Atividade da Linha Lateral Posterior Neurônios Diferentes durante a Natação em Zebrafish

Resumo

Descrevemos um protocolo para monitorar mudanças na atividade de neurônios diferentes durante comandos motores em um sistema de células ciliadas vertebrados modelo.

Resumo

Sistemas sensoriais reúnem pistas essenciais para o direcionamento do comportamento, mas os animais devem decifrar quais informações são biologicamente relevantes. A locomoção gera sinais reafemináveis de que os animais devem se desembaraçar de pistas sensoriais relevantes do ambiente circundante. Por exemplo, quando um peixe nada, o fluxo gerado a partir de ondulações corporais é detectado pelos neuromasts mecanorreceptivos, compreendendo células ciliar, que compõem o sistema de linha lateral. As células ciliares então transmitem informações de movimento fluido do sensor para o cérebro através dos neurônios sensoriais diferentes. Simultaneamente, a descarga corolária do comando motor é transmitida para as células ciliadas para evitar sobrecarga sensorial. A contabilização do efeito inibidor dos sinais motores preditivos durante a locomoção é, portanto, crítica ao avaliar a sensibilidade do sistema de linha lateral. Desenvolvemos uma abordagem eletrofisiológica in vivo para monitorar simultaneamente a linha lateral posterior aferente neurônio e atividade de raiz motor ventral em larvas de zebrafish (4-7 dias após a fertilização) que pode durar várias horas. Gravações extracelulares de neurônios aferentes são obtidas usando a técnica de grampo de remendo solto, que pode detectar atividade a partir de neurônios únicos ou múltiplos. Gravações radiculares ventrais são realizadas através da pele com eletrodos de vidro para detectar a atividade do neurônio motor. Nosso protocolo experimental fornece o potencial para monitorar mudanças endógenas ou evocadas na entrada sensorial através de comportamentos motores em um vertebrado intacto e comportado.

Introdução

Diferentes neurônios de sistemas de mecanosensoria transmitem informações das células ciliares para o cérebro durante a audição e equilíbrio. A eletrofisiologia pode revelar a sensibilidade de neurônios diferentes através de gravações diretas. Embora a remenda celular inteira das células ciliares possa ser desafiadora, o registro a partir de neurônios a montante é mais fácil e permite a avaliação dos potenciais de ação em resposta às estimulações controladas^1,2,3. Estimular as células ciliadas leva à sua deflexão, o que modifica estruturas mecanosensoriais, desencadeando assim um aumento nos potenciais de ação (picos) em neurônios diferentes^4,5,6. Na ausência de estímulos externos, os neurônios aferentes também aumentam espontaneamente devido ao vazamento de glutamato das células ciliadas nos diferentes terminais pós-sinápticos^7,8, e têm se mostrado contribuintes para a manutenção da sensibilidade^9,10. O registro do grampo de correção da atividade aferente permite a observação da sensibilidade das células ciliares e da dinâmica do sinal que não são possíveis utilizando técnicas com menor resolução temporal, como na microfônica^11,12 ou imagem funcional de cálcio^13,14,15. O protocolo a seguir permitirá o registro de atividades diferentes concomitantemente com comandos motores para revelar alterações instantâneas na sensibilidade das células ciliares.

Os zebrafish (Danio rerio) utilizam células ciliares contidas em neuromasses que compõem o sistema de linha lateral para detectar o movimento da água em relação ao seu corpo, o que é traduzido em sinais neurais essenciais para a navegação^16,17,18, prevenção de predadores, captura de presas^19,20, e escolaridade²¹. O fluxo de água também pode ser autogerado pelos movimentos da natação^22,23,24, respiração^22,25,26e alimentação²⁷. Esses comportamentos compreendem movimentos repetitivos que podem fadigar as células ciliares e prejudicar a detecção. Portanto, é fundamental que o sistema de linha lateral diferencie entre estímulos de fluxo externos (exafentes) e autogerado (reafeto). Uma descarga corolária atenua sinais de fluxo autogerados durante a locomoção em zebrafish. Este sinal motor preditivo inibidor é retransmitido através de neurônios descendentes para os receptores sensoriais para modificar a entrada ou interromper o processamento do feedback reafesso^28,29. O trabalho seminal que contribuiu para a nossa compreensão inicial deste sistema de alimentação contou com preparações in vitro onde a conectividade e a atividade endógena do circuito neural não foram mantidas^{28,30,31,32,33,34,35}. Este protocolo descreve uma abordagem para preservar um circuito neural intacto onde a dinâmica de feedback endógeno é mantida, permitindo assim uma melhor compreensão da descarga corolária in vivo.

