiştirilen iki antikor kullanır. Bununla birlikte, bazı patojenler için özel ticari monoklonal veya poliklonal antikorlar çift etiketleme yapmak için mevcut olmadığında bu bir sorun olabilir. Ayrıca, piyasada bulunan antikor konjugasyon kitleri vardır ve birincil antikorları doğrudan florimidil ester reaksiyonu ile florofora konjuge etmek mümkündür15. Sorun, bu kitlerin genellikle pahalı olması ve onları etiketlemek için yeterli antikora sahip olmak gerekir. Bunu bilerek, Trypanosoma brucei16'da protein lokalizasyonunu incelemek için aynı türde yetiştirilen iki farklı antikoru kullanarak çift immünofluoresans yöntemini başarıyla geliştirdik. Bununla birlikte, Trypanosoma cruzi de dahil olmak üzere hücre içi parazitler için bu yaklaşım gösterilmemiştir. Burada, hücre içi T. cruzi parazitlerini ve konak hücreyi çapraz reaksiyonlar olmadan aynı türde yetiştirilen birincil antikorları kullanarak incelemek için çift etiketleme immünofluoresansının nasıl gerçekleştirildiğini gösteriyoruz. Bu yöntemin yanı sıra, farklı bir türden üçüncü antikorun eklenmesiyle üçlü bir immünofluoresans etiketlemesi kurulmuştur. Bu yaklaşımlar antikor kaynağı sınırlı olduğunda ve herhangi bir hücre tipinde kullanılabildiğinde yardımcı olur.

Protokol

1. Hücre ve parazit kültürleri

  1. Amerikan Tip Kültür Koleksiyonu'ndan (CCL-7) LLC-MK2 (Rhesus Monkey Kidney Epitel) hücrelerini% 10 ısı inac ile desteklenmiş RPMI ortamında bulunan 25 cm2 hücre kültürü şişesinde büyütün %5 CO2 17'de 37 °C'de FBS (Fetal Sığır Serumu) ve antibiyotikler (100 U/mL Penisilin ve 100 μg/mL Streptomisin).
  2. LlC-MK2 hücrelerini önceki bir protokole göre Trypanosoma cruzi (Y suşu) ile enfekte edin 18.
  3. LLC-MK2 enfekte hücrelerin (5 mL) üst kısmını 15 mL hücre kültürü konik santrifüj tüpünde ve santrifüjde 500 x g'da 10 dakika ve 22 °C'de alt hücre kalıntılarına toplayın. Trypomastigotes'in süpernatanta yüzmesine izin vermek için tüpü 37 °C'de 10 dakika tutun.
  4. Süpernatantı yeni bir konik tüpte toplayın ve 22 °C'de 15 dakika boyunca 2500 x g'da santrifüjleyin. Bir Neubauer odasındaki hücreleri sayarak hücre yoğunluğunu belirlemek için süpernatantı atın ve parazitleri içeren peleti tam RPMI ortamında yeniden biriktirin.

2. İmmünofluoresans protokolünü kontrol edin

NOT: Düzeltildikten sonra, kapak kılıfı içeren plakaları 4 °C'de 1x PBS (pH 7.2) içinde bir hafta boyunca saklamak mümkündür. Depolanması için, hücrelerin permeabilizasyon adımından geçmemiş olması önemlidir.

