Activité des neurones afférents de la ligne latérale postérieure pendant la baignade chez le poisson zèbre

Résumé

Nous décrivons un protocole pour surveiller des changements de l’activité afférente de neurone pendant des commandes de moteur dans un système de cellules de cheveux vertébré modèle.

Résumé

Les systèmes sensoriels rassemblent des indices essentiels pour diriger le comportement, mais les animaux doivent déchiffrer quelles informations sont biologiquement pertinentes. La locomotion génère des indices reafferents que les animaux doivent démêler des indices sensoriels pertinents de l’environnement environnant. Par exemple, lorsqu’un poisson nage, le flux généré par les ondulations corporelles est détecté par les neuromastes mécanoréceptifs, comprenant des cellules ciliées, qui composent le système de la ligne latérale. Les cellules ciliées transmettent ensuite des informations de mouvement fluide du capteur au cerveau via les neurones afférents sensoriels. Simultanément, la décharge corollaire de la commande motrice est relayée aux cellules ciliées pour empêcher la surcharge sensorielle. La prise en compte de l’effet inhibiteur des signaux moteurs prédictifs pendant la locomotion est donc critique lors de l’évaluation de la sensibilité du système de ligne latérale. Nous avons développé une approche électrophysiologique in vivo pour surveiller simultanément le neurone afférent de ligne latérale postérieure et l’activité ventrale de racine de moteur dans les larves de poisson zèbre (4-7 jours après la fertilisation) qui peuvent durer plusieurs heures. Les enregistrements extracellulaires des neurones afférents sont réalisés utilisant la technique lâche de serrage de correction, qui peut détecter l’activité des neurones simples ou multiples. Les enregistrements de racines ventrales sont effectués à travers la peau avec des électrodes en verre pour détecter l’activité des motoneurones. Notre protocole expérimental offre le potentiel de surveiller les changements endogènes ou évoqués dans l’entrée sensorielle à travers les comportements moteurs chez un vertébré intact et se comportant.

Introduction

Les neurones afférents des systèmes mécanosensoires transmettent des informations des cellules ciliées au cerveau pendant l’audition et l’équilibre. L’électrophysiologie peut révéler la sensibilité des neurones afférents grâce à des enregistrements directs. Alors que le patchage de cellules entières à partir de cellules ciliées peut être difficile, l’enregistrement à partir de neurones afférents en aval est plus facile et permet d’évaluer les potentiels d’action en réponse à des stimulations contrôlées^1,2,3. La stimulation des cellules ciliées conduit à leur déviation, ce qui modifie les structures mécanosensoires, déclenchant ainsi une augmentation des potentiels d’action (pointes) dans les neurones afférents^4,5,6. En l’absence de stimuli externes, les neurones afférents piquent également spontanément en raison d’une fuite de glutamate des cellules ciliées vers les bornes post-synaptiques afférentes^7,8,et il a été démontré qu’ils contribuent au maintien de la sensibilité^9,10. L’enregistrement de l’activité afférente par pince patch permet d’observer la sensibilité des cellules ciliés et la dynamique du signal qui ne sont pas possibles en utilisant des techniques à résolution temporelle plus faible, telles que dans la microphonie^{11, 12} ou l’imageriefonctionnelle du calcium^13,14,15. Le protocole suivant permettra à l’enregistrement de l’activité afférente en même temps que les commandes motrices de révéler des changements instantanés de la sensibilité des cellules ciliés.

Les poissons zèbres(Danio rerio)utilisent des cellules ciliées contenues dans les neuromastes qui composent le système de ligne latérale pour détecter le mouvement de l’eau par rapport à leur corps, ce qui se traduit par des signaux neuronaux essentiels à la navigation^16,17,18,l’évitement des prédateurs, la capture des proies^19,20et la scolarisation^21. L’écoulement de l’eau peut également être auto-généré par les mouvements de^{la natation 22,23,24,}de la respiration^22,25,26et de l’alimentation^27. Ces comportements comprennent des mouvements répétitifs qui peuvent fatiguer les cellules ciliées et altérer la détection. Par conséquent, il est essentiel que le système de ligne latérale différencie les stimuli d’écoulement externes (exafferents) et auto-générés (reafferent). Un rejet corollaire atténue les signaux d’écoulement auto-générés pendant la locomotion chez le poisson zèbre. Ce signal moteur prédictif inhibiteur est relayé via les neurones descendants vers les récepteurs sensoriels pour modifier l’entrée ou interrompre le traitement de la rétroaction reafferente^28,29. Les travaux fondateurs contribuant à notre compréhension précoce de ce système d’alimentation se sont appuyés sur des préparations in vitro où la connectivité et l’activité endogène du circuit neuronal n’ont pas été maintenues^{28,30, 31,32,33,34,35.} Ce protocole décrit une approche à la préservation d’un circuit neural intact où la dynamique endogène de rétroaction est maintenue de ce fait permettant une meilleure compréhension de la décharge corollaire in vivo.