O protocolo aqui descrito descreve como monitorar a linha lateral posterior a atividade de neurônios e neurônios motores simultaneamente em zebrafish larval. Caracterizar uma dinâmica de sinal diferente antes, durante e depois dos comandos motores, fornece insights sobre o feedback endógeno em tempo real do sistema nervoso central que modula a sensibilidade das células ciliares durante a locomoção. Este protocolo descreve quais materiais precisarão ser preparados antes dos experimentos e, em seguida, descreve como paralisar e preparar larvas de zebrafish. O protocolo descreverá como estabelecer uma gravação de remendo solto estável de neurônios aferentes e gravações de raiz ventral extracelular (VR) de neurônios motores. Os dados representativos que podem ser obtidos por meio deste protocolo são apresentados a partir de um indivíduo exemplar e a análise foi realizada em múltiplas réplicas do protocolo experimental. O pré-processamento de dados é realizado usando scripts escritos personalizados no MATLAB. No geral, esse paradigma experimental in vivo está pronto para proporcionar uma melhor compreensão do feedback sensorial durante a locomoção em um modelo de sistema de células ciliadas vertebradas.

Protocolo

Todos os cuidados e experimentos com animais foram realizados de acordo com protocolos aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade da Flórida.

1. Preparação de materiais para gravações eletrofisiológicas

1. Faça um prato de gravação com fundo de elastômero de silicone.
   1. Distribua uma fina camada de componentes de elastômero de silicone auto-misturados (por exemplo, Sylgard) em um prato de cultura de tecido com fundo de vidro até que ele se níveis com a borda do poço raso. Aproximadamente 0,5 mL é suficiente.
   2. Cubra e cure o prato por um mínimo de 48 h em temperatura ambiente.
2. Faça alfinetes de dissecção.
   1. Forneça uma carga negativa (5 V) a um béquer de 100 mL de etchant (3M KOH) usando uma fonte de alimentação DC e conecte um fio de tungstênio (0,002 polegadas; 50,8 μm de diâmetro) à saída carregada positivamente.
      ATENÇÃO: Os fios negativos e positivos não devem entrar em contato entre si durante este procedimento, pois você pode correr o risco de produzir faíscas, o que pode representar um potencial risco de incêndio.
   2. Etch tungstênio fio por rápida e repetidamente mergulhando a ponta do fio no banho etchant até que a ponta se estreita para um ponto afiado. Sob um estereótipo, corte o fio aproximadamente 1 mm da ponta com uma lâmina de barbear de borda reta. Repita mais três vezes e, em seguida, insira pinos no prato de gravação curado usando fórceps finos.
3. Prepare eletrodos de gravação.
   1. Puxe um tubo capilar de vidro borossilicacate (diâmetro interno: 0,86 mm, diâmetro externo: 1,50 mm) utilizando um puxador de micropipette horizontal com filamento de caixa em eletrodos com uma ponta de diâmetro de 30 μm com ligeira fita(Figura 1 Ai) que será usada para registrar neurônios diferentes da linha lateral posterior.
   2. Puxe um tubo capilar de vidro borossilicato adicional em um par de eletrodos com diâmetros de ponta menores (1-5 μm). Segurando um eletrodo em cada mão, execute delicadamente as pontas umas sobre as outras para quebrá-las em um ângulo de ~30°. Com um microforge, polir a ponta chanfrada até ficar homogêneo. O diâmetro da ponta final deve ser entre 30-50 μm e será usado como eletrodo de gravação da raiz ventral (VR)(Figura 1 Aii).