  1. LLC-MK2 hücrelerini (2 x 104) RPMI ortamlarında UV sterilize edilmiş yuvarlak kapaklar içeren 24 kuyu plakasına 16 saat boyunca yerleşin.
  2. Enfekte hücreler için, her kuyuya orantılı olarak (MOI 10:1) T. cruzi (madde 1.4) içeren bir süpernatant ekleyin ve 6 saat enfeksiyon bırakın. Enfekte ve enfekte olmayan hücreleri içeren kapakları PBS çözeltisi ile beş kez yıkayın ve oda sıcaklığında (RT) 10 dakika boyunca 1x PBS'de (pH 7.2) %2 paraformaldehit ile sabitlendirin.
  3. Kapakları her biri 1x PBS (pH 7.2) ile 5 dakika boyunca üç kez yıkayın.
  4. RT'de 10 dakika boyunca 1x PBS'de (PH 7.2) %0,2 IGEPAL CA-630 ile kapakları permeabilize edin.
  5. Kapakları her biri 1x PBS ile 5 dakika boyunca üç kez yıkayın.
  6. Engelleme çözümü ile RT'de 30 dakika boyunca kapak kapaklarını kuluçkaya yaslanın (1x PBS'de%2 BSA, pH 7.2).
  7. Rt'de 30 dakika boyunca kapakları fare monoklonal anti-hnRNPA1 (seyreltme 1:200) veya blokaj çözeltisinde seyreltilmiş fare poliklonal anti-TcFAZ (seyreltme 1:100) antikorları ile kuluçkaya bırakın.
  8. Kapakları her biri 1x PBS ile 5 dakika boyunca üç kez yıkayın.
  9. Bloklama çözeltisinde seyreltilmiş konak hücredeki aktüen filamentleri (F-actin) lekelendirmek için Alexa 594'e (1:300) konjuge edilen phalloidin ile birlikte Alexa Fluor 488'e (1:600) konjuge edilen keçi anti-fare IgG F (ab')2 (H +L) ile RT'de kapakları 30 dakika kuluçkaya bırakın.
  10. Her biri 5 dakika boyunca 1x PBS (pH 7.2) ile üç kez yıkayın.
  11. Slaytın yüzeyine DAPI ortamlı az miktarda ProLong Gold antifad montaj reaktifi uygulayın.
  12. Forseps kullanarak, kabarcıkların oluşmasını önlemek için kapak kapağını montaj ortamına hafifçe eğin. Kurutulmuş, istenirse kapak kapağını kapatın.

3. Aynı konakta yetiştirilen monoklonal ve poliklonal antikorlar kullanılarak çift etiketleme immünofluoresans protokolü

  1. Yukarıda açıklanan 2.1 ile 2.6 arasında olan adımları yineleyin.
  2. Rt'de 30 dakika boyunca blokaj çözeltisinde seyreltilmiş şirket içi fare poliklonal anti-TcFAZ antikor (1:100) ile enfekte ve enfekte olmayan hücreler içeren kapakları inkübatif.
  3. Kapakları her biri 1x PBS ile 5 dakika boyunca üç kez yıkayın.
  4. Engelleme çözeltisinde seyreltilmiş Alexa Fluor 647'ye (1:600) eşleştirilmiş keçi anti-fare IgG F (ab')2 (H +L) ile RT'de 30 dakika boyunca kapakları kuluçkaya bırakın.
  5. Kapakları her biri 1x PBS ile 5 dakika boyunca üç kez yıkayın.
  6. RT'de 30 dakika boyunca engelleme çözeltisinde seyreltilmiş (0,12 mg/mL) AffiniPure tavşan fare önleyici IgG (H+L) ile ikinci engelleme adımını gerçekleştirin.
  7. Kapakları her biri 5 dakika boyunca 1x PBS (pH 7.2) ile üç kez yıkayın. Ardından RT'de 30 dakika boyunca fare monoklonal anti-hnRNP A1 IgG2b antikoru (1:200) ile kuluçkaya yatırın.
  8. Kapakları her biri 1x PBS ile 5 dakika boyunca üç kez yıkayın.
  9. Kapakları Alexa Fluor 488'e (1:600) konjuge edilen keçi anti-fare IgG2b antikoru ve engelleme çözeltisinde seyreltilmiş Alexa 594'e (1:300) konjuge edilmiş phalloidin ile 30 dakika kuluçkaya bırakın.
  10. Kapakları her biri 1x PBS ile 5 dakika boyunca üç kez yıkayın.
  11. Yukarıda açıklanan 2,8 ile 2,10 arasında olan adımları yineleyin.