Le protocole décrit ici décrit comment surveiller le neurone afférent de ligne latérale postérieure et l’activité de neurone moteur simultanément dans le poisson zèbre larvaire. La caractérisation de la dynamique du signal afférent avant, pendant et après les commandes motrices fournit des informations sur la rétroaction endogène en temps réel du système nerveux central qui module la sensibilité des cellules ciliées pendant la locomotion. Ce protocole décrit les matériaux qui devront être préparés avant les expériences, puis décrit comment paralyser et préparer les larves de poissons zèbres. Le protocole décrira comment établir un enregistrement lâche stable de correction des neurones afférents et des enregistrements extracellulaires de racine ventrale (VR) des neurones moteurs. Les données représentatives qui peuvent être obtenues utilisant ce protocole sont présentées à partir d’un individu d’exemple et l’analyse a été exécutée sur de multiples répétitions du protocole expérimental. Le prétraitement des données est effectué à l’aide de scripts écrits personnalisés dans MATLAB. Dans l’ensemble, ce paradigme expérimental in vivo est sur le point de fournir une meilleure compréhension de la rétroaction sensorielle lors de la locomotion dans un système modèle de cellules ciliées vertébrées.

Protocole

Tous les soins et expériences sur les animaux ont été effectués conformément aux protocoles approuvés par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université de Floride.