   3. Marque o lado do eletrodo VR com a borda superior com tinta permanente para ajudar a orientar a abertura da ponta para baixo ao inserir o eletrodo no suporte da pipeta do headstage (passo 3.2).
      NOTA: A modificação mecânica do eletrodo de gravação vr é imprecisa e a etapa 1.3.2 pode exigir múltiplas tentativas até que uma morfologia de ponta adequada seja alcançada antes do polimento. O eletrodo de gravação vr é chanfrado para se adequar à curva corporal das larvas. Uma vez fabricado, o eletrodo de gravação VR pode ser usado repetidamente, desde que a ponta permaneça clara e limpa entre os experimentos.
4. Gere o protocolo em programas de gravação de eletrofisiologia.
   1. Certifique-se de que o headstage direito esteja conectado à entrada do Canal 1 na parte de trás da corrente de microeletrodo e do amplificador de tensão para as gravações de neurônios aferentes e o headstage esquerdo está conectado à entrada do Canal 2 para as gravações vr.
      NOTA: As especificações do computador para o amplificador de grampo de corrente e tensão requerem minimamente 1 Ghz ou um processador melhor, Windows XP Pro ou Mac OS X 10.46.6, unidade CD-ROM com 512 MB de RAM, espaço de disco rígido de 500 MB e 2 portas USB.
   2. Abra o software do amplificador controlado pelo computador.
   3. Defina o Canal 1 e o Canal 2 para o modo de fixação atual clicando no botão IC para cada canal.
   4. Insira os seguintes parâmetros nas guias I-Clamp 1 e I-Clamp 2 . Saída Primária: 100x Potencial de membrana CA (100.000 mV/mV), Ganho: 1.000, Bessel: 1 kHz , AC: 300 Hz , Escopo: Bypass . Saída secundária: 100x Potencial de membrana AC (100 mV/mV) , Ganho: 1 , Filtro Lowpass: 10 Hz.
   5. Salve parâmetros de canal como Ch1_Aff e Ch2_VR.
   6. Instale e abra o software de eletrofisiologia do grampo de remendo.
   7. Clique em Configurar e selecione Lab Bench para configurar os sinais analógicos adicionando Ch1_Aff e Ch2_Vr aos canais digitador (por exemplo, analogia in #0 e #1 Analógico IN) que estão conectados, por cabo coaxial BNC, às saídas dimensionadas correspondentes do Canal 1 e do Canal 2 do amplificador. Clique em OK.
      NOTA: Os requisitos mínimos do computador para o digitalizador são: um processador de 1 Ghz ou melhor, Windows XP Pro ou Mac OS X 10.46.6, unidade CD-ROM de 512 MB de RAM, espaço de disco rígido de 500 MB e 2 portas USB.
   8. Clique em Adquirir e selecione Novo Protocolo.
   9. Na guia Modo/Taxa, selecione Gap Free; em Modo de Aquisição, defina o Comprimento de Ensaio para usar o espaço disponível em disco (ou seja, gravar até parar) ou um conjunto desejado Duração (hh:mm:ss),e, em seguida, definir a taxa de amostragem por sinal (Hz) para 20.000 para maximizar a resolução.
   10. Na guia Entradas, selecione os canais Analógicos IN configurados anteriormente (na etapa 1.4.6) e selecione Ch1_Aff e Ch2_VR para o canal correspondente.
   11. Na guia Saídas, selecione Cmd 0 e Cmd 1 para #0 de Canal e #1 do Canal,respectivamente.
       1. Conecte o comando do Canal 1 no amplificador ao Analógico Ouput 0 no digitalizador via cabo coaxial BNC e repita para o Comando do Canal 2 para a Saída Analógica 1.
   12. As guias restantes podem permanecer em configurações padrão. Clique em OK e salve o protocolo.