4. Farklı konak türlerinden üçüncü poliklonal antikorun eklenmesiyle üçlü etiketleme immünofluoresans protokolü

NOT: Ek etiketleme için IgG alt sınıflarına, antikor izotiplerine dikkat edin ve antikor sırasını izleyin: 1. fare poliklonal, 2. tavşan poliklonal, 3. ikinci blok ve 4. fare monoklonal. Doğru florofor konjuge ikincil antikoru seçmek için konfokal mikroskopta bulunan lazerlerin türünü göz önünde bulundurun.

  1. Yukarıda açıklanan 2.1 ile 2.6 arasında olan adımları yineleyin.
  2. 3.2 ila 3.5 (yıkama adımı) adımlarını attıktan sonra, RT'de 30 dakika boyunca blokaj çözeltisinde tavşan poliklonal antikor ile yeni bir inkübasyon başlatın.
  3. Kapakları 1x PBS (pH 7.2) ile üç kez 5'er dakika yıkayın.
  4. Kapakları, 30 dakika boyunca engelleme çözeltisinde Alexa 647'ye (1:600) konjuge edilen keçi anti-tavşan antikoru IgG ile kuluçkaya bırakın.
  5. Kapakları her biri 1x PBS ile 5 dakika boyunca üç kez yıkayın.
  6. RT'de 30 dakika boyunca engelleme çözeltisinde AffiniPure tavşan fare önleyici IgG (H +L) seyreltilmiş (0,12 mg/mL) ile bir engelleme adımı gerçekleştirin.
  7. Kapakları her biri 5 dakika boyunca 1x PBS (pH 7.2) ile üç kez yıkayın ve blokaj çözeltisinde seyreltilmiş herhangi bir fare monoklonal IgG alt sınıfı antikoru ile 30 dakika boyunca kuluçkaya yatırın.
  8. Kapakları her biri 1x PBS ile 5 dakika boyunca üç kez yıkayın.
  9. Kapakları 30 dakika boyunca alexa 594'e (1:600) konjuge edilen belirli bir keçi anti-fare IgG alt sınıfı antikoru ile 30 dakika boyunca kuluçkaya bırakın.
  10. Kapakları her biri 1x PBS ile 5 dakika boyunca üç kez yıkayın.

5. Konfokal görüntüleme alımı

  1. 63X yağ daldırma hedefiyle konfokal mikroskop kullanarak immünofluoresans örneklerini analiz edin ve floresanları fotomultiplier tüp (PMT) ve Hibrid dedektör (HyD) ile tespit edin.
    NOT: Kurulumu Sao Paulo Üniversitesi, LMMC, Ribeirao Preto Tıp Fakültesi Konfokal Mikroskopi Çok Kullanıcılı Laboratuvarı'ndan kullandık.
  2. Ayrılmış kanallarla tüm konfokal görüntüleri alın. Adobe Photoshop kullanarak görüntü işleme gerçekleştirin.

Sonuçlar

Burada, tripozomatidlerdeki belirli yapıları ve proteinleri tanıyan ticari antikorların kullanılabilirliği nedeniyle antikorların kaynağı sınırlı olduğunda immünofluoresans ile konak parazit etkileşimlerinin nasıl incelenerek çalışılacağını gösteriyoruz.

Tripozomatidler arasında, T. cruzi omurgalı ve omurgasız konaklar arasındaki çeşitli gelişim aşamalarını içeren en karmaşık yaşam döngülerinden birine sahiptir 19. T....

Tartışmalar

Burada, aynı konak türlerinden iki farklı antikor kullanarak Trypanosoma cruzi enfekte hücrelerinde çift immünolabeling yapmak için bir protokol sunuyoruz. Daha ayrıntılı olarak, enfeksiyonun etkilerini incelemek için, çekirdek veya sitosoleik organeller gibi konak hücredeki yapılar bu protokol kullanılarak etiketlenebilir. Ayrıca, gömme sonrası ince kesit immüngold etiketleme yönteminde de kullanılabilir. Bu yaklaşım, tripozomatidleri ve diğer parazitleri incelemek için birkaç antikoru...

