Immunofluorescence à double marquage à l’aide d’anticorps de la même espèce pour étudier les interactions hôte-pathogène

Résumé

Ici, le protocole décrit comment effectuer une immunofluorescence à double marquage en utilisant des anticorps primaires élevés chez la même espèce pour étudier les interactions hôte-pathogène. En outre, il peut inclure le troisième anticorps d’un hôte différent dans ce protocole. Cette approche peut être faite dans n’importe quel type de cellule et d’agents pathogènes.

Résumé

De nos jours, il est possible de trouver un large éventail d’outils moléculaires disponibles pour étudier les interactions parasite-cellule hôte. Cependant, certaines limites existent pour obtenir des anticorps monoclonaux ou polyclonaux commerciaux qui reconnaissent des structures cellulaires et des protéines spécifiques chez les parasites. En outre, il existe peu d’anticorps commerciaux disponibles pour marquer les trypanosomatidés. Habituellement, les anticorps polyclonaux contre les parasites sont préparés en interne et pourraient être plus difficiles à utiliser en combinaison avec d’autres anticorps produits chez la même espèce. Ici, le protocole montre comment utiliser des anticorps polyclonaux et monoclonaux élevés chez la même espèce pour effectuer une immunofluorescence à double marquage afin d’étudier les interactions entre les cellules hôtes et les agents pathogènes. Pour obtenir l’immunofluorescence à double marquage, il est crucial d’incuber d’abord l’anticorps polyclonal de la souris, puis de suivre l’incubation avec l’anticorps IgG secondaire de la souris conjugué à n’importe quel fluorochrome. Après cela, une étape de blocage supplémentaire est nécessaire pour empêcher toute trace de l’anticorps primaire d’être reconnue par l’anticorps secondaire suivant. Ensuite, un anticorps monoclonal de souris et son anticorps secondaire spécifique de sous-classe IgG conjugué à un fluorochrome différent sont ajoutés à l’échantillon aux moments appropriés. De plus, il est possible d’effectuer une immunofluorescence à triple marquage à l’aide d’un troisième anticorps élevé chez une espèce différente. En outre, des structures telles que les noyaux et l’actine peuvent être colorées ultérieurement avec leurs composés ou étiquettes spécifiques. Ainsi, ces approches présentées ici peuvent être ajustées pour toute cellule dont les sources d’anticorps primaires sont limitées.

Introduction

Étudier l’interaction de l’agent pathogène avec la cellule hôte au niveau cellulaire fournit des informations essentielles sur les causes sous-jacentes de la maladie, car différents groupes, tels que les virus, les bactéries et les protozoaires, peuvent infecter la plupart des types de cellules hôtes1,2,3,4. Il peut également aider à développer et à identifier des cibles thérapeutiques potentielles qui peuvent ralentir ou inhiber la croissance de l’agent pathogène. Dans des conditions de vie, les anticorps produits sont responsables de la reconnaissance des auto-composants, des antigènes des virus, des composants ou produits bactériens, des champignons, des parasites et ^autres5.

À cette fin, les anticorps sont des outils largement utilisés, principalement pour comprendre l’emplacement et la fonction des structures cellulaires et des protéines. Plusieurs études utilisant le marquage d’anticorps multiples démontrent que des étapes de blocage supplémentaires contribuent à la spécificité de l’immunolocalisation. En outre, la plupart des protocoles décrits utilisent des anticorps monoclonaux commerciaux spécifiques, y compris des anticorps de la même espèce hôte6,7,8,9,10,11,12,13,14.