2. Preparação da solução

1. Prepare a solução de Hank: 137 mM NaCL, 5,4 mM KCl, 0,25 mM Na₂HPO₄, 0,44 mM KH₂PO₄, 1,3 mM CaCl₂, 1,0 mM MgSO₄, 4,2 mM NaHCO₄; pH 7.3. Diluir para 10% a solução de Hank adicionando o volume apropriado de água deionizada ao estoque.
2. Prepare a solução extracelular: 134 mM NaCl, 2,9 mM KCl, 1,2 mM MgCl₂, 2,1 mM CaCl_2,10 mM de glicose, 10 mM tampão HEPES; pH 7.8 ajustado com NaOH. Solução extracelular do filtro de vácuo através do filtro com tamanho de poro de 0,22 μm.
3. Prepare α -bungarotoxina: Dissolva 1 mg de α-bungarotoxina liofilizada em solução extracelular de 10 mL para produzir diluição de 0,1%.
4. Prepare a solução de eutanásia: 50% (mg/L) de grau farmacêutico tamponado MS-222 em 10% da solução de Hank.
   ATENÇÃO: α-bungarotoxina é uma neurotoxina potente que paralisa os músculos bloqueando receptores colinérgicos. Luvas são necessárias e a proteção ocular é recomendada durante o manuseio do paralítico.

3. Preparação de larvas para gravações eletrofisiológicas

1. Imobilize larvas de zebrafish.
   1. Use larvas da população de zebrafish(Danio rerio; 4-7 dias após a fertilização) e casa em solução de embrião (solução de 10% Hank) a 27 °C.
   2. Transfira larvas da carcaça para uma pequena placa de Petri (35 mm) usando uma pipeta de transferência de ponta grande e remova o máximo possível da solução circundante.
      NOTA: A remoção da solução embrionária previne a diluição do paralítico e aumenta sua eficácia. O canto de uma limpeza de tarefas pode ser usado para afastar a solução restante do embrião, e é fundamental não entrar em contato com as larvas ou deixar larvas expostas ao ar.
   3. Mergulhe larvas em 10 μL de 0,1% α-bungarotoxina por aproximadamente 5 min.
      NOTA: O tempo necessário para imobilizar larvas varia entre as preparações. Uma preparação saudável depende do monitoramento de perto do fluxo sanguíneo rápido sustentado e da diminuição das respostas motoras. Uma breve superexposição ao paralítico pode levar a um declínio lento na saúde geral da preparação, mesmo após uma lavagem completa. É melhor aplicar uma lavagem antes que a larva seja completamente imobilizada enquanto ainda mostra sinais de vibrações musculares sutis.
   4. Lave a larva paralisada com solução extracelular e tome banho por 10 minutos.
      NOTA: A lavagem permite que a larva transite de vibrações musculares sutis para paralisia completa. Além disso, α-bungarotoxina é um antagonista do receptor de acetilcolina nicotínica (nAChR) α9-subunit, que é um componente crítico do circuito de feedback endógeno que este protocolo observa; no entanto, esse efeito tem se mostrado reversível nas células ciliar xenopus e zebrafish após uma lavagem de 10 minutos^36,29.
2. Pino peixe no prato de gravação.
   NOTA: A anestesia (por exemplo, MS-222, Tricaine) não é necessária durante o preparo de zebrafish larval (4-7 dpf) pois interfere na saúde animal. Na verdade, os zebrafish larval estão isentos de certos protocolos vertebrados.
   1. Usando pipeta de transferência, mova a larva do banho de solução extracelular para o prato de gravação com fundo de silicone. Encha o restante do prato com solução extracelular.
   2. Sob um estereótipo, posicione suavemente as larvas com fórceps finos acima do centro do tapete de silicone, lateral para cima, com as extremidades anterior e posterior do corpo correndo da esquerda para a direita, respectivamente. Em seguida, segure um pino gravado do tapete de silicone usando fórceps finos e insira o pino, ortogonalmente ao silicone, através do notochord dorsal das larvas diretamente dorsal para o ânus. Insira o segundo pino através do notochord perto da extremidade da cauda e insira o terceiro pino através do notochord dorsal da bexiga gasosa(Figura 1B).
      NOTA: Ao inserir pinos, é importante atingir o centro da largura notochord para evitar o fluxo sanguíneo ou danificar a musculatura circundante. O notochord é dorsal para o nervo da linha lateral posterior, por isso, com a fixação adequada, não se espera danos aos neurônios sensoriais da linha lateral. Insira após o primeiro contato para não perturbar o tecido circundante. Idealmente, o diâmetro do pino é menos da metade da largura do notochord para garantir a inserção limpa. Se os pinos excederem essa largura, repita o passo 1.2 até que a largura do pino desejada seja atingida. Se o fluxo sanguíneo diminuir após a fixação, repita a partir do passo 1.3 em diante com um novo espécime.
   3. Insira o quarto pino através da vesícula otica, proporcionando uma leve rotação em direção ao anterior à medida que o pino se insere no encapsulante(Figura 1B). À medida que uma leve rotação é aplicada, observe o tecido entre o cleithrum e o vesícula otic para revelar o aglomerado de somata aferente.
      NOTA: A inserção em ângulo do quarto pino é para garantir a exposição da linha lateral posterior um gânglio diferente, que é obstruído pela grande vesícula otica.