1. Préparation de matériaux pour les enregistrements électrophysiologiques

1. Faites un plat d’enregistrement à fond d’élastomère en silicone.
   1. Distribuez une fine couche de composants d’élastomère de silicone auto-mélangeants (p. ex. Sylgard) dans un plat de culture de tissu à fond de verre de couverture jusqu’à ce qu’il se stabilise avec le bord du puits peu profond. Environ 0,5 mL est suffisant.
   2. Couvrir et durcir le plat pendant au moins 48 h à température ambiante.
2. Faites des épingles de dissection.
   1. Fournir une charge négative (5 V) à un bécher d’etchant de 100 mL (3M KOH) à l’aide d’une alimentation CC et fixer un fil de tungstène (0,002 pouce; 50,8 μm de diamètre) à la sortie chargée positivement.
      ATTENTION: Les fils négatifs et positifs ne doivent pas entrer en contact les uns avec les autres au cours de cette procédure, car vous risquez de produire des étincelles, ce qui pourrait poser un risque d’incendie potentiel.
   2. Graver le fil de tungstène en plongeant rapidement et à plusieurs reprises la pointe du fil dans le bain d’étichant jusqu’à ce que la pointe se rétrécisse à un point pointu. Sous un stéréomicroscope, coupez le fil à environ 1 mm de la pointe avec une lame de rasoir à bord droit. Répétez trois fois de plus, puis insérez des broches dans le plat d’enregistrement durci à l’aide d’une pince fine.
3. Préparer des électrodes d’enregistrement.
   1. Tirez un tube capillaire en verre borosilicate (diamètre intérieur : 0,86 mm, diamètre extérieur : 1,50 mm) à l’aide d’un tiroir à micropipette horizontal avec filament de boîte dans des électrodes avec une pointe de 30 μm de diamètre avec une légère conicité (Figure 1 Ai) qui sera utilisée pour enregistrer les neurones afférents de la ligne latérale postérieure.
   2. Tirez un tube capillaire en verre borosilicate supplémentaire dans une paire d’électrodes avec des diamètres de pointe plus petits (1-5 μm). Tenant une électrode dans chaque main, passez doucement les pointes les unes sur les autres pour les casser à un angle d’environ 30 °. À l’aide d’un microforge, polir la pointe biseautée jusqu’à consistance lisse. Le diamètre final de la pointe doit être compris entre 30 et 50 μm et sera utilisé comme électrode d’enregistrement de la racine ventrale (VR)(Figure 1 Aii).
   3. Marquez le côté de l’électrode VR avec le bord d’attaque avec de l’encre permanente pour aider à orienter l’ouverture de la pointe vers le bas lors de l’insertion de l’électrode dans le support de pipette de la scène (étape 3.2).
      REMARQUE: La modification mécanique de l’électrode d’enregistrement VR est imprécise et l’étape 1.3.2 peut nécessiter plusieurs tentatives jusqu’à ce qu’une morphologie de pointe appropriée soit atteinte avant le polissage. L’électrode d’enregistrement VR est biseautée pour se conformer à la courbe corporelle des larves. Une fois fabriquée, l’électrode d’enregistrement VR peut être utilisée à plusieurs reprises tant que la pointe reste claire et propre entre les expériences.
4. Générer le protocole dans les programmes d’enregistrement électrophysiologique.
   1. Assurez-vous que la scène de tête droite est connectée à l’entrée du canal 1 à l’arrière de l’amplificateur de tension et de courant de microélectrode pour les enregistrements de neurones afférents et que la scène de tête gauche est connectée à l’entrée du canal 2 pour les enregistrements VR.
      REMARQUE: Les spécifications de l’ordinateur pour l’amplificateur de serrage de courant et de tension nécessitent au minimum 1 Ghz ou un processeur supérieur, Windows XP Professionnel ou Mac OS X 10.46.6, lecteur de CD-ROM avec 512 Mo de RAM, 500 Mo d’espace disque dur et 2 ports USB.
   2. Ouvrez le logiciel d’amplificateur contrôlé par ordinateur.
   3. Réglez les canaux 1 et 2 en mode de serrage actuel en cliquant sur le bouton IC de chaque canal.
   4. Entrez les paramètres suivants sous les onglets I-Clamp 1 et I-Clamp 2. Sortie primaire: 100x Potentiel de membrane AC (100,000 mV / mV), Gain:1,000, Bessel:1 kHz , AC:300 Hz , Portée:Bypass . Sortie secondaire: 100x Potentiel de membrane AC (100 mV / mV) , Gain:1 , Filtre passe-bas: 10 Hz.
   5. Enregistrez les paramètres de canal en tant que Ch1_Aff et Ch2_VR.
   6. Installez et ouvrez le logiciel d’électrophysiologie patch clamp.
   7. Cliquez sur Configurer et sélectionnez Banc de laboratoire pour configurer les signaux analogiques en ajoutant Ch1_Aff et Ch2_Vr aux canaux de numériseur (par exemple, analogique IN #0 et analogique IN #1)qui sont connectés, par câble coaxial BNC, aux sorties mises à l’échelle du canal 1 et du canal 2 correspondantes de l’amplificateur. Cliquez sur OK.
      Remarque : la configuration minimale requise pour l’ordinateur pour le numériseur sont : un processeur de 1 Ghz ou mieux, Windows XP Professionnel ou Mac OS X 10.46.6, lecteur de CD-ROM 512 Mo de RAM, 500 Mo d’espace disque dur et 2 ports USB.
   8. Cliquez sur Acquérir et sélectionnez Nouveau protocole.
   9. Dans l’onglet Mode/Taux, sélectionnez Sans espace; sous Mode d’acquisition, définissez La durée d’essai sur Utiliser l’espace disque disponible (c’est-à-dire enregistrer jusqu’à ce qu’il soit arrêté) ou sur une durée définie souhaitée (hh: mm: ss), puis définissez le taux d’échantillonnage par signal (Hz) sur 20 000 pour maximiser la résolution.
   10. Sous l’onglet Entrées, sélectionnez les canaux IN analogiques précédemment configurés (à l’étape 1.4.6), puis sélectionnez Ch1_Aff et Ch2_VR pour le canal correspondant.
   11. Sous l’onglet Sorties, sélectionnez Cmd 0 et Cmd 1 pour Channel #0 et Channel #1, respectivement.
       1. Connectez la commande Channel 1 de l’amplificateur à l’alimentation analogique 0 sur le numériseur via un câble coaxial BNC et répétez pour la commande Channel 2 vers la sortie analogique 1.
   12. Les onglets restants peuvent rester sous les paramètres par défaut. Cliquez sur OK et enregistrez le protocole.

2. Préparation de la solution

1. Préparer la solution de Hank : 137 mM de NaCL, 5,4 mM de KCl, 0,25 mM de_Na2HPO4,0,44 mM_KH2PO4, 1,3 mM de CaCl2 , 1,0 mM de MgSO4 , 4,2 mM de NaHCO4 ; pH 7,3. Diluer à 10% la solution de Hank en ajoutant le volume approprié d’eau désionisée au stock.
2. Préparer une solution extracellulaire : NaCl 134 mM, KCl 2,9 mM, MgCl 2_1,2mM, CaCl_{2 mM,}10 mM de glucose, tampon HEPES 10 mM ; pH 7,8 ajusté avec NaOH. Filtre à vide solution extracellulaire à travers le filtre avec une taille de pores de 0,22 μm.
3. Préparer α -bungarotoxine : Dissoudre 1 mg de α-bungarotoxine lyophilisée dans une solution extracellulaire de 10 mL pour produire une dilution de 0,1 %.
4. Préparer une solution d’euthanasie : 50 % (mg/L) de MS-222 tamponné de qualité pharmaceutique dans une solution de Hank à 10 %.
   ATTENTION : α-bungarotoxin est une neurotoxine puissante qui paralyse les muscles en bloquant les récepteurs cholinergiques. Des gants sont nécessaires et une protection des yeux est recommandée lors de la manipulation du paralytique.