Habituellement, l’immunofluorescence à double marquage utilise deux anticorps élevés chez des espèces différentes pour colorer les structures cellulaires d’intérêt ou les agents pathogènes et les cellules hôtes pour voir l’interaction entre eux. Cependant, cela peut être un problème lorsqu’aucun anticorps commercial monoclonal ou polyclonal spécifique à certains agents pathogènes n’est disponible pour effectuer le double marquage. En outre, il existe des kits de conjugaison d’anticorps disponibles dans le commerce, et il est possible de conjuguer les anticorps primaires directement au fluorophore par une réaction d’ester de succinimidyle15. Le problème est que ces kits sont souvent coûteux, et il est nécessaire d’avoir suffisamment d’anticorps pour les étiqueter. Sachant cela, nous avons développé avec succès une méthode de double immunofluorescence utilisant deux anticorps différents élevés dans la même espèce pour étudier la localisation des protéines dans Trypanosoma brucei16. Cependant, pour les parasites intracellulaires, y compris Trypanosoma cruzi, cette approche n’a pas été démontrée. Ici, nous montrons comment effectuer une immunofluorescence à double marquage pour étudier les parasites intracellulaires de T. cruzi et la cellule hôte en utilisant des anticorps primaires élevés chez la même espèce sans réactions croisées. Outre cette méthode, un triple marquage par immunofluorescence a été établi avec l’ajout du troisième anticorps d’une espèce différente. Ces approches aident lorsque la source d’anticorps est limitée et peuvent être utilisées dans n’importe quel type de cellule.

Protocole

1. Cultures de cellules et de parasites

1. Cultiver des cellules LLC-MK2 (Rhesus Monkey Kidney Epithelial) de l’American Type Culture Collection (CCL-7) dans une fiole de culture cellulaire de ^{25 cm2} contenant dans un milieu RPMI complété par 10% de FBS (Sérum Fœtal Bovin) inactivé par la chaleur et des antibiotiques (100 U/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine) à 37 °C dans 5% de _CO2 ¹⁷.
2. Infecter les cellules LLC-MK2 avec Trypanosoma cruzi (souche Y) selon un protocole précédent ¹⁸.
3. Recueillir le surnageant des cellules infectées par LLC-MK2 (5 mL) dans un tube de centrifugeuse conique de culture cellulaire de 15 mL et centrifuger à 500 x g pendant 10 minutes et 22 °C pour réduire les débris cellulaires. Conservez le tube pendant 10 minutes à 37 °C pour permettre aux trypomastigotes de nager jusqu’au surnageant.
4. Recueillir le surnageant dans un nouveau tube conique et centrifuger à 2500 x g pendant 15 minutes à 22 °C. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille contenant les parasites dans un milieu RPMI complet pour déterminer la densité cellulaire en comptant les cellules dans une chambre de Neubauer.

2. Protocole d’immunofluorescence de contrôle

REMARQUE: Une fois fixés, il est possible de stocker des plaques contenant des couvercles à 4 ° C dans 1x PBS (pH 7,2) pendant une semaine. Pour être stockées, il est important que les cellules ne soient pas passées par l’étape de la perméabilisation.

1. Déposez les cellules LLC-MK2 (2 x ¹⁰⁴) dans 24 plaques de puits contenant des couvercles arrondis stérilisés aux UV dans des milieux RPMI pendant 16 heures.
2. Pour les cellules infectées, ajouter un surnageant contenant T. cruzi (point 1.4) à chaque puits en proportion (MOI 10:1) et laisser reposer pendant 6 h d’infection. Laver les couvercles contenant des cellules infectées et non infectées cinq fois avec une solution de PBS et fixés avec 2% de paraformaldéhyde dans 1x PBS (pH 7,2) pendant 10 min à température ambiante (RT).
3. Lavez les couvercles trois fois pendant 5 minutes chacun avec 1x PBS (pH 7,2).
4. Perméabiliser les couvercles avec 0,2% IGEPAL CA-630 en 1x PBS (PH 7.2) pendant 10 min à RT.
5. Lavez les couvercles trois fois pendant 5 minutes chacun avec 1x PBS.
6. Incuber des couvercles pendant 30 min à RT avec la solution bloquante (2% de BSA dans 1x PBS, pH 7,2).
7. Incuber les couvercles pendant 30 min à TA soit avec des anticorps anti-hnRNPA1 monoclonaux de souris (dilution 1:200) ou avec des anticorps polyclonaux anti-TcFAZ (dilution 1:100) de souris dilués dans une solution bloquante.
8. Lavez les couvercles trois fois pendant 5 minutes chacun avec 1x PBS.
9. Incuber les couvercles pendant 30 min à RT avec de l’IgG F (ab')2 (H+L) anti-souris de chèvre conjuguée à Alexa Fluor 488 (1:600) avec de la phalloïdine conjuguée à Alexa 594 (1:300) pour colorer les filaments d’actine (F-actine) dans la cellule hôte diluée dans la solution bloquante.
10. Laver trois fois avec 1x PBS (pH 7,2) pendant 5 min chacun.
11. Appliquez une petite quantité de réactif de montage antifade ProLong Gold avec un milieu DAPI sur la surface de la glissière.
12. À l’aide d’une pince, inclinez doucement le couvercle dans le support de montage pour empêcher la formation de bulles. Une fois sec, scellez le couvercle si vous le souhaitez.