Açıklamalar

Yazarlar rekabet veya finansal çıkar beyan etmemektedir.

Teşekkürler

Bu çalışma Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP 2010/19547-1; 2018/03677-5) mmab için, Fundação de Apoio ao Ensino, Pesquisa e Assistência- FAEPA MMAB ve Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior- Brasil (CAPES) - finans kodu 001. CG-C CAPES'ten yüksek lisans ve doktora bursu, LAMT-S ise CNPq'den doktora bursu aldı. Konfokal mikroskopi yardımı için Elizabete R. Milani'ye ve LLC-MK2 hücreleri sağladığı için Dr. Dario Zamboni'ye teşekkür ederiz (Ribeirao Preto Tıp Fakültesi, USP).

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Alexa Fluor 488 - IgG2b antibodyLife technologies, USAA21141Goat anti-mouse
AffiniPure Rabbit anti-mouse IgG (H+L)Jackson Immunoresearch, USA315-005-003Anti-mouse antibody
Alexa Fluor 488 - IgG F (ab')2 (H+L) antibodyLife technologies, USAA11017Goat anti mouse
Alexa Fluor 594 IgG1 antibodyLife technologies, USAA21125Goat anti-mouse
Alexa Fluor 647 - IgG F (ab')2 (H+L) antibodyLife technologies, USAA21237Goat anti-mouse
Anti-hnRNPA1 antibody IgG2bSigma-Aldrich, USAR4528Mouse antibody
anti-TcFAZ (T. cruzi FAZ protein) antibodyOur labIn-houseMouse antibody
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma-Aldrich, USAA2153-10GAlbumin protein
Detergent Igepal CA-630Sigma-Aldrich, USAI3021Nonionic Detergent
Fetal Bovine Serum (FBS)Gibco, Thermo fisher scientific, USA12657-029Serum
Penicillin StreptomycinGibco, Thermo fisher scientific, USA15140-122Antibiotic
Phalloidin Alexa Fluor 594Life technologies, USAA12381Actin marker
ProLong Gold antifade with DAPILife technologies, USAP36935Mounting media reagent
RPMI 1640 1X with L-glutamineCorning, USA10-040-CVCell culture media
Trypsin-EDTA solutionSigma-Aldrich, USAT4049-100MLBioreagent