3. Préparation des larves pour les enregistrements électrophysiologiques

1. Immobiliser les larves de poissons zèbres.
   1. Utiliser des larves de la population de poissons zèbres élevée en laboratoire(Danio rerio; 4 à 7 jours après la fécondation) et les loger en solution embryonnaire (solution de Hank à 10 %) à 27 °C.
   2. Transférer la larve du logement dans une petite boîte de Petri (35 mm) à l’aide d’une pipette de transfert à grande pointe et enlever autant de solution environnante que possible.
      REMARQUE: L’élimination de la solution embryonnaire empêche la dilution du paralytique et augmente son efficacité. Le coin d’une lingette de tâche peut être utilisé pour évacuer la solution embryonnaire restante, et il est essentiel de ne pas entrer en contact avec les larves ou de laisser les larves exposées à l’air.
   3. Immerger les larves dans 10 μL de 0,1 % de α-bungarotoxine pendant environ 5 min.
      REMARQUE: Le temps nécessaire pour immobiliser les larves varie selon les préparations. Une préparation saine dépend de la surveillance étroite d’un flux sanguin rapide soutenu et d’une diminution des réponses motrices. Une brève surexposition au paralytique peut entraîner un lent déclin de la santé globale de la préparation, même après un lavage complet. Il est préférable d’appliquer un lavage avant que la larve ne soit complètement immobilisée alors qu’elle montre encore des signes de vibrations musculaires subtiles.
   4. Laver la larve paralysée avec une solution extracellulaire et se baigner pendant 10 min.
      REMARQUE: L’affouillement permet à la larve de passer de vibrations musculaires subtiles à une paralysie complète. En outre, α-bungarotoxine est un antagoniste de la sous-unité α9 du récepteur nicotinique de l’acétylcholine (nAChR), qui est un composant critique du circuit de rétroaction endogène que ce protocole observe; cependant, cet effet s’est avéré réversible dans les cellules ciliées de Xenopus et de poisson zèbre après un lavage de 10 min^36,29.
2. Épinglez le poisson dans le plat d’enregistrement.
   REMARQUE : L’anesthésie (p. ex. MS-222, Tricaine) n’est pas nécessaire lors de la préparation des larves de poissons zèbres (4-7 dpf), car elle nuit à la santé animale. En fait, les larves de poissons zèbres sont exemptées de certains protocoles sur les vertébrés.
   1. À l’aide de la pipette de transfert, déplacez la larve du bain de solution extracellulaire vers le plat d’enregistrement à fond de silicone. Remplissez le reste du plat avec une solution extracellulaire.
   2. Sous un stéréomicroscope, positionnez doucement les larves avec des pinces à pointe fine au-dessus du centre du tapis de silicone, côté latéral vers le haut, avec les extrémités antérieures et postérieures du corps allant de gauche à droite, respectivement. Saisissez ensuite une goupille gravée du tapis de silicone à l’aide d’une pince à pointe fine et insérez la goupille, orthogonalement dans le silicone, à travers la notochord dorsale des larves directement dorsales à l’anus. Insérez la deuxième goupille à travers la notochorde près de l’extrémité de la queue et insérez la troisième goupille à travers la ténochure dorsale de la vessie gazeuse(figure 1B).
      REMARQUE: Lors de l’insertion de broches, il est important de cibler le centre de la largeur du notochord pour éviter d’entraver le flux sanguin ou d’endommager la musculature environnante. Le notochord est dorsal au nerf latéral postérieur de ligne, donc avec l’épinglage approprié, aucun dommage n’est prévu aux neurones sensoriels de ligne latérale. Insérer après le premier contact pour ne pas perturber les tissus environnants. Idéalement, le diamètre de la broche est inférieur à la moitié de la largeur de la notochord pour assurer une insertion propre. Si les broches dépassent cette largeur, répétez l’étape 1.2 jusqu’à ce que la largeur de broche souhaitée soit atteinte. Si le flux sanguin ralentit après l’épinglage, répéter à partir de l’étape 1.3 avec un nouvel échantillon.
   3. Insérez la quatrième goupille à travers la vésicule otique tout en assurant une légère rotation vers l’antérieure pendant que la goupille s’insère dans l’encapsulant(figure 1B). Comme une légère rotation est appliquée, surveillez le tissu entre le cleithrum et la vésicule otique pour révéler l’amas de somata afférente.
      REMARQUE: L’insertion inclinée de la quatrième broche est d’assurer l’exposition du ganglion afférent de ligne latérale postérieure, qui est autrement obstrué par la grande vésicule otique.