3. Protocole d’immunofluorescence à double marquage utilisant des anticorps monoclonaux et polyclonaux élevés dans le même hôte

1. Répétez les étapes 2.1 à 2.6 décrites ci-dessus.
2. Incuber des couvercles contenant des cellules infectées et non infectées avec un anticorps polyclonal anti-TcFAZ de souris interne (1:100) dilué dans une solution bloquante pendant 30 min à TA.
3. Lavez les couvercles trois fois pendant 5 minutes chacun avec 1x PBS.
4. Incuber des couvercles pendant 30 min à TA avec des IgG F (ab')2 (H+L) anti-souris de chèvre conjuguées à Alexa Fluor 647 (1:600) diluées dans la solution bloquante.
5. Lavez les couvercles trois fois pendant 5 minutes chacun avec 1x PBS.
6. Effectuez la deuxième étape de blocage avec AffiniPure lapin anti-souris IgG (H + L) dilué (0,12 mg / mL) dans une solution bloquante pendant 30 min à TA.
7. Lavez les couvercles trois fois avec 1x PBS (pH 7,2) pendant 5 min chacun. Puis incuber avec un anticorps monoclonal anti-hnRNP A1 IgG2b de souris (1:200) pendant 30 min à TA.
8. Lavez les couvercles trois fois pendant 5 minutes chacun avec 1x PBS.
9. Incuber les couvercles pendant 30 min avec un anticorps IgG2b anti-souris de chèvre conjugué à Alexa Fluor 488 (1:600) et avec de la phalloïdine conjuguée à Alexa 594 (1:300) diluée dans la solution bloquante.
10. Lavez les couvercles trois fois pendant 5 minutes chacun avec 1x PBS.
11. Répétez les étapes 2.8 à 2.10 décrites ci-dessus.

4. Protocole d’immunofluorescence à triple marquage avec l’ajout du troisième anticorps polyclonal de différentes espèces hôtes

REMARQUE: Pour l’étiquetage supplémentaire, notez les sous-classes IgG, les isotypes d’anticorps et suivez l’ordre des anticorps: 1. polyclonal de souris, 2. polyclonal de lapin, 3. deuxième bloc et 4. monoclonal de souris. Considérez le type de lasers disponibles dans le microscope confocal pour choisir le bon anticorps secondaire conjugué au fluorophore.

1. Répétez les étapes 2.1 à 2.6 décrites ci-dessus.
2. Après les étapes 3.2 à 3.5 (étape de lavage), commencez une nouvelle incubation avec un anticorps polyclonal de lapin en solution bloquante pendant 30 minutes à TA.
3. Lavez les couvercles trois fois avec 1x PBS (pH 7,2) pendant 5 minutes chacun.
4. Incuber les couvercles avec des IgG d’anticorps anti-lapin de chèvre conjugués à Alexa 647 (1:600) dans une solution bloquante pendant 30 minutes.
5. Lavez les couvercles trois fois pendant 5 minutes chacun avec 1x PBS.
6. Effectuez une étape de blocage avec AffiniPure lapin anti-souris IgG (H + L) dilué (0,12 mg / mL) dans une solution de blocage pendant 30 min à RT.
7. Lavez les couvercles trois fois avec 1x PBS (pH 7,2) pendant 5 minutes chacun et incubez avec n’importe quel anticorps monoclonal de la sous-classe IgG de souris dilué dans une solution bloquante pendant 30 minutes.
8. Lavez les couvercles trois fois pendant 5 minutes chacun avec 1x PBS.
9. Incuber les couvercles pendant 30 minutes avec une paire spécifique d’anticorps de sous-classe IgG anti-souris de chèvre conjugués à Alexa 594 (1:600) en solution bloquante pendant 30 minutes.
10. Lavez les couvercles trois fois pendant 5 minutes chacun avec 1x PBS.

5. Acquisition d’imagerie confocale

1. Analysez les échantillons d’immunofluorescence à l’aide d’un microscope confocal, avec un objectif d’immersion dans l’huile 63X et détectez la fluorescence avec un tube photomultiplicateur (PMT) et un détecteur hybride (HyD).
   REMARQUE: Nous avons utilisé la configuration du laboratoire multi-utilisateurs de microscopie confocale - LMMC, Ribeirao Preto Medical School, Université de Sao Paulo.
2. Acquérez toutes les images confocales avec des canaux séparés. Effectuez le traitement d’image à l’aide d’Adobe Photoshop.

Résultats

Ici, nous montrons comment étudier les interactions hôte-parasite par immunofluorescence lorsque la source d’anticorps est limitée en raison de l’indisponibilité d’anticorps commerciaux qui reconnaissent des structures et des protéines spécifiques chez les trypanosomatidés.

Parmi les trypanosomatidés, T. cruzi a l’un des cycles de vie les plus complexes impliquant divers stades de développement entre les hôtes vertébrés et invertébrés ¹⁹. ...

Discussion

Ici, nous présentons un protocole pour effectuer un double immunomarquage dans les cellules infectées par Trypanosoma cruzi en utilisant deux anticorps différents de la même espèce hôte. Pour étudier, avec plus de détails, les implications de l’infection, les structures de la cellule hôte telles que le noyau ou les organites cytosoliques peuvent être étiquetées à l’aide de ce protocole. En outre, il peut être utilisé dans la méthode d’étiquetage immunogold à section mince post-intégratio...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 488 - IgG2b antibody	Life technologies, USA	A21141	Goat anti-mouse
AffiniPure Rabbit anti-mouse IgG (H+L)	Jackson Immunoresearch, USA	315-005-003	Anti-mouse antibody
Alexa Fluor 488 - IgG F (ab')2 (H+L) antibody	Life technologies, USA	A11017	Goat anti mouse
Alexa Fluor 594 IgG1 antibody	Life technologies, USA	A21125	Goat anti-mouse
Alexa Fluor 647 - IgG F (ab')2 (H+L) antibody	Life technologies, USA	A21237	Goat anti-mouse
Anti-hnRNPA1 antibody IgG2b	Sigma-Aldrich, USA	R4528	Mouse antibody
anti-TcFAZ (T. cruzi FAZ protein) antibody	Our lab	In-house	Mouse antibody
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich, USA	A2153-10G	Albumin protein
Detergent Igepal CA-630	Sigma-Aldrich, USA	I3021	Nonionic Detergent
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco, Thermo fisher scientific, USA	12657-029	Serum
Penicillin Streptomycin	Gibco, Thermo fisher scientific, USA	15140-122	Antibiotic
Phalloidin Alexa Fluor 594	Life technologies, USA	A12381	Actin marker
ProLong Gold antifade with DAPI	Life technologies, USA	P36935	Mounting media reagent
RPMI 1640 1X with L-glutamine	Corning, USA	10-040-CV	Cell culture media
Trypsin-EDTA solution	Sigma-Aldrich, USA	T4049-100ML	Bioreagent