Attività dei neuroni afferenti della linea laterale posteriore durante il nuoto in Zebrafish

Riepilogo

Descriviamo un protocollo per monitorare i cambiamenti nell'attività dei neuroni afferenti durante i comandi motori in un modello di sistema di cellule ciere vertebrate.

Abstract

I sistemi sensoriali raccolgono segnali essenziali per dirigere il comportamento, ma gli animali devono decifrare quali informazioni sono biologicamente rilevanti. La locomozione genera segnali di disafferente che gli animali devono districare dai segnali sensoriali rilevanti dell'ambiente circostante. Ad esempio, quando un pesce nuota, il flusso generato dalle ondulazioni del corpo viene rilevato dai neurositi meccanorecettivi, che comprendono cellule ciliate, che compongono il sistema di linee laterale. Le cellule ciliate trasmettono quindi informazioni sul movimento del fluido dal sensore al cervello attraverso i neuroni afferenti sensoriali. Contemporaneamente, la scarica corollare del comando motorio viene trasmessa alle cellule ciliate per evitare sovraccarichi sensoriali. La contabilizzazione dell'effetto inibitorio dei segnali motori predittivi durante la locomozione è, quindi, fondamentale quando si valuta la sensibilità del sistema di linee laterale. Abbiamo sviluppato un approccio elettrofisiologico in vivo per monitorare contemporaneamente l'attività del neurone afverso della linea laterale posteriore e della radice motoria ventrale nelle larve di zebrafish (4-7 giorni dopo la fecondazione) che può durare diverse ore. Le registrazioni extracellulari dei neuroni afferenti si ottengono utilizzando la tecnica del patch clamp sciolto, che può rilevare l'attività da singoli o più neuroni. Le registrazioni delle radici ventrali vengono eseguite attraverso la pelle con elettrodi di vetro per rilevare l'attività dei motoneuroni. Il nostro protocollo sperimentale offre il potenziale per monitorare i cambiamenti endogeni o evocati nell'input sensoriale attraverso i comportamenti motori in un vertebrato intatto e comportamentale.

Introduzione

Neuroni afferenti di sistemi meccanosensoriali trasmettono informazioni dalle cellule ciliate al cervello durante l'udito e l'equilibrio. L'elettrofisiologia può rivelare la sensibilità dei neuroni afferenti attraverso registrazioni dirette. Mentre l'applicazione di patch a cellule intere dalle cellule ciliate può essere impegnativa, la registrazione da neuroni a valle è più semplice e consente la valutazione dei potenziali d'azione in risposta alle^{stimolazioni controllate 1,2,3}. Stimolare le cellule ciliate porta alla loro deflessione, che modifica le strutture meccanicosensoriali, innescando così un aumento dei potenziali d'azione (picchi) nei neuroni afferenti^4,5,6. In assenza di stimoli esterni, anche i neuroni afenti aumentano spontaneamente a causa della perdita di glutammato dalle cellule ciliate ai terminali post-sinaptici afetti^7,8e hanno dimostrato di contribuire a mantenere la^{sensibilità 9,10}. La registrazione del morsetto patch dell'attività afosa consente l'osservazione della sensibilità delle cellule cilieche e della dinamica del segnale che non sono possibili utilizzando tecniche con risoluzione temporale inferiore, come nella microfotica^11,12 o nell'imaging funzionale^{del calcio 13,14,15}. Il seguente protocollo consentirà la registrazione di attività diverse in concomitanza con i comandi motori per rivelare cambiamenti istantanei nella sensibilità delle cellule ciecarie.

I pesci zebra (Danio rerio) utilizzano cellule ciliate contenute in neurosumache che compongono il sistema di linee laterale per rilevare il movimento dell'acqua rispetto al loro corpo, che si traduce in segnali neurali essenziali^{per la navigazione 16,17,18,}l'elusione dei predatori, la cattura delle prede^19,20e la^{scolarizzazione 21.} Il flusso d'acqua può anche essere autogenerato dai movimenti^{del nuoto 22,23,24,respirazione 22,25,26}e alimentazione²⁷. Questi comportamenti comprendono movimenti ripetitivi che possono affaticare le cellule ciliate e compromettere il rilevamento. Pertanto, è fondamentale che il sistema di linee laterale distingua tra stimoli di flusso esterni (esafferenti) e autogenerati (reafferenti). Una scarica corollare attenua i segnali di flusso autogenerati durante la locomozione nei pesci zebra. Questo segnale motore predittivo inibitorio viene trasmesso tramite neuroni discendenti ai recettori sensoriali per modificare l'ingresso o interrompere l'elaborazione del feedback reafferente^28,29. Il lavoro seminale che ha contribuito alla nostra comprensione precoce di questo sistema feedforward si è basato su preparati in vitro in cui la connettività e l'attività endogena del circuito neurale^{non sono state mantenute 28,30,31,32,33,34,35}. Questo protocollo descrive un approccio alla conservazione di un circuito neurale intatto in cui vengono mantenute dinamiche di feedback endogene consentendo così una migliore comprensione della scarica corollare in vivo.

Il protocollo qui delineato descrive come monitorare l'attività del neurone afferente della linea laterale posteriore e del motoneurone contemporaneamente nel pesce zebra larvale. Caratterizzare la dinamica del segnale afferente prima, durante e dopo i comandi motori fornisce informazioni sul feedback endogeno in tempo reale del sistema nervoso centrale che modula la sensibilità delle cellule ciere durante la locomozione. Questo protocollo delinea quali materiali dovranno essere preparati prima degli esperimenti e quindi descrive come paralizzare e preparare le larve di zebrafish. Il protocollo descriverà come stabilire una registrazione stabile delle patch sciolte dei neuroni afferenti e delle registrazioni di radici ventrali extracellulari (VR) dei motoneuroni. I dati rappresentativi che possono essere ottenuti utilizzando questo protocollo sono presentati da un individuo esemplare e l'analisi è stata eseguita su più repliche del protocollo sperimentale. La pre-elaborazione dei dati viene eseguita utilizzando script scritti personalizzati in MATLAB. Nel complesso, questo paradigma sperimentale in vivo è pronto a fornire una migliore comprensione del feedback sensoriale durante la locomozione in un sistema di cellule ciere vertebrate modello.

Protocollo

Tutte le cure e gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con i protocolli approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università della Florida.

1. Preparazione di materiali per registrazioni elettrofisiopatiche

1. Crea una teglia di registrazione con fondo in elastomero in silicone.
   1. Erogare un sottile strato di componenti elastomeri siliconi auto-miscelati (ad esempio, Sylgard) in un piatto di coltura tissutale con fondo di vetro di copertura fino a quando non si sovrapponi al bordo di pozzo poco profondo. Circa 0,5 mL sono sufficienti.
   2. Coprire e curare il piatto per un minimo di 48 ore a temperatura ambiente.
2. Creare perni di dissezione.
   1. Fornire una carica negativa (5 V) a un bicchiere di incisione da 100 mL (3M KOH) utilizzando un alimentatore CC e collegare un filo di tungsteno (0,002 pollici; 50,8 μm di diametro) all'uscita caricata positivamente.
      ATTENZIONE: I fili negativi e positivi non devono rsi in contatto tra loro durante questa procedura in quanto è possibile correre il rischio di produrre scintille, che potrebbero rappresentare un potenziale rischio di incendio.
   2. Incidere il filo di tungsteno scavando rapidamente e ripetutamente la punta del filo nel bagno dell'incisione fino a quando la punta si restringe a un punto acuto. Sotto uno stereomicroscopio, tagliare il filo a circa 1 mm dalla punta con una lama di rasoio a bordo dritto. Ripetere altre tre volte e quindi inserire i perni nella piastra di registrazione stagionata utilizzando pin fine.
3. Preparare elettrodi di registrazione.
   1. Tirare un tubo capillare in vetro borosilicato (diametro interno: 0,86 mm, diametro esterno: 1,50 mm) utilizzando un estrattore di micropipette orizzontale con filamento a scatola in elettrodi con punta di diametro di 30 μm con leggera cono(Figura 1 Ai)che verrà utilizzato per registrare neuroni afferenti dalla linea laterale posteriore.
   2. Tirare un ulteriore tubo capillare in vetro borosilicato in un paio di elettrodi con diametri di punta più piccoli (1-5 μm). Tenendo un elettrodo in ogni mano, far scorrere delicatamente le punte l'una sull'altra per romperle con un angolo di ~ 30 °. Utilizzando una microforgia, lucidare la punta smussata fino a quando non è liscia. Il diametro finale della punta deve essere compreso tra 30-50 μm e verrà utilizzato come elettrodo di registrazione della radice ventrale (VR)(Figura 1 Aii).
   3. Contrassegnare il lato dell'elettrodo VR con il bordo anteriore con inchiostro permanente per aiutare ad orientare l'apertura della punta verso il basso quando si inserisce l'elettrodo nel supporto della pipetta del teste (passaggio 3.2).
      NOTA: La modifica meccanica dell'elettrodo di registrazione VR è imprecisa e il passaggio 1.3.2 può richiedere più tentativi fino a quando non viene raggiunta una morfologia della punta adeguata prima della lucidatura. L'elettrodo di registrazione VR è smussato per conformarsi alla curva del corpo delle larve. Una volta fabbricato, l'elettrodo di registrazione VR può essere utilizzato ripetutamente purché la punta rimanga chiara e pulita tra gli esperimenti.
4. Generare il protocollo nei programmi di registrazione elettrofisiologia.
   1. Assicurarsi che il headstage destro sia collegato all'ingresso Channel 1 nella parte posteriore dell'amplificatore di corrente microelettrode e morsetto di tensione per le registrazioni dei neuroni afferenti e che il headstage sinistro sia collegato all'ingresso channel 2 per le registrazioni VR.
      NOTA: le specifiche del computer per l'amplificatore a morsetto di corrente e tensione richiedono minimamente 1 Ghz o un processore migliore, Windows XP Pro o Mac OS X 10.46.6, unità CD-ROM con RAM da 512 MB, spazio sul disco rigido da 500 MB e 2 porte USB.
   2. Aprire il software dell'amplificatore controllato dal computer.
   3. Impostare channel 1 e canale 2 sulla modalità di blocco corrente facendo clic sul pulsante IC per ogni canale.
   4. Inserire i seguenti parametri sia nelle schede I-Clamp 1 che I-Clamp 2 . Uscita primaria: 100x AC Membrane Potential (100.000 mV/mV), Gain: 1.000, Bessel: 1 kHz, AC: 300 Hz, Scope: Bypass . Uscita secondaria: 100x AC Membrane Potential (100 mV/mV) , Gain: 1 , Lowpass Filter: 10 Hz.
   5. Salvare i parametri del canale Ch1_Aff e Ch2_VR.
   6. Installare e aprire il software di elettrofisiologia del morsetto patch.
   7. Fare clic su Configura e selezionare Lab Bench per impostare i segnali analogici aggiungendo Ch1_Aff e Ch2_Vr ai canali digitalizzatore (ad esempio, Analog IN #0 e Analog IN #1) collegati, tramite cavo coassiale BNC, alle corrispondenti uscite in scala del canale 1 e canale 2 dell'amplificatore. Fare clic su OK.
      NOTA: I requisiti minimi del computer per il digitalizzatore sono: un processore da 1 Ghz o superiore, Windows XP Pro o Mac OS X 10.46.6, unità CD-ROM 512 MB di RAM, 500 MB di spazio sul disco rigido e 2 porte USB.
   8. Fare clic su Acquisisci e selezionare Nuovo protocollo.
   9. Nella scheda Modalità/Tariffa selezionare Gap Free; in Modalità acquisizioneimpostare Lunghezza prova su Usa spazio su disco disponibile (ad esempio, record fino all'arresto) o su un set desiderato Durata (hh:mm:ss), quindi impostare la frequenza di campionamento per segnale (Hz) su 20.000 per massimizzare la risoluzione.
   10. Nella scheda Ingressi selezionare i canali IN analogici configurati in precedenza (nel passaggio 1.4.6) e selezionare Ch1_Aff e Ch2_VR per il canale corrispondente.
   11. Nella scheda Uscite selezionare Cmd 0 e Cmd 1 rispettivamente per Channel #0 e Channel #1.
       1. Collegare channel 1 Command sull'amplificatore a Analog Ouput 0 sul digitalizzatore tramite cavo coassiale BNC e ripetere per channel 2 command to analog output 1.
   12. Le schede rimanenti possono rimanere sotto le impostazioni predefinite. Clicca su OK e salva il protocollo.

2. Preparazione della soluzione

1. Preparare la soluzione di Hank: 137 mM NaCL, 5,4 mM KCl, 0,25 mM Na₂HPO₄, 0,44 mM KH₂PO_4,1,3 mM CaCl₂, 1,0 mM MgSO₄, 4,2 mM NaHCO₄; pH 7.3. Diluire al 10% la soluzione di Hank aggiungendo il volume appropriato di acqua deionizzata allo stock.
2. Preparare la soluzione extracellulare: NaCl da 134 mM, KCl da 2,9 mM, MgCl₂da 1,2 mM, CaCl_{2, glucosio}da 10 mM, tampone HEPES da 10 mM; pH 7.8 regolato con NaOH. Filtro sottovuoto soluzione extracellulare attraverso il filtro con dimensioni dei pori di 0,22 μm.
3. Preparare α -bungarotossine: Sciogliere 1 mg di α-bungarotossine liofilizzata in soluzione extracellulare da 10 mL per produrre lo 0,1% di diluizione.
4. Preparare la soluzione eutanasia: 50% (mg/L) tamponato di grado farmaceutico MS-222 nella soluzione del 10% hank.
   ATTENZIONE: α-bungarotossina è una potente neurotossina che paralizza i muscoli bloccando i recettori colinergici. Sono necessari guanti e si consiglia la protezione degli occhi durante la manipolazione del paralitico.

3. Preparazione di larve per registrazioni elettrofisiopatiche

1. Immobilizzare le larve di zebrafish.
   1. Utilizzare larve della popolazione allevata in laboratorio di zebrafish(Danio rerio;4-7 giorni dopo la fecondazione) e ospitare in soluzione embrionale (soluzione 10% Hank) a 27 °C.
   2. Trasferire la larva dall'alloggiamento in una piccola piastra di Petri (35 mm) utilizzando una pipetta di trasferimento a punta grande e rimuovere la maggior parte possibile della soluzione circostante.
      NOTA: La rimozione della soluzione embrionale previene la diluizione del paralitico e aumenta la sua efficacia. L'angolo di una salvietta per compiti può essere utilizzato per eliminare la soluzione embrionale rimanente ed è fondamentale non contattare le larve o lasciare le larve esposte all'aria.
   3. Immergere le larve in 10 μL dello 0,1% α-bungarotossine per circa 5 minuti.
      NOTA: Il tempo necessario per immobilizzare le larve varia tra i preparati. Una preparazione sana dipende dal monitoraggio attento del flusso sanguigno veloce sostenuto e dalla diminuzione delle risposte motorie. Una breve sovraesposizione al paralitico può portare a un lento declino della salute generale della preparazione anche dopo un lavaggio approfondito. È meglio applicare un lavaggio prima che la larva sia completamente immobilizzata mentre mostra ancora segni di sottili vibrazioni muscolari.
   4. Lavare la larva paralizzata con soluzione extracellulare e fare il bagno per 10 minuti.
      NOTA: Il washout consente alla larva di passare da sottili vibrazioni muscolari a paralisi completa. Inoltre, α-bungarotossina è un antagonista del recettore nicotinico dell'acetilcolina (nAChR) α9-subunità, che è una componente critica del circuito di feedback endogeno osservato da questo protocollo; tuttavia, questo effetto si è dimostrato reversibile nelle cellule ciliate xenopus e zebrafish dopo un lavaggio di 10 minuti^36,29.
2. Pin pesce nel piatto di registrazione.
   NOTA: L'anestesia (ad esempio, MS-222, Tricaina) non è richiesta durante la preparazione del pesce zebra larvale (4-7 dpf) in quanto interferisce con la salute degli animali. Infatti, i pesci zebra larvali sono esenti da alcuni protocolli vertebrati.
   1. Utilizzando pipetta di trasferimento, spostare la larva dal bagno della soluzione extracellulare alla piastra di registrazione con fondo silicone. Riempire il resto del piatto con soluzione extracellulare.
   2. Sotto uno stereomicroscopio, posizionare delicatamente le larve con forcep a punta fine sopra il centro del tappetino in silicone, lato laterale verso l'alto, con le estremità anteriore e posteriore del corpo che corrono da sinistra a destra, rispettivamente. Quindi afferrare un perno inciso dal tappetino in silicone usando pini a punta fine e inserire il perno, ortogonalmente al silicone, attraverso il notocordo dorsale delle larve direttamente dorsale all'ano. Inserire il secondo perno attraverso il notocordo verso l'estremità della coda e inserire il terzo perno attraverso la dorsale notocordo della vescica gassoso (Figura 1B).
      NOTA: Durante l'inserimento dei perni, è importante mirare al centro della larghezza del notocordo per evitare di impetosi flussi sanguigni o danneggiare la muscolatura circostante. Il notocordo è dorsale al nervo della linea laterale posteriore, quindi con un corretto inchiodamento, non ci si aspetta alcun danno ai neuroni sensoriali della linea laterale. Inserire dopo il primo contatto per non disturbare il tessuto circostante. Idealmente, il diametro del perno è inferiore alla metà della larghezza del notocordo per garantire un inserimento pulito. Se i perni superano questa larghezza, ripetere il passaggio 1.2 fino a raggiungere la larghezza del perno desiderata. Se il flusso sanguigno rallenta dopo l'inchiodamento, ripetere dal passaggio 1.3 in poi con un nuovo campione.
   3. Inserire il quarto perno attraverso la vescicola otica fornendo una leggera rotazione verso il anteriore mentre il perno si inserisce nell'incapsulante (Figura 1B). Quando viene applicata una leggera rotazione, osserva il tessuto tra il cleitro e la vescicola otica per rivelare il gruppo di somata afferente.
      NOTA: L'inserimento angolato del quarto perno è quello di garantire l'esposizione del ganglio afferente della linea laterale posteriore, che è altrimenti ostruito dal grande vescicola otico.

4. Registrazione della radice ventrale

1. Posizionare la larva appuntata sotto l'obiettivo di immersione dell'acqua 10x su un microscopio verticale a contrasto di interferenza differenziale a stadio fisso (DIC) e orientare le fessure del myseptal dei blocchi muscolari paralleli al vettore di avvicinamento del headstage sinistro (Figura 1B).
   1. Un microscopio DIC a stadio fisso galleggiato su un tavolo d'aria ottico funziona meglio per evitare che le vibrazioni interferiscano con le registrazioni. Utilizzando un posizionatore motorizzato, il microscopio può quindi muoversi liberamente intorno allo stadio fisso in cui sono montati la preparazione e i teste(Figura 1C).
   2. Posizionare il filo di terra nella soluzione del bagno e assicurarsi che sia collegato al headstage sinistro.
2. Riempire l'elettrodo di registrazione VR con 30 μL di soluzione extracellulare utilizzando una punta flessibile per pipetta a caricamento in gel e inserire nel supporto della pipetta del headstage sinistro.
3. Abbassare la pipetta di registrazione nella soluzione per piatti con un micromanipolatore applicando una pressione positiva (1-2 mmHg) prodotta da un trasduttore pneumatico. Sotto l'ingrandimento 10x, confermare che l'orientamento dell'apertura della punta è rivolto verso il basso.
   1. Il trasduttore pneumatico deve essere collegato alla porta porta porta porta pipetta tramite tubi in silicone.
4. Posizionare l'elettrodo VR sul miosio
   1. Utilizzando di nuovo il micromanipolatore, abbassare la punta dell'elettrodo VR fino a mantenere la posizione sopra la larva. Aumentare l'ingrandimento a 40 volte l'immersione.
   2. Portare la punta dell'elettrodo su un miosiotto tra due miomeri ventrali alla linea laterale fino a quando la fessura non è centrata nell'apertura della punta dell'elettrodo VR(Figura 1D).
   3. Abbassare la pipetta fino a quando il bordo in ritardo dell'apertura della punta contatta delicatamente l'epitelio. Dopo il contatto iniziale, manovrare la pipetta in diagonale per assicurarsi che il bordo d'avanguardia faccia contatto e possa generare una guarnizione.
   4. Applicare la pressione negativa (~100 mm Hg) con il trasduttore pneumatico e tenere premuto.
      NOTA: Il corretto orientamento della pipetta VR rispetto al mioosepto e la pressione negativa continua ottimizzano il rilevamento dell'attività dei motoneuroni con un elevato rapporto segnale-rumore attraverso la pelle.
5. Rilevare l'attività dei motoneuroni.
   1. Il headstage sinistro deve essere collegato all'amplificatore, che trasmette il segnale amplificato in un digitalizzatore che emette detto segnale nel software di elettrofisiologia del morsetto del cerotto da monitorare su un computer adiacente (vedere la sezione 1.4).
   2. Nel software di patch clamp, fare clic sul pulsante Riproduci sulla barra degli strumenti per monitorare il segnale VR (Figura 1E).
   3. Assicurarsi che la registrazione VR venga raggiunta una volta osservata l'attività dei motoneuroni con dinamiche del segnale burst ben stereotipate^29,37 (Figura 1E).
      NOTA: Gli attacchi di nuoto fittizi sono i modelli di attività dei motoneuroni VR che continuano a trasmettere nonostante la preparazione sia paralizzata. Pertanto, le nuotate fittizie sono un mezzo accessibile per determinare lo stato comportamentale dell'animale e misurare i parametri locomotori eseguendo contemporaneamente registrazioni di neuroni afferenti che richiedono una preparazione immobilizzata. Nelle nostre mani, una volta ottenuta una registrazione VR, una sana preparazione oserà incontri di nuoto fittizi volontari ogni pochi secondi. Ricorda, una preparazione sana ha sostenuto un flusso sanguigno veloce. Attenzione, l'ottenimento di un segnale VR sufficiente può richiedere diversi minuti e il rapporto segnale/rumore può migliorare dopo il rilevamento iniziale. Nell'interesse del tempo, è accettabile passare al paragrafo 5.
   4. Se una registrazione VR non viene ancora raggiunta dopo aver completato la sezione 5, rilasciare la pressione negativa, sollevare l'elettrodo e ripetere dal passaggio 4.4.2 in poi su un miosio diverso se la salute della larva è ancora ottimale.

5. Registrazione dei neuroni afferenti

1. Riempire l'elettrodo di registrazione afferente con 30 μL di soluzione extracellulare; inserire nel supporto della pipetta del headstage destro(Figura 1B, C) e abbassare nella soluzione del piatto applicando una pressione positiva (1-2 mm Hg) prodotta da un trasduttore pneumatico.
2. Individuare e attaccare liberamente al ganglio afferente della linea laterale posteriore.
   1. Utilizzando un micromanipolatore, abbassare la punta dell'elettrodo afferente fino a mantenere la posizione sopra il cleithrum.
   2. Aumentare l'ingrandimento a 40x immersione e individuare l'intersezione del nervo della linea laterale posteriore e del cleitro. Seguire il nervo anteriore della linea laterale dal cleitro al punto in cui le fibre innervate la linea laterale posteriore ganglio afferente, distinguibile dall'ammasso discreto di soma(Figura 1F).
   3. Portare la punta dell'elettrodo sopra il ganglio afferente e abbassare la pipetta fino a quando la punta non contatta l'epitelio. Manovrare delicatamente l'elettrodo in modo che l'intera circonferenza della punta contatti il ganglio afferente.
   4. Applicare la pressione negativa (20-50 mm Hg) con il trasduttore pneumatico e tenere premuto.
      NOTA: La pressione negativa applicata al ganglio afferente è più delicata dell'aspirazione applicata durante la registrazione della radice ventrale. L'aumento della pressione negativa può migliorare il segnale al rumore, ma la salute dei neuroni afferente diminuisce sotto un'aspirazione aggressiva sostenuta, che diminuisce la probabilità di una registrazione riuscita.
3. Registra l'attività dei neuroni afferente.
   1. Assicurarsi che il testine destro sia collegato in una sequenza simile a quella descritta al passaggio 4.5.1.
   2. In pClamp10, fare clic sul pulsante Riproduci sulla barra degli strumenti per monitorare contemporaneamente il neurone e il segnale VR afferente.
   3. Assicurarsi che l'intera cellula, la registrazione libera delle patch dei neuroni afferenti si ottiene una volta che i picchi si verificano spontaneamente, all'incirca ogni 100-200 ms^1,29 (Figura 1E).
   4. A poco a poco, aumentare la pressione dell'elettrodo di registrazione dei neuroni afferente fino all'atmosfera (0 mm Hg) e tenere premuto per il resto della registrazione.

6. Acquisizione dei dati

1. Registrazione simultanea.
   1. Una volta rilevata l'attività del neurone e del motoneurone, fare clic sul pulsante Registra sulla barra degli strumenti in pClamp10 per acquisire registrazioni simultanee gap free in entrambi i canali.
   2. Record per la durata desiderata (Figura 1E).
      NOTA: Una registrazione in una preparazione sana può durare molte ore e rimanere reattiva agli stimoli esterni.
   3. Salvare la registrazione come tipo di file supportato (con estensione abf, pClamp10) per mantenere metadati quali i parametri di acquisizione.

7. Eutanasia

1. Applicare pressione positiva (10 mm Hg) sia agli elettrodi di registrazione afferenti che VR utilizzando trasduttori pneumatici e sollevare gli elettrodi dalla piastra di registrazione utilizzando i micromanipolatori.
2. Trasferire la scheda di registrazione dal microscopio DIC a stadio fisso allo stereomicroscopio a dissezione.
3. Utilizzando pin di punta fine, rimuovere i perni di tungsteno dal notocordo e dalla capsula otica e trasferire le larve utilizzando una pipetta di trasferimento in una piastra di Petri (35 mm) contenente 5 mL di soluzione di eutanasia per un minimo di 5 minuti.

8. Pre-elaborazione e analisi dei dati

NOTA: la pre-elaborazione e l'analisi dei dati richiederanno una conoscenza di base della codifica della riga di comando.

1. Convertire il file di registrazione per la pre-elaborazione.
   1. Installare il software Matlab.
   2. Scaricare lo script scritto personalizzato, abfload.m³⁸ e salvare il file nella stessa cartella in cui è archiviato il file di registrazione non elaborati.
   3. Nella finestra Editor Matlab aprire abfload.m fare clic su Esegui sulla barra degli strumenti. Selezionare Cambia cartella, se richiesto.
   4. Eseguire la funzione nella finestra di comando con il file di registrazione non elaborati come input,
      > [d,si,h] = abfload('[nome file di registrazione non elaborati].abf')
      e salvare il workspace di output con un nome di file che include la designazione larva, l'età e la data sperimentale, ad esempio [numero campione]_[età in dpf]_[nome file di registrazione non elaborati (include la data sperimentale per impostazione predefinita)].
      NOTA: il nome del file convertito deve includere solo numeri interi delineati con caratteri di sottolineatura.
2. Eseguire la pre-elaborazione dei dati.
   1. Scarica lo script Matlab AffVR_preprocess.m e le funzioni associate, scritte su misura dagli autori.
   2. Nella finestra Editor aprire AffVR_preprocess.m.
   3. In Variabiliregolare le soglie di rilevamento dei picchi con limite inferiore per le registrazioni afferente e VR (rispettivamente spk_detect_lb e vr_detect_lb, linee 8 e 14) a seconda della registrazione del rapporto segnale/rumore.
      NOTA: il rilevamento dei picchi si basa sulla soglia manuale per ordinare e isolare i segnali da più di un neuronefferente per ampiezza. Il rumore e l'attività di base di altre unità vengono filtrati mediante soglia per includere solo ampiezze di picco entro una percentuale (ad esempio, spk_detect_lb) del massimo (ad esempio, spk_detect_ub). La soglia garantisce anche un binning accurato dei picchi di attività motoria in raffiche e attacchi collettivi di nuoto fittizi. In genere, iniziare con una soglia inferiore di 0,5 e diminuire gradualmente fino a ottenere un rilevamento accurato. Ad esempio, l'impostazione di spk_detect_lb come 0,5 e spk_detect_ub come 1,0 rileverà tutti i picchi uguali o superiori al 50% dell'ampiezza massima del picco ed escluderà il rumore o altri neuroni di ampiezze di picco inferiori (Figura 2A). In alternativa, si potrebbe anche abbassare il spk_detect_ub da 1,0 per escludere neuroni di ampiezze di picco più elevate al fine di isolare i neuroni delle ampiezze di picco più basse. Le uscite di cifra di pre-elaborazione (cfr. fase 7.2.6) informeranno se sono necessarie regolazioni e ripetizioni a partire dal passaggio 7.2.2.
   4. Nella finestra Editor fare clic su Esegui per eseguire AffVR_preprocess.m.
   5. Passare al file di dati mat convertito in precedenza (vedere il passaggio 7.1.3); selezionare e fare clic su Apri per iniziare la pre-elaborazione automatizzata.
      NOTA: mentre lo script personalizzato è in esecuzione, gli output verranno visualizzati nella finestra di comando che ne informano lo stato di avanzamento attraverso passaggi di elaborazione come "filtraggio dei dati ...", "rilevamento dell'attività radice ventrale ..." e "generazione di cifre ...".
   6. Le cifre generate AffVR_preprocess.m visualizzeranno il picco afferente e il rilevamento VR e indicheranno se eventuali variabili di analisi devono essere regolate (Figura 2).
   7. Immettere "Y" sulla tastiera per salvare i metadati pre-elaborati in una preprocess_output cartella.
   8. I dati pre-elaborati verranno generati automaticamente come data_out.xls.
3. Analizzare i dati pre-elaborati come desiderato.

Risultati

Dopo che le larve di zebrafish sono state correttamente immobilizzate e la linea laterale posteriore si ottiene ganglio afferente e registrazione VR, l'attività sia nei motoneuroni che nei motoneuroni può essere misurata contemporaneamente. I canali di registrazione vengono visualizzati utilizzando protocolli di registrazione gap-free (passaggio 1.4) per il monitoraggio continuo dell'attività afferente e VR. In tempo reale, si possono osservare diminuzioni del tasso di picco afferente spontaneo simultaneo all'attivit?...

Discussione

Il protocollo sperimentale descritto fornisce il potenziale per monitorare i cambiamenti endogeni nell'input sensoriale attraverso i comportamenti motori in un vertebrato intatto e si comporta. In particolare, descrive in dettaglio un approccio in vivo all'esecuzione simultanea di registrazioni extracellulari di neuroni afferenti a linea laterale e radici motorie ventrali nel pesce zebra larvale. L'attività spontanea efferente è stata precedentemente caratterizzata nel pesce zebra senza considerare la potenziale attivi...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mL beaker	PYREX	1000	resceptacle for etchant
10x water immersion objective	Olympus	UMPLFLN10xW	low magnification for positioning larvae and recording electrode
40x water immersion objective	Olympus	LUMPLFLN40XW	higher magnification for position electrode tip and establishing patch-clamp
abfload.m		supplemental coding file	custom written MATLAB script for converting raw electrophysiology recordings to .mat files
AffVR_preprocess.m		supplemental coding file	custom written MATLAB script for preprocessing recording data
BNC coaxial cables	ThorLabs	2249-C-12	connecting amplifier and digitizer channels; require 4
borosilicate glass capillaries w/ filament	Warner Instruments	G150F-3	inner diameter: 0.86, outer diameter: 1.50; capillary glass used to form recording electrodes
burst_detect		supplemental coding file	custom written MATLAB function necessary to run AffVR_preprocess.m
computer	N/A	N/A	any computer should work
DC Power Supply	Tenma	72-420	used for electrically etching dissection pins
electrophysiology digitizer	Axon Instruments, Molecular Devices	Axon DigiData 1440A	enables acquisition of patch-clamp data
filament	Sutter Instrument Company	FB255B	2.5 mm box filament used in micropipette puller
fine forceps	Fine Science Tools	Dumont #5 (0.05 x 0.02 mm) Item No. 11295-10	used to manipulate larvae and insert pins
fixed stage DIC microscope	Olympus	BX51WI	microscope used to visualize and establish patch-clamp recordings
flexible, tapered pipette tip	Fisher Scientific	02-707-169	flexible tips enable insertion into recording electrode to dispense extracellular solution at the tip
FluoroDish	World Precision Instruments Inc.	FD3510-100	cover glass bottomed dish recording dish
KimWipe	KimTech	34155	task wipe used for wicking away excess fluid from larvae
Kwik-Gard	World Precision Instruments Inc.	710172	self-mixing sylgard elastomer
MATLAB	MathWorks	R2020b	command line software for preprocessing data
microelectrode amplifier	Axon Instruments, Molecular Devices	MultiClamp 700B	patch clamp amplifier for dual channel recordings
microforge	Narishige	MF-830 microforge	to polish recording electrode
micromanipulator control unit	Siskiyou	MC1000-eR/T	4-axis dial coordinator for controlling micromanipulator
micropipette puller	Sutter Instrument Company	Flaming/Brown P-97	for pulling capillary glass into recording electrodes
microscope control unit	Siskiyou	MC1000e	positions the microscope around the fixed stage and preparation
motorized micromanipulator	Siskiyou	MX7600	positions the headstage and attached recording electrode for patch-clamp recording
MultiClamp Commander	Molecular Devices	2.2.2	downloadable from Axon MultiClamp 700B Commander download page
optical air table	Newport Corporation	VH3036W-OPT	breadboard isolation table to float microscope and minimize vibrations during recordings
pCLAMP	Molecular Devices	10.7.0	downloadable from Axon pCLAMP 10 Electrophysiology Data Acquisition & Analysis Software Download page
permanent ink marker	Sharpie	order from amazon.com	for marking the leading edge side of the VR electrode to ensure proper orientation when inserting into pipette holder
petri-dish	Falcon	35-3001	used to immerse larvae in paralytic
pipette holder	Molecular Devices	1-HL-U	hold recording electrode and connect to the headstage
pneumatic transducer	Fluke Biomedical Instruments	DPM1B	for controlling recording electrode internal pressure
potassium hydroxide	Sigma-Aldrich	221473-25G	etchant for etching dissection pins
silicone tubing	Tygon	14-169-1A	tubing to connect pneumatic transducer to pipette holder
spike_detect		supplemental coding file	custom written MATLAB function necessary to run AffVR_preprocess.m
stereomicroscope	Carl Zeiss	Stemi 2000-C	used to visualize pin tips and during preparation of larvae
straight edge razor blade	Canopus	order from amazon.com	cuts the tungsten wire while making dissection pins
swimbout_detect		supplemental coding file	custom written MATLAB function necessary to run AffVR_preprocess.m
syringe	Becton Dickinson Compoany	309602	filled with extracellular solution to inject into recording electrodes
transfer pipette	Sigma-Aldrich	Z135003-500EA	single use, non-sterile pipette for transfering larvae
tricaine methanesulfonate	Syndel	12854	pharmaceutical aneasthetic used to euthanize larvae with high dosage.
tungsten wire	World Precision Instruments Inc.	715500	0.002 inch, 50.8 μm diameter; used to make dissection pins
vacuum filtration unit	Sigma-Aldrich	SCGVU11RE	single use, sterile, vacuum filtration units used to sterilize extracellular solution used for electrophysiology electrode ringer
voltage-clamp current-clamp headstage	Molecular Devices	CV-7B	supplied with MultiClamp 700B amplifier used as left and right headstages
α-bungarotoxin	ThermoFisher	B1601	for immobilizing the larvae prior to recording