4. Enregistrement de la racine ventrale

1. Placer la larve épinglée sous l’objectif d’immersion dans l’eau 10x sur un microscope vertical à contraste différentiel d’interférence (DIC) à étage fixe et orienter les fentes myseptales des blocs musculaires parallèlement au vecteur d’approche de la tête gauche(Figure 1B).
   1. Un microscope DIC à étage fixe flottant sur une table d’air optique fonctionne mieux pour empêcher les vibrations d’interférer avec les enregistrements. À l’aide d’un positionneur motorisé, le microscope peut alors se déplacer librement autour de l’étage fixe dans lequel la préparation et les scènes de tête sont montées(Figure 1C).
   2. Placez le fil de terre dans la solution de bain et assurez-vous qu’il est connecté à la scène de tête gauche.
2. Remplissez l’électrode d’enregistrement VR avec 30 μL de solution extracellulaire à l’aide d’une pointe de pipette flexible à chargement de gel et insérez-la dans le support de pipette de la scène de tête gauche.
3. Abaisser la pipette d’enregistrement dans la solution de la parabole avec un micromanipulateur tout en appliquant une pression positive (1-2 mmHg) produite par un transducteur pneumatique. Sous grossissement 10x, confirmez que l’orientation de l’ouverture de la pointe est orientée vers le bas.
   1. Le transducteur pneumatique doit être connecté à l’orifice du porte-pipette via un tube en silicone.
4. Placez l’électrode VR sur le myoseptum
   1. En utilisant à nouveau le micromanipulateur, abaissez la pointe de l’électrode VR jusqu’à ce qu’elle tienne la position au-dessus de la larve. Augmentez le grossissement à 40x immersion.
   2. Amenez la pointe de l’électrode sur un myoseptum entre deux myomères ventraux à la ligne latérale jusqu’à ce que la fente soit centrée dans l’ouverture de la pointe de l’électrode VR(Figure 1D).
   3. Abaissez la pipette jusqu’à ce que le bord de retard de l’ouverture de la pointe entre doucement en contact avec l’épithélium. Après le contact initial, manœuvrez la pipette en diagonale pour vous assurer que le bord d’attaque entre en contact et peut générer un joint.
   4. Appliquer une pression négative (~ 100 mm Hg) avec le transducteur pneumatique et maintenir.
      REMARQUE: Une bonne orientation de la pipette VR par rapport au myoseptum et à la pression négative continue optimise la détection de l’activité des motoneurones avec un rapport signal/bruit élevé à travers la peau.
5. Détecter l’activité des motoneurones.
   1. La scène de tête gauche doit être connectée à l’amplificateur, qui relaie le signal amplifié dans un numériseur qui émet ledit signal dans le logiciel d’électrophysiologie de la pince de raccordement à surveiller sur un ordinateur adjacent (voir section 1.4).
   2. Dans le logiciel patch clamp, cliquez sur le bouton Play (Lecture) de la barre d’outils pour surveiller le signal VR (Figure 1E).
   3. Assurez-vous que l’enregistrement VR est réalisé une fois que l’activité des motoneurones avec une dynamique de signal de rafale bien stéréotypée est observée^29,37 (Figure 1E).
      REMARQUE: Les épisodes de natation fictifs sont les modèles d’activité des motoneurones VR qui continuent à transmettre malgré la préparation étant paralysée. Par conséquent, les nages fictives sont un moyen accessible de déterminer l’état comportemental de l’animal et de mesurer les paramètres locomoteurs tout en effectuant simultanément des enregistrements neuronaux afférents qui nécessitent une préparation immobilisée. Entre nos mains, une fois qu’un enregistrement VR est réalisé, une préparation saine suscitera des combats de natation fictifs volontaires toutes les quelques secondes. Rappelez-vous, une préparation saine a soutenu un flux sanguin rapide. Sachez que l’obtention d’un signal VR suffisant peut prendre plusieurs minutes et que le rapport signal/bruit peut s’améliorer après la détection initiale. Pour des soucis de temps, il est acceptable de passer à l’article 5.
   4. Si un enregistrement VR n’est toujours pas réalisé après avoir terminé la section 5, relâchez la pression négative, soulevez l’électrode et répétez à partir de l’étape 4.4.2 sur un myoseptum différent si la santé de la larve est toujours optimale.

5. Enregistrement des neurones afférents

1. Remplir l’électrode d’enregistrement afférente avec 30 μL de solution extracellulaire; insérer dans le porte-pipette de la tête droite(figure 1B,C)et plus bas dans la solution de la parabole en appliquant une pression positive (1-2 mm Hg) produite par un transducteur pneumatique.
2. Localiser et attacher lâchement au ganglion afférent de ligne latérale postérieure.
   1. À l’aide d’un micromanipulateur, abaissez la pointe de l’électrode afférente jusqu’à ce qu’elle tienne la position au-dessus du cleithrum.
   2. Augmentez le grossissement à 40x immersion et localisez l’intersection du nerf de la ligne latérale postérieure et du cleithrum. Suivre le nerf de la ligne latérale antérieure du cleithrum jusqu’à l’endroit où les fibres innervent le ganglion afférent de la ligne latérale postérieure, distinguable par le groupe discret de soma(figure 1F).
   3. Amenez la pointe de l’électrode sur le ganglion afférent et abaissez la pipette jusqu’à ce que la pointe entre en contact avec l’épithélium. Manœuvrez doucement l’électrode de sorte que toute la circonférence de la pointe entre en contact avec le ganglion afférent.
   4. Appliquer une pression négative (20-50 mm Hg) avec le transducteur pneumatique et maintenir.
      REMARQUE: La pression négative appliquée au ganglion afférent est plus douce que l’aspiration appliquée pendant l’enregistrement ventral de la racine. L’augmentation de la pression négative peut améliorer le signal au bruit, mais la santé des neurones afférents diminue sous une aspiration agressive soutenue, ce qui diminue la probabilité d’un enregistrement réussi.
3. Enregistrer l’activité des neurones afférents.
   1. Assurez-vous que la scène d’tête droite est connectée dans un ordre similaire à celui décrit à l’étape 4.5.1.
   2. Dans pClamp10, cliquez sur le bouton Lecture de la barre d’outils pour surveiller simultanément le neurone afférent et le signal VR.
   3. Assurez-vous que l’enregistrement de patchs en vrac de cellules entières des neurones afférents est atteint une fois que les pics se produisent spontanément, environ tous les 100-200 ms^1,29 (Figure 1E).
   4. Progressivement, augmentez la pression de l’électrode d’enregistrement du neurone afférent à l’atmosphère (0 mm Hg) et maintenez-le pour le reste de l’enregistrement.

6. Acquisition de données

1. Enregistrement simultané.
   1. Une fois que l’activité du neurone afférent et du motoneurone est détectée, cliquez sur le bouton Enregistrer dans la barre d’outils dans pClamp10 pour capturer des enregistrements simultanés sans espace dans les deux canaux.
   2. Enregistrer la durée souhaitée(Figure 1E).
      REMARQUE: Un enregistrement dans une préparation saine peut durer de nombreuses heures et rester sensible aux stimuli externes.
   3. Enregistrez l’enregistrement en tant que type de fichier pris en charge (.abf, pClamp10) pour conserver les métadonnées telles que les paramètres d’acquisition.

7. Euthanasie

1. Appliquer une pression positive (10 mm Hg) sur les électrodes d’enregistrement afférentes et VR à l’aide de transducteurs pneumatiques et soulever les électrodes de la parabole d’enregistrement à l’aide des micromanipulateurs.
2. Transférer la parabole d’enregistrement du microscope DIC à étage fixe au stéréomicroscope de dissection.
3. À l’aide de pinces à pointe fine, retirer les épingles de tungstène de la notochorde et de la capsule otique, et transférer les larves à l’aide d’une pipette de transfert dans une boîte de Petri (35 mm) contenant 5 mL de solution d’euthanasie pendant au moins 5 min.

8. Prétraitement et analyse des données

REMARQUE : le prétraitement et l’analyse des données nécessiteront une compréhension de base du codage de ligne de commande.

1. Convertissez le fichier d’enregistrement pour le prétraitement.
   1. Installez le logiciel Matlab.
   2. Téléchargez le script écrit personnalisé, abfload.m³⁸ et enregistrez le fichier dans le même dossier qui stocke le fichier d’enregistrement brut.
   3. Dans la fenêtre matlab Editor, ouvrez abfload.m et cliquez sur Exécuter dans la barre d’outils. Sélectionnez Modifier le dossier, si vous y êtes invité.
   4. Exécutez la fonction dans la fenêtre commande avec le fichier d’enregistrement brut comme entrée,
      > [d,si,h] = abfload('[nom du fichier d’enregistrement brut].abf')
      et enregistrez l’espace de travail en sortie avec un nom de fichier qui inclut la désignation de la larve, l’âge et la date expérimentale, tel que [numéro d’échantillon]_[âge dans dpf]_[nom du fichier d’enregistrement brut (inclut la date expérimentale par défaut)].
      Remarque : le nom de fichier converti doit uniquement inclure des entiers délimités par trait de soulignement.
2. Effectuer un prétraitement des données.
   1. Téléchargez le script Matlab AffVR_preprocess.m et les fonctions associées, écrites sur mesure par les auteurs.
   2. Dans la fenêtre Éditeur, ouvrez AffVR_preprocess.m.
   3. Sous Variables, ajustez les seuils de détection des pics de limite inférieure pour les enregistrements afférents et VR(spk_detect_lb et vr_detect_lb,lignes 8 et 14, respectivement) en fonction de l’enregistrement du rapport signal/bruit.
      Remarque : La détection de spike repose sur le seuillage manuel pour trier et isoler les signaux de plus d’un neurone afférent par amplitude. Le bruit de base et l’activité d’autres unités sont filtrés par seuillage pour n’inclure que les amplitudes de pointe à moins d’un pourcentage (p. ex., spk_detect_lb) du maximum (p. ex., spk_detect_ub). Le seuillage assure également le binning précis des pointes d’activité motrice en rafales et en combats de nage fictifs collectifs. En règle générale, commencez par une limite inférieure de seuil de 0,5 et diminuez progressivement jusqu’à ce qu’une détection précise soit obtenue. Par exemple, la définition de spk_detect_lb sur 0,5 et spk_detect_ub sur 1,0 détectera tous les pics égaux ou supérieurs à 50 % de l’amplitude maximale des pics et exclura le bruit ou les neurones supplémentaires d’amplitudes de pics inférieurs (Figure 2A). Alternativement, on pourrait également abaisser le spk_detect_ub de 1,0 pour exclure les neurones d’amplitudes de pic plus élevées afin d’isoler les neurones d’amplitudes de pic plus faibles. Les extrants des figures de prétraitement (voir l’étape 7.2.6) indiqueront s’il est nécessaire d’ajuster et de répéter l’étape 7.2.2.
   4. Dans la fenêtre de l’éditeur, cliquez sur Exécuter pour exécuter AffVR_preprocess.m.
   5. Accédez au fichier de données .mat précédemment converti (voir l’étape 7.1.3) ; sélectionnez et cliquez sur Ouvrir pour commencer le prétraitement automatisé.
      Remarque : pendant que le script personnalisé est en cours d’exécution, les sorties s’affichent dans la fenêtre commande informant sa progression à travers les étapes de traitement telles que « filtrage des données ... », « détection de l’activité racine ventrale ... », et « génération de chiffres ... ».
   6. Les chiffres générés par AffVR_preprocess.m visualiseront le pic afférent et la détection vr et indiqueront si des variables d’analyse doivent être ajustées (Figure 2).
   7. Entrez « Y » sur le clavier pour enregistrer les métadonnées prétrad traitées dans un dossier preprocess_output.
   8. Les données prétrad traitées s’afficheront automatiquement sous forme data_out.xls.
3. Analysez les données prétra traitées comme vous le souhaitez.

Résultats

Après que les larves de poisson zèbre soient correctement immobilisées et que le ganglion afférent de ligne latérale postérieure et l’enregistrement de VR soient réalisés, l’activité dans les neurones afférents et les motoneurones peut être mesurée simultanément. Les canaux d’enregistrement sont affichés à l’aide de protocoles d’enregistrement sans espace (étape 1.4) pour une surveillance continue de l’activité afférente et de la RV. En temps réel, on peut observer une diminution du taux de...

Discussion

Le protocole expérimental décrit fournit le potentiel de surveiller les changements endogènes dans l’entrée sensorielle à travers les comportements moteurs dans un vertébré intact et se comportant. Plus précisément, il détaille une approche in vivo pour effectuer des enregistrements extracellulaires simultanés de neurones afférents à la ligne latérale et de racines motrices ventrales chez les larves de poissons zèbres. L’activité afférente spontanée a été précédemment caractérisée chez le pois...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mL beaker	PYREX	1000	resceptacle for etchant
10x water immersion objective	Olympus	UMPLFLN10xW	low magnification for positioning larvae and recording electrode
40x water immersion objective	Olympus	LUMPLFLN40XW	higher magnification for position electrode tip and establishing patch-clamp
abfload.m		supplemental coding file	custom written MATLAB script for converting raw electrophysiology recordings to .mat files
AffVR_preprocess.m		supplemental coding file	custom written MATLAB script for preprocessing recording data
BNC coaxial cables	ThorLabs	2249-C-12	connecting amplifier and digitizer channels; require 4
borosilicate glass capillaries w/ filament	Warner Instruments	G150F-3	inner diameter: 0.86, outer diameter: 1.50; capillary glass used to form recording electrodes
burst_detect		supplemental coding file	custom written MATLAB function necessary to run AffVR_preprocess.m
computer	N/A	N/A	any computer should work
DC Power Supply	Tenma	72-420	used for electrically etching dissection pins
electrophysiology digitizer	Axon Instruments, Molecular Devices	Axon DigiData 1440A	enables acquisition of patch-clamp data
filament	Sutter Instrument Company	FB255B	2.5 mm box filament used in micropipette puller
fine forceps	Fine Science Tools	Dumont #5 (0.05 x 0.02 mm) Item No. 11295-10	used to manipulate larvae and insert pins
fixed stage DIC microscope	Olympus	BX51WI	microscope used to visualize and establish patch-clamp recordings
flexible, tapered pipette tip	Fisher Scientific	02-707-169	flexible tips enable insertion into recording electrode to dispense extracellular solution at the tip
FluoroDish	World Precision Instruments Inc.	FD3510-100	cover glass bottomed dish recording dish
KimWipe	KimTech	34155	task wipe used for wicking away excess fluid from larvae
Kwik-Gard	World Precision Instruments Inc.	710172	self-mixing sylgard elastomer
MATLAB	MathWorks	R2020b	command line software for preprocessing data
microelectrode amplifier	Axon Instruments, Molecular Devices	MultiClamp 700B	patch clamp amplifier for dual channel recordings
microforge	Narishige	MF-830 microforge	to polish recording electrode
micromanipulator control unit	Siskiyou	MC1000-eR/T	4-axis dial coordinator for controlling micromanipulator
micropipette puller	Sutter Instrument Company	Flaming/Brown P-97	for pulling capillary glass into recording electrodes
microscope control unit	Siskiyou	MC1000e	positions the microscope around the fixed stage and preparation
motorized micromanipulator	Siskiyou	MX7600	positions the headstage and attached recording electrode for patch-clamp recording
MultiClamp Commander	Molecular Devices	2.2.2	downloadable from Axon MultiClamp 700B Commander download page
optical air table	Newport Corporation	VH3036W-OPT	breadboard isolation table to float microscope and minimize vibrations during recordings
pCLAMP	Molecular Devices	10.7.0	downloadable from Axon pCLAMP 10 Electrophysiology Data Acquisition & Analysis Software Download page
permanent ink marker	Sharpie	order from amazon.com	for marking the leading edge side of the VR electrode to ensure proper orientation when inserting into pipette holder
petri-dish	Falcon	35-3001	used to immerse larvae in paralytic
pipette holder	Molecular Devices	1-HL-U	hold recording electrode and connect to the headstage
pneumatic transducer	Fluke Biomedical Instruments	DPM1B	for controlling recording electrode internal pressure
potassium hydroxide	Sigma-Aldrich	221473-25G	etchant for etching dissection pins
silicone tubing	Tygon	14-169-1A	tubing to connect pneumatic transducer to pipette holder
spike_detect		supplemental coding file	custom written MATLAB function necessary to run AffVR_preprocess.m
stereomicroscope	Carl Zeiss	Stemi 2000-C	used to visualize pin tips and during preparation of larvae
straight edge razor blade	Canopus	order from amazon.com	cuts the tungsten wire while making dissection pins
swimbout_detect		supplemental coding file	custom written MATLAB function necessary to run AffVR_preprocess.m
syringe	Becton Dickinson Compoany	309602	filled with extracellular solution to inject into recording electrodes
transfer pipette	Sigma-Aldrich	Z135003-500EA	single use, non-sterile pipette for transfering larvae
tricaine methanesulfonate	Syndel	12854	pharmaceutical aneasthetic used to euthanize larvae with high dosage.
tungsten wire	World Precision Instruments Inc.	715500	0.002 inch, 50.8 μm diameter; used to make dissection pins
vacuum filtration unit	Sigma-Aldrich	SCGVU11RE	single use, sterile, vacuum filtration units used to sterilize extracellular solution used for electrophysiology electrode ringer
voltage-clamp current-clamp headstage	Molecular Devices	CV-7B	supplied with MultiClamp 700B amplifier used as left and right headstages
α-bungarotoxin	ThermoFisher	B1601	for immobilizing the larvae prior to recording