Referanslar

  1. Lloyd, R. E. Nuclear proteins hijacked by mammalian cytoplasmic plus strand RNA viruses. Virology. 479-480, 457-474 (2015).
  2. Casadevall, A., Pirofski, L. A. Host-pathogen interactions: basic concepts of microbial commensalism, colonization, infection, and disease. Infection and Immunity. 68 (12), 6511-6518 (2000).
  3. Sidik, S. M., Salsman, J., Dellaire, G., Rohde, J. R. Shigella infection interferes with SUMOylation and increases PML-NB number. PLoS One. 10 (4), 0122585 (2015).
  4. Robert McMaster, W., Morrison, C. J., Kobor, M. S. Epigenetics: A New Model for Intracellular Parasite-Host Cell Regulation. Trends in Parasitology. 32 (7), 515-521 (2016).
  5. Casali, P., Schettino, E. W. Structure and function of natural antibodies. Current Topics in Microbiology and Immunology. 210, 167-179 (1996).
  6. Ansorg, A., Bornkessel, K., Witte, O. W., Urbach, A. Immunohisto-chemistry and multiple labeling with antibodies from the same host species to study adult hippocampal neurogenesis. Journal of Visualized Experiments. (98), e52551 (2015).
  7. Tóth, Z. E., Mezey, E. Simultaneous visualization of multi-ple antigens with tyramide signal amplification using antibodies from the same species. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 55 (6), 545 (2007).
  8. Ma, B., Winkelbach, S., Lindenmaier, W., Dittmar, K. E. Six-colour fluorescent imaging of lymphoid tissue based on colour addition theory. Acta Histochemica. 108 (4), 243 (2006).
  9. Buchwalow, I. B., Minin, E. A., Boecker, W. A multicolor fluorescence immunostaining technique for simultaneous antigen targeting. Acta Histochemica. 107 (2), 143 (2005).
  10. Nakamura, A., Uchihara, T. Dual enhancement of triple immunofluorescence using two antibodies from the same species. Journal of Neuroscience Methods. 135 (1-2), 67 (2004).
  11. McCormick, J., Lim, I., Nichols, R. Neuropeptide precursor pro-cessing detected by triple immunolabeling. Cell and Tissue Research. 297 (2), 197 (1999).
  12. Shindler, K. S., Roth, K. A. Double immunofluorescent staining using two unconjugated primary antisera raised in the same species. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 44 (11), 1331 (1996).
  13. Wang, B. L., Larsson, L. I. Simultaneous demonstration of multiple anti-gens by indirect immunofluorescence or immunogold staining. Novel light and electron microscopical double and triple staining method employing primary antibodies from the same species. Histochemistry. 83 (1), 47 (1985).
  14. Lewis Carl, S. A., Gillete-Ferguson, I., Ferguson, D. G. An indirect immunofluorescence procedure for staining the same cryosection with two mouse monoclonal primary antibodies. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 41 (8), 1273-1278 (1993).
  15. Pranchevicius, M. C., et al. Myosin Va phosphorylated on Ser1650 is found in nuclear speckles and redistributes to nucleoli upon inhibition of transcription. Cell Motility and the Cytoskeleton. 65 (6), 441-456 (2008).
  16. Moreira, B. P., de Castro, C. G., Prado, L. C. d. S., da Fonseca, C. K., Baqui, M. M. A., Méndez-Vilas, A. Use of antibodies from the same host species in double labeling immunofluorescence on trypanosome cytoskeleton. Microscopy and Imaging Science: Practical Approaches to Applied Research and Education. 7, 374-378 (2016).
  17. Hull, R. N., Cherry, W. R., Tritch, O. J. Growth characteristics of monkey kidney cell strains LLC-MK1, LLC-MK2, and LLC-MK2 (NCTC-3196) and their utility in virus research. Journal of Experimental Medicine. 115, 903-918 (1962).
  18. Stecconi-Silva, R. B., Andreoli, W. K., Mortara, R. A. Parameters affecting cellular invasion and escape from the parasitophorous vacuole by different infective forms of Trypanosoma cruzi. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 98 (7), 953-958 (2003).
  19. de Souza, W., de Carvalho, T. M., Barrias, E. S. Review on Trypanosoma cruzi: Host Cell Interaction. International Journal of Cell Biology. 2010, 295394 (2010).
  20. Burleigh, B. A., Woolsey, A. M. Cell signalling and Trypanosoma cruzi invasion. Cellular Microbiology. 4 (11), 701-711 (2002).
  21. Baqui, M. M. A., Takata, C. S., Milder, R. V., Pudles, J. A giant protein associated with the anterior pole of a trypanosomatid cell body skeleton. European Journal of Cell Biology. 70, 243-249 (1996).
  22. Baqui, M. M., Milder, R., Mortara, R. A., Pudles, J. In vivo and in vitro phosphorylation and subcellular localization of trypanosomatid cytoskeletal giant proteins. Cell Motility and the Cytoskeleton. 47 (1), 25-37 (2000).
  23. Baqui, M. M., De Moraes, N., Milder, R. V., Pudles, J. A giant phosphoprotein localized at the spongiome region of Crithidia luciliae thermophila. Journal of Eukaryotic Microbiology. 47 (6), 532-537 (2000).
  24. Jean-Philippe, J., Paz, S., Caputi, M. hnRNP A1: the Swiss army knife of gene expression. International Journal of Molecular Sciences. 14 (9), 18999-19024 (2013).
  25. Vidarsson, G., Dekkers, G., Rispens, T. IgG subclasses and allotypes: from structure to effector functions. Frontiers in Immunology. 5, 520 (2014).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

mm noloji ve EnfeksiyonSay 173imm nolabelingift etiketlemeayn konak antikorlarkonak patojen etkile imi

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır