Actividad De Las Neuronas Aferentes De La Línea Lateral Posterior Durante La Natación En El Pez Cebra

Resumen

Describimos un protocolo para supervisar cambios en la actividad aferente de la neurona durante comandos del motor en un sistema de la célula de pelo vertebrado modelo.

Resumen

Los sistemas sensoriales reúnen señales esenciales para dirigir el comportamiento, pero los animales deben descifrar qué información es biológicamente relevante. La locomoción genera señales reaferentes que los animales deben desentrañar de las señales sensoriales relevantes del entorno circundante. Por ejemplo, cuando un pez nada, el flujo generado a partir de ondulaciones corporales es detectado por los neuromastos mecanorreceptivos, que comprenden las células ciliadas, que componen el sistema de línea lateral. Las células ciliadas luego transmiten información de movimiento fluido desde el sensor al cerebro a través de las neuronas aferentes sensoriales. Simultáneamente, la descarga corolario del comando motor se transmite a las células ciliadas para prevenir la sobrecarga sensorial. Por lo tanto, tener en cuenta el efecto inhibitorio de las señales motoras predictivas durante la locomoción es fundamental a la hora de evaluar la sensibilidad del sistema de línea lateral. Hemos desarrollado un enfoque electrofisiológico in vivo para monitorear simultáneamente la neurona aferente de la línea lateral posterior y la actividad de la raíz motora ventral en larvas de pez cebra (4-7 días después de la fertilización) que pueden durar varias horas. Las grabaciones extracelulares de neuronas aferentes se logran utilizando la técnica de abrazadera de parches sueltos, que puede detectar la actividad de neuronas únicas o múltiples. Las grabaciones de la raíz ventral se realizan a través de la piel con electrodos de vidrio para detectar la actividad de la neurona motora. Nuestro protocolo experimental proporciona el potencial para monitorear los cambios endógenos o evocados en la entrada sensorial a través de los comportamientos motores en un vertebrado intacto y que se comporta.

Introducción

Las neuronas aferentes de los sistemas mechanosensoriales transmiten información de las células ciliadas al cerebro durante la audición y el equilibrio. La electrofisiología puede revelar la sensibilidad de las neuronas aferentes a través de grabaciones directas. Mientras que el parcheo de células enteras de las células ciliadas puede ser un desafío, el registro de las neuronas aferentes aguas abajo es más fácil y permite la evaluación de los potenciales de acción en respuesta a los estímulos controlados^1,2,3. La estimulación de las células ciliadas conduce a su deflexión, lo que modifica las estructuras medenosensoriales, desencadenando así un aumento de los potenciales de acción (picos) en las neuronas aferentes^4,5,6. En ausencia de estímulos externos, las neuronas aferentes también se disparan espontáneamente debido a la fuga de glutamato de las células ciliadas a los terminales post-sinápticos aferentes^7,8,y se ha demostrado que contribuyen a mantener la sensibilidad^9,10. El registro de la abrazadera de parches de la actividad aferente permite la observación de la sensibilidad de las células ciliadas y la dinámica de la señal que no son posibles utilizando técnicas con menor resolución temporal, como en microfonías^{11, 12} o imágenes funcionales de calcio^13,14,15. El siguiente protocolo permitirá el registro de la actividad aferente concurrente con los comandos motores para revelar cambios instantáneos en la sensibilidad de las células ciliadas.

El pez cebra(Danio rerio)utiliza células ciliadas contenidas en neuromastos que componen el sistema de línea lateral para detectar el movimiento del agua en relación con su cuerpo, lo que se traduce en señales neuronales esenciales para la navegación^16,17,18,evitación de depredadores, captura de presas^19,20,y escolaridad^21. El flujo de agua también puede ser autogenerado por los movimientos de natación^22,23,24,respiración^22,25,26,y alimentación^27. Estos comportamientos comprenden movimientos repetitivos que pueden fatigar las células ciliadas y perjudicar la detección. Por lo tanto, es fundamental que el sistema de línea lateral diferencie entre estímulos de flujo externos (exaferentes) y autogenerados (reaferentes). Una descarga corolario atenúa las señales de flujo autogeneradas durante la locomoción en el pez cebra. Esta señal motora predictiva inhibitoria se retransmite a través de neuronas descendentes a los receptores sensoriales para modificar la entrada o interrumpir el procesamiento de la retroalimentación reaferente^28,29. El trabajo seminal que contribuyó a nuestra comprensión temprana de este sistema feedforward se basó en preparaciones in vitro donde no se mantuvo la conectividad y la actividad endógena del circuito neuronal^{28,30,31,32,33,34,35.} Este protocolo describe un acercamiento a preservar un circuito de los nervios intacto donde la dinámica endógena de la regeneración se mantiene así permitiendo una mejor comprensión de la descarga del corolario in vivo.

El protocolo descrito aquí describe cómo monitorear la actividad de la neurona aferente de la línea lateral posterior y la neurona motora simultáneamente en el pez cebra larval. La caracterización de la dinámica de señales aferentes antes, durante y después de los comandos motores proporciona información sobre la retroalimentación endógena en tiempo real del sistema nervioso central que modula la sensibilidad de las células ciliadas durante la locomoción. Este protocolo describe qué materiales deberán prepararse antes de los experimentos y luego describe cómo paralizar y preparar las larvas de pez cebra. El protocolo describirá cómo establecer un registro de parches sueltos estables de neuronas aferentes y grabaciones de raíz ventral extracelular (VR) de neuronas motoras. Los datos representativos que se pueden obtener utilizando este protocolo se presentan a partir de un individuo ejemplar y el análisis se realizó en múltiples réplicas del protocolo experimental. El preprocesamiento de datos se realiza utilizando scripts escritos personalizados en MATLAB. En general, este paradigma experimental in vivo está preparado para proporcionar una mejor comprensión de la retroalimentación sensorial durante la locomoción en un sistema modelo de células ciliadas de vertebrados.

Protocolo

Todo el cuidado y los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con los protocolos aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Florida.

1. Preparación de materiales para grabaciones electrofisiológicas

1. Haga un plato de grabación con fondo de elastómero de silicona.
   1. Dispense una capa delgada de componentes de elastómero de silicona automezclados (por ejemplo, Sylgard) en un plato de cultivo de tejido con fondo de vidrio de cubierta hasta que se nivele con el borde del pozo poco profundo. Aproximadamente 0,5 mL es suficiente.
   2. Cubrir y curar el plato durante un mínimo de 48 h a temperatura ambiente.
2. Haga pasadores de disección.
   1. Proporcione una carga negativa (5 V) a un beaker de grabador de 100 mL (3M KOH) utilizando una fuente de alimentación de CC y conecte un cable de tungsteno (0.002 pulgadas; 50.8 μm de diámetro) a la salida cargada positivamente.
      PRECAUCIÓN: Los cables negativos y positivos no deben ponerse en contacto entre sí durante este procedimiento, ya que puede correr el riesgo de producir chispas, lo que podría representar un peligro potencial de incendio.
   2. Grabe el alambre de tungsteno sumergiendo rápida y repetidamente la punta del cable en el baño de grabado hasta que la punta se estreche a un punto agudo. Debajo de un estereomicroscopio, corte el cable aproximadamente 1 mm de la punta con una cuchilla de afeitar de borde recto. Repita tres veces más y luego inserte los pines en el plato de grabación curado con pinzas finas.
3. Prepare los electrodos de la grabación.
   1. Tire de un tubo capilar de vidrio de borosilicato (diámetro interior: 0,86 mm, diámetro exterior: 1,50 mm) utilizando un tirador de micropipeta horizontal con filamento de caja en electrodos con una punta de 30 μm de diámetro con ligero cono(Figura 1 Ai)que se utilizará para registrar neuronas aferentes de la línea lateral posterior.
   2. Tire de un tubo capilar de vidrio de borosilicato adicional en un par de electrodos con diámetros de punta más pequeños (1-5 μm). Sosteniendo un electrodo en cada mano, ejecute suavemente las puntas unas a otras para romperlas en un ángulo de ~ 30 °. Usando un microforge, pula la punta biselada hasta que esté suave. El diámetro final de la punta debe estar entre 30-50 μm y se utilizará como electrodo de grabación de la raíz ventral (VR) (Figura 1 Aii).
   3. Marque el lado del electrodo VR con el borde de ataque con tinta permanente para ayudar a orientar la apertura de la punta hacia abajo al insertar el electrodo en el soporte de la pipeta del headtage (paso 3.2).
      NOTA: La modificación mecánica del electrodo de grabación VR es imprecisa y el paso 1.3.2 puede requerir múltiples intentos hasta que se logre una morfología de punta adecuada antes del pulido. El electrodo de grabación vr está biselizado para ajustarse a la curva corporal de las larvas. Una vez fabricado, el electrodo de grabación VR se puede usar repetidamente siempre y cuando la punta permanezca clara y limpia entre experimentos.
4. Generar el protocolo en programas de grabación de electrofisiología.
   1. Asegúrese de que el headtage derecho esté conectado a la entrada del Canal 1 en la parte posterior del amplificador de corriente y abrazadera de voltaje del microelectrodo para las grabaciones de neuronas aferentes y que el headtage izquierdo esté conectado a la entrada del Canal 2 para las grabaciones de VR.
      NOTA: Las especificaciones de la computadora para el amplificador de abrazadera de corriente y voltaje requieren mínimamente 1 Ghz o un mejor procesador, Windows XP Pro o Mac OS X 10.46.6, unidad de CD-ROM con 512 MB de RAM, 500 MB de espacio en el disco duro y 2 puertos USB.
   2. Abra el software del amplificador controlado por ordenador.
   3. Establezca el canal 1 y el canal 2 en el modo de abrazadera actual haciendo clic en el botón IC para cada canal.
   4. Introduzca los siguientes parámetros en las pestañas I-Clamp 1 e I-Clamp 2. Salida primaria: 100x AC Potencial de membrana (100,000 mV / mV), Ganancia:1,000, Bessel:1 kHz, AC:300 Hz, Alcance:Bypass. Salida secundaria: 100x AC Membrane Potential (100 mV/mV), Ganancia:1, Filtro lowpass: 10 Hz.
   5. Guarde los parámetros de canal como Ch1_Aff y Ch2_VR.
   6. Instale y abra el software de electrofisiología de la abrazadera del remiendo.
   7. Haga clic en Configurar y seleccione Lab Bench para configurar las señales analógicas agregando Ch1_Aff y Ch2_Vr a los canales del digitalizador (por ejemplo, #0 de entrada analógica y #1 de entrada analógica)que están conectados, por cable coaxial BNC, a las salidas escaladas a escala de canal 1 y canal 2 correspondientes del amplificador. Haga clic en Aceptar.
      NOTA: Los requisitos mínimos del equipo para el digitalizador son: un procesador de 1 Ghz o superior, Windows XP Pro o Mac OS X 10.46.6, unidad de CD-ROM de 512 MB de RAM, 500 MB de espacio en disco duro y 2 puertos USB.
   8. Haga clic en Adquirir y seleccione Nuevo protocolo.
   9. En la pestaña Modo/Tasa, seleccione Gap Free; en Modo de adquisición, establezca Longitud de prueba en Usar el espacio disponible en disco (es decir, grabar hasta que se detenga) o en un conjunto deseado Duración (hh:mm:ss) y, a continuación, establezca la Velocidad de muestreo por señal (Hz) en 20.000 para maximizar la resolución.
   10. En la ficha Entradas, seleccione los canales de entrada analógica que se configuraron previamente (en el paso 1.4.6) y seleccione Ch1_Aff y Ch2_VR para el canal correspondiente.
   11. En la pestaña Salidas, seleccione Cmd 0 y Cmd 1 para #0 de canal y #1 de canal,respectivamente.
       1. Conecte el comando del canal 1 en el amplificador a la salida analógica 0 en el digitalizador a través del cable coaxial BNC y repita el comando del canal 2 a la salida analógica 1.
   12. Las pestañas restantes pueden permanecer en la configuración predeterminada. Haga clic en Aceptar y guarde el protocolo.

2. Preparación de la solución

1. Preparar la solución de Hank: 137 mM NaCL, 5,4 mM KCl, 0,25 mM Na₂HPO_4,0,44 mM KH₂PO_4,1,3 mM CaCl_2,1,0 mM MgSO_4,4,2 mM NaHCO_4; pH 7,3. Diluya al 10% la solución de Hank añadiendo el volumen apropiado de agua desionizada a la cepa.
2. Preparar solución extracelular: 134 mM NaCl, 2.9 mM KCl, 1.2 mM MgCl_2,2.1 mM CaCl_2,10 mM glucosa, 10 mM HEPES tampón; pH 7,8 ajustado con NaOH. Filtro de vacío solución extracelular a través del filtro con tamaño de poro de 0,22 μm.
3. Preparar α -bungarotoxina: Disolver 1 mg de α-bungarotoxina liofilizada en solución extracelular de 10 mL para producir una dilución al 0,1%.
4. Prepare la solución de eutanasia: 50% (mg/L) tamponada de grado farmacéutico MS-222 en 10% solución de Hank.
   PRECAUCIÓN: α-bungarotoxina es una potente neurotoxina que paraliza los músculos bloqueando los receptores colinérgicos. Se requieren guantes y se recomienda protección ocular mientras se maneja el paralítico.

3. Preparación de larvas para registros electrofisiológicos

1. Inmovilizar las larvas de pez cebra.
   1. Utilice larvas de la población de pez cebra criada en laboratorio(Danio rerio;4-7 días después de la fertilización) y se alojen en solución embrionaria (10% solución de Hank) a 27 °C.
   2. Transfiera la larva de la carcasa a una pequeña placa de Petri (35 mm) utilizando una pipeta de transferencia de punta grande y retire la mayor cantidad posible de la solución circundante.
      NOTA: La extracción de la solución embrionaria evita la dilución del paralítico y aumenta su eficacia. La esquina de una toallita de tarea se puede utilizar para eliminar la solución embrionaria restante, y es fundamental no contactar con las larvas o dejar las larvas expuestas al aire.
   3. Sumergir las larvas en 10 μL de 0,1% α-bungarotoxina durante aproximadamente 5 min.
      NOTA: El tiempo necesario para inmovilizar las larvas varía entre las preparaciones. Una preparación saludable depende de monitorear de cerca el flujo sanguíneo rápido sostenido y la disminución de las respuestas motoras. La sobreexposición breve al paralítico puede conducir a una disminución lenta en la salud general de la preparación, incluso después de un lavado completo. Lo mejor es aplicar un lavado antes de que la larva esté completamente inmovilizada mientras todavía muestra signos de vibraciones musculares sutiles.
   4. Lavar la larva paralizada con solución extracelular y bañarse durante 10 min.
      NOTA: El lavado permite que la larva pase de vibraciones musculares sutiles a parálisis completa. Además, α-bungarotoxina es un antagonista de la subunidad α9 del receptor nicotínico de acetilcolina (nAChR), que es un componente crítico del circuito de retroalimentación endógena que observa este protocolo; sin embargo, este efecto ha demostrado ser reversible en xenopus y células ciliadas de pez cebra después de un lavado de 10 min^36,29.
2. Pin de pescado en el plato de grabación.
   NOTA: La anestesia (por ejemplo, MS-222, Tricaine) no se requiere mientras se prepara el pez cebra larval (4-7 dpf) ya que interfiere con la salud animal. De hecho, las larvas de pez cebra están exentas de ciertos protocolos de vertebrados.
   1. Usando la pipeta de transferencia, mueva la larva del baño de solución extracelular al plato de grabación con fondo de silicona. Llene el resto del plato con solución extracelular.
   2. Debajo de un estereomicroscopio, coloque suavemente las larvas con pinzas de punta fina por encima del centro de la estera de silicona, lateralmente hacia arriba, con los extremos anterior y posterior del cuerpo corriendo de izquierda a derecha, respectivamente. Luego agarre un pasador grabado de la estera de silicona usando pinzas de punta fina e inserte el pasador, ortogonalmente a la silicona, a través de la notocorda dorsal de las larvas directamente dorsal al ano. Inserte el segundo alfiler a través de la notocorda cerca del extremo de la cola e inserte el tercer pasador a través de la notocorda dorsal de la vejiga gaseosa (Figura 1B).
      NOTA: Al insertar alfileres, es importante apuntar al centro del ancho de la notocorda para evitar que el flujo sanguíneo se obstacumente o dañe la musculatura circundante. La notocorda es dorsal al nervio de la línea lateral posterior, por lo que con la fijación adecuada, no se espera ningún daño a las neuronas sensoriales de la línea lateral. Inserte después del primer contacto para no perturbar el tejido circundante. Idealmente, el diámetro del pasador es menos de la mitad del ancho de la notocorda para garantizar una inserción limpia. Si los pines superan este ancho, repita el paso 1.2 hasta que se alcance el ancho de pin deseado. Si el flujo sanguíneo se ralentiza después de fijar, repetir a partir del paso 1.3 con una nueva muestra.
   3. Inserte el cuarto pin a través de la vesícula ótica mientras proporciona una ligera rotación hacia el anterior a medida que el pin se inserta en el encapsulante (Figura 1B). A medida que se aplica una ligera rotación, observe el tejido entre el cleithrum y la vesícula ótica para revelar el grupo de somata aferente.
      NOTA: La inserción angulada del cuarto perno es asegurar la exposición del ganglio aferente de la línea lateral posterior, que es obstruido de otra manera por la vesícula ótica grande.

4. Registro de la raíz ventral

1. Coloque la larva anclada bajo el objetivo de inmersión en agua 10x en un microscopio vertical de contraste de interferencia diferencial (DIC) de etapa fija y oriente las hendiduras miseptas de los bloques musculares paralelos al vector de aproximación de la etapa inicial izquierda (Figura 1B).
   1. Un microscopio DIC de etapa fija flotado en una mesa de aire óptica funciona mejor para evitar que las vibraciones interfieran con las grabaciones. Utilizando un posicionador motorizado, el microscopio puede moverse libremente alrededor de la etapa fija en la que se montan la preparación y los headstages (Figura 1C).
   2. Coloque el cable de tierra en la solución de baño y asegúrese de que esté conectado al cabezado izquierdo.
2. Llene el electrodo de grabación VR con 30 μL de solución extracelular usando una punta de pipeta flexible de carga de gel e insértela en el soporte de la pipeta del escenario izquierdo.
3. Baje la pipeta de grabación en la solución de plato con un micromanipulador mientras aplica la presión positiva (1-2 mmHg) producida por un transductor neumático. Con un aumento de 10x, confirme que la orientación de la apertura de la punta está orientada hacia abajo.
   1. El transductor neumático debe conectarse al puerto del soporte de la pipeta a través de tubos de silicona.
4. Coloque el electrodo vr sobre el mioseptum
   1. Usando el micromanipulador de nuevo, baje la punta del electrodo vr hasta que se mantenga en posición por encima de la larva. Aumente el aumento a la inmersión de 40x.
   2. Lleve la punta del electrodo sobre un mioseptum entre dos miómeros ventrales a la línea lateral hasta que la hendidura se centre en la apertura de la punta del electrodo VR (Figura 1D).
   3. Baje la pipeta hasta que el borde rezagado de la abertura de la punta entre en contacto suavemente con el epitelio. Después del contacto inicial, maniobje la pipeta en diagonal para asegurarse de que el borde de ataque hace contacto y puede generar un sello.
   4. Aplique presión negativa (~100 mm Hg) con el transductor neumático y suba.
      NOTA: La orientación adecuada de la pipeta vr en relación con el mioseptum y la presión negativa continua optimiza la detección de la actividad de la neurona motora con una alta relación señal-ruido a través de la piel.
5. Detectar la actividad de las neuronas motoras.
   1. El headtage izquierdo debe estar conectado al amplificador, que retransmite la señal amplificada en un digitalizador que emite dicha señal en el software de electrofisiología de la abrazadera de parche para ser monitoreado en un ordenador adyacente (ver sección 1.4).
   2. En el software de abrazadera de parche, haga clic en el botón Reproducir en la barra de herramientas para monitorear la señal vr (Figura 1E).
   3. Asegúrese de que la grabación de RV se está logrando una vez que se observa la actividad de la neurona motora con una dinámica de señal de ráfaga bien estereotipada^29,37 (Figura 1E).
      NOTA: Los combates ficticios de natación son los patrones de actividad de las neuronas motoras vr que continúan transmitiendo a pesar de que la preparación está paralizada. Por lo tanto, los baños ficticios son un medio accesible para determinar el estado de comportamiento del animal y medir los parámetros locomotores al mismo tiempo que se realizan grabaciones de neuronas aferentes que requieren una preparación inmovilizada. En nuestras manos, una vez que se logra una grabación de realidad virtual, una preparación saludable provocará combates de natación ficticios voluntarios cada pocos segundos. Recuerde, una preparación saludable ha sostenido el flujo sanguíneo rápido. Tenga en cuenta que la obtención de una señal de realidad virtual suficiente puede tardar varios minutos y la relación señal/ruido puede mejorar después de la detección inicial. En aras del tiempo, es aceptable pasar a la sección 5.
   4. Si todavía no se logra una grabación de RV después de completar la sección 5, suelte la presión negativa, levante el electrodo y repita a partir del paso 4.4.2 en adelante en un mioseptum diferente si la salud de la larva sigue siendo óptima.

5. Registro de neuronas aferentes

1. Llene el electrodo de grabación aferente con 30 μL de solución extracelular; insertar en el soporte de la pipeta de la cabeza derecha(Figura 1B,C),y bajar en la solución para platos mientras se aplica la presión positiva (1-2 mm Hg) producida por un transductor neumático.
2. Localice y ate libremente al ganglio aferente de la línea lateral posterior.
   1. Usando un micromanipulador, baje la punta del electrodo aferente hasta que se mantenga en posición por encima del cleithrum.
   2. Aumente el aumento a la inmersión de 40x y localice la intersección del nervio de la línea lateral posterior y el cleithrum. Siga la línea lateral del nervio anterior desde el cleithrum hasta donde las fibras inerven la línea lateral posterior del ganglio aferente, distinguible por el cúmulo discreto de soma(Figura 1F).
   3. Lleve la punta del electrodo sobre el ganglio aferente y baje la pipeta hasta que la punta entre en contacto con el epitelio. Suavemente, manipule el electrodo para que toda la circunferencia de la punta entre en contacto con el ganglio aferente.
   4. Aplique presión negativa (20-50 mm Hg) con el transductor neumático y subadera.
      NOTA: La presión negativa aplicada al ganglio aferente es más suave que la succión aplicada durante el registro de la raíz ventral. El aumento de la presión negativa puede mejorar la señal a ruido, pero la salud de las neuronas aferentes disminuye bajo una succión agresiva sostenida, lo que disminuye la probabilidad de una grabación exitosa.
3. Registrar la actividad aferente de las neuronas.
   1. Asegúrese de que el headtage derecho esté conectado en una secuencia similar a la descrita en el paso 4.5.1.
   2. En pClamp10, haga clic en el botón Reproducir en la barra de herramientas para monitorear la neurona aferente y la señal vr simultáneamente.
   3. Asegúrese de que toda la célula, registro de parches sueltos de las neuronas aferentes se logra una vez que los picos se producen espontáneamente, aproximadamente cada 100-200 ms^1,29 (Figura 1E).
   4. Gradualmente, aumente la presión del electrodo de grabación de la neurona aferente de nuevo a la atmósfera (0 mm Hg) y mantenga durante el resto de la grabación.

6. Adquisición de datos

1. Grabación simultánea.
   1. Una vez que se detecta la actividad aferente de la neurona y la neurona motora, haga clic en el botón Grabar en la barra de herramientas en pClamp10 para capturar grabaciones simultáneas sin brechas en ambos canales.
   2. Registro para la duración deseada (Figura 1E).
      NOTA: Una grabación en una preparación saludable puede durar muchas horas y seguir respondiendo a los estímulos externos.
   3. Guarde la grabación como un tipo de archivo compatible (.abf, pClamp10) para conservar metadatos como parámetros de adquisición.

7. Eutanasia

1. Aplique presión positiva (10 mm Hg) a electrodos de grabación aferentes y vr utilizando transductores neumáticos y eleve los electrodos desde el plato de grabación utilizando los micromanipuladores.
2. Transfiera el plato de grabación del microscopio DIC de etapa fija al estereomicroscopio de disección.
3. Usando fórceps de punta fina, retire los pines de tungsteno de la notocorda y la cápsula ótica, y transfiera las larvas usando una pipeta de transferencia a una placa de Petri (35 mm) que contenga 5 mL de solución de eutanasia durante un mínimo de 5 min.

8. Preprocesamiento y análisis de datos

Nota : preprocesamiento de datos y análisis requerirá una comprensión básica de la codificación de línea de comandos.

1. Convierta el archivo de grabación para su preprocesamiento.
   1. Instale el software matlab.
   2. Descargue el script escrito personalizado, abfload.m³⁸ y guarde el archivo en la misma carpeta que almacena el archivo de grabación sin procesar.
   3. En la ventana Editor de Matlab, abra abfload.m y haga clic en Ejecutar en la barra de herramientas. Seleccione Cambiar carpeta, si se le solicita.
   4. Ejecute la función en la ventana de comandos con el archivo de grabación sin procesar como entrada,
      > [d,si,h] = abfload('[nombre de archivo de grabación sin procesar].abf')
      y guarde el espacio de trabajo de salida con un nombre de archivo que incluya la designación de larva, la edad y la fecha experimental, como [número de muestra]_[edad en dpf]_[nombre de archivo de grabación sin procesar (incluye la fecha experimental de forma predeterminada)].
      Nota : el nombre de archivo convertido sólo debe incluir enteros delineados de subrayado.
2. Realizar el preprocesamiento de datos.
   1. Descargue el script matlab AffVR_preprocess.m y las funciones asociadas, escrito personalizado por los autores.
   2. En la ventana Editor, abra AffVR_preprocess.m.
   3. En Variables, ajuste los umbrales de detección de picos de límite inferior para grabaciones aferentes y vr(spk_detect_lb y vr_detect_lb,líneas 8 y 14, respectivamente) dependiendo de la grabación de la relación señal-ruido.
      NOTA: La detección de picos se basa en umbrales manuales para ordenar y aislar señales de más de una neurona aferente por amplitud. El ruido de línea base y la actividad de otras unidades se filtran por umbral para incluir solo las amplitudes de pico dentro de un porcentaje (por ejemplo, spk_detect_lb) del máximo (por ejemplo, spk_detect_ub). El umbral también garantiza la agrupación precisa de los picos de actividad motora en ráfagas y combates de natación ficticios colectivos. Por lo general, comience con un límite inferior de umbral de 0,5 y disminuya gradualmente hasta que se logre una detección precisa. Por ejemplo, establecer spk_detect_lb como 0.5 y spk_detect_ub como 1.0 detectará todos los picos iguales o superiores al 50% de la amplitud máxima de pico y excluirá el ruido o las neuronas adicionales de amplitudes de pico más bajas (Figura 2A). Alternativamente, también se podría bajar la spk_detect_ub de 1.0 para excluir neuronas de amplitudes de pico más altas con el fin de aislar las neuronas de amplitudes de pico más bajas. Las salidas de las cifras de preprocesamiento (véase el paso 7.2.6) informarán si es necesario realizar ajustes y repetir desde el paso 7.2.2.
   4. En la ventana Editor, haga clic en Ejecutar para ejecutar AffVR_preprocess.m.
   5. Desplácese hasta el archivo de datos .mat convertido anteriormente (consulte el paso 7.1.3); seleccione y haga clic en Abrir para comenzar el preprocesamiento automatizado.
      Nota : mientras se ejecuta la secuencia de comandos personalizada, salidas aparecerán en la ventana de comandos informando de su progreso a través de pasos de procesamiento como "filtrado de datos ...", "detectar la actividad raíz ventral ..."y "generar figuras ...".
   6. Las cifras generadas por AffVR_preprocess.m visualizarán el pico aferente y la detección de RV e indicarán si se debe ajustar alguna variable de análisis (Figura 2).
   7. Escriba "Y" en el teclado para guardar los metadatos preprocesados en una carpeta de preprocess_output.
   8. Los datos preprocesados se generarán automáticamente como data_out.xls.
3. Analice los datos preprocesados como desee.

Resultados

Después de que las larvas de pez cebra se inmovilizan correctamente y se logra el ganglio aferente de la línea lateral posterior y el registro de VR, la actividad en las neuronas aferentes y motoras se puede medir simultáneamente. Los canales de grabación se muestran utilizando protocolos de grabación sin brechas (paso 1.4) para el monitoreo continuo de la actividad aferente y vr. En tiempo real, se pueden observar disminuciones en la tasa de picos aferentes espontáneos simultáneamente con la actividad de RV indic...

Discusión

El protocolo experimental descrito proporciona el potencial para monitorear los cambios endógenos en la entrada sensorial a través de los comportamientos motores en un vertebrado intacto y comportándose. Específicamente, detalla un enfoque in vivo para realizar grabaciones extracelulares simultáneas de neuronas aferentes de línea lateral y raíces motoras ventrales en larvas de pez cebra. La actividad aferente espontánea se ha caracterizado previamente en el pez cebra sin tener en cuenta la potencial actividad mot...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mL beaker	PYREX	1000	resceptacle for etchant
10x water immersion objective	Olympus	UMPLFLN10xW	low magnification for positioning larvae and recording electrode
40x water immersion objective	Olympus	LUMPLFLN40XW	higher magnification for position electrode tip and establishing patch-clamp
abfload.m		supplemental coding file	custom written MATLAB script for converting raw electrophysiology recordings to .mat files
AffVR_preprocess.m		supplemental coding file	custom written MATLAB script for preprocessing recording data
BNC coaxial cables	ThorLabs	2249-C-12	connecting amplifier and digitizer channels; require 4
borosilicate glass capillaries w/ filament	Warner Instruments	G150F-3	inner diameter: 0.86, outer diameter: 1.50; capillary glass used to form recording electrodes
burst_detect		supplemental coding file	custom written MATLAB function necessary to run AffVR_preprocess.m
computer	N/A	N/A	any computer should work
DC Power Supply	Tenma	72-420	used for electrically etching dissection pins
electrophysiology digitizer	Axon Instruments, Molecular Devices	Axon DigiData 1440A	enables acquisition of patch-clamp data
filament	Sutter Instrument Company	FB255B	2.5 mm box filament used in micropipette puller
fine forceps	Fine Science Tools	Dumont #5 (0.05 x 0.02 mm) Item No. 11295-10	used to manipulate larvae and insert pins
fixed stage DIC microscope	Olympus	BX51WI	microscope used to visualize and establish patch-clamp recordings
flexible, tapered pipette tip	Fisher Scientific	02-707-169	flexible tips enable insertion into recording electrode to dispense extracellular solution at the tip
FluoroDish	World Precision Instruments Inc.	FD3510-100	cover glass bottomed dish recording dish
KimWipe	KimTech	34155	task wipe used for wicking away excess fluid from larvae
Kwik-Gard	World Precision Instruments Inc.	710172	self-mixing sylgard elastomer
MATLAB	MathWorks	R2020b	command line software for preprocessing data
microelectrode amplifier	Axon Instruments, Molecular Devices	MultiClamp 700B	patch clamp amplifier for dual channel recordings
microforge	Narishige	MF-830 microforge	to polish recording electrode
micromanipulator control unit	Siskiyou	MC1000-eR/T	4-axis dial coordinator for controlling micromanipulator
micropipette puller	Sutter Instrument Company	Flaming/Brown P-97	for pulling capillary glass into recording electrodes
microscope control unit	Siskiyou	MC1000e	positions the microscope around the fixed stage and preparation
motorized micromanipulator	Siskiyou	MX7600	positions the headstage and attached recording electrode for patch-clamp recording
MultiClamp Commander	Molecular Devices	2.2.2	downloadable from Axon MultiClamp 700B Commander download page
optical air table	Newport Corporation	VH3036W-OPT	breadboard isolation table to float microscope and minimize vibrations during recordings
pCLAMP	Molecular Devices	10.7.0	downloadable from Axon pCLAMP 10 Electrophysiology Data Acquisition & Analysis Software Download page
permanent ink marker	Sharpie	order from amazon.com	for marking the leading edge side of the VR electrode to ensure proper orientation when inserting into pipette holder
petri-dish	Falcon	35-3001	used to immerse larvae in paralytic
pipette holder	Molecular Devices	1-HL-U	hold recording electrode and connect to the headstage
pneumatic transducer	Fluke Biomedical Instruments	DPM1B	for controlling recording electrode internal pressure
potassium hydroxide	Sigma-Aldrich	221473-25G	etchant for etching dissection pins
silicone tubing	Tygon	14-169-1A	tubing to connect pneumatic transducer to pipette holder
spike_detect		supplemental coding file	custom written MATLAB function necessary to run AffVR_preprocess.m
stereomicroscope	Carl Zeiss	Stemi 2000-C	used to visualize pin tips and during preparation of larvae
straight edge razor blade	Canopus	order from amazon.com	cuts the tungsten wire while making dissection pins
swimbout_detect		supplemental coding file	custom written MATLAB function necessary to run AffVR_preprocess.m
syringe	Becton Dickinson Compoany	309602	filled with extracellular solution to inject into recording electrodes
transfer pipette	Sigma-Aldrich	Z135003-500EA	single use, non-sterile pipette for transfering larvae
tricaine methanesulfonate	Syndel	12854	pharmaceutical aneasthetic used to euthanize larvae with high dosage.
tungsten wire	World Precision Instruments Inc.	715500	0.002 inch, 50.8 μm diameter; used to make dissection pins
vacuum filtration unit	Sigma-Aldrich	SCGVU11RE	single use, sterile, vacuum filtration units used to sterilize extracellular solution used for electrophysiology electrode ringer
voltage-clamp current-clamp headstage	Molecular Devices	CV-7B	supplied with MultiClamp 700B amplifier used as left and right headstages
α-bungarotoxin	ThermoFisher	B1601	for immobilizing the larvae prior to recording