4. Gravação de raiz ventral

1. Coloque a larva presa sob o objetivo de imersão de água de 10x em um microscópio de interferência diferencial de palco fixo (DIC) e oriente as fissuras myseptal dos blocos musculares paralelamente ao vetor de aproximação da cabeça esquerda(Figura 1B).
   1. Um microscópio DIC de estágio fixo flutuado em uma mesa de ar óptica funciona melhor para evitar que vibrações interfiram com as gravações. Usando um posicionador motorizado, o microscópio pode então mover-se livremente ao redor do estágio fixo no qual a preparação e os headstages são montados(Figura 1C).
   2. Coloque o fio moído na solução do banho e certifique-se de que ele esteja conectado ao palco esquerdo.
2. Encha o eletrodo de gravação VR com 30 μL de solução extracelular usando uma ponta flexível de pipeta de carregamento de gel e insira no suporte de pipeta da cabeça esquerda.
3. Abaixe a pipeta de gravação na solução de prato com um micromanipulador enquanto aplica pressão positiva (1-2 mmHg) produzida por um transdutor pneumático. Sob ampliação de 10x, confirme se a orientação da abertura da ponta está voltada para baixo.
   1. O transdutor pneumático deve ser conectado à porta do porta-tubulação por tubulação de silicone.
4. Coloque o eletrodo VR no myoseptum
   1. Usando o micromanipulador novamente, abaixe a ponta do eletrodo VR até que esteja mantendo a posição acima da larva. Aumente a ampliação para imersão de 40x.
   2. Leve a ponta do eletrodo sobre um myoseptum entre dois myomeres ventral para a linha lateral até que a fissura esteja centrada na abertura da ponta do eletrodo VR(Figura 1D).
   3. Abaixe a pipeta até que a borda defasada da abertura da ponta entre em contato suavemente com o epitélio. Após o contato inicial, manobre a pipeta na diagonal para garantir que a borda principal faça contato e possa gerar uma vedação.
   4. Aplique pressão negativa (~100 mm Hg) com o transdutor pneumático e segure.
      NOTA: A orientação adequada da pipeta VR em relação ao mioseptum e à pressão negativa contínua otimiza a detecção da atividade do neurônio motor com uma alta relação sinal-ruído através da pele.
5. Detecte a atividade do neurônio motor.
   1. O headstage esquerdo deve ser conectado ao amplificador, que retransmite o sinal amplificado em um digitalizador que produz o referido sinal para o software de eletrofisiologia do grampo de remendo a ser monitorado em um computador adjacente (ver seção 1.4).
   2. No software de grampo de correção, clique no botão Reproduzir na barra de ferramentas para monitorar o sinal VR (Figura 1E).
   3. Certifique-se de que a gravação vr está sendo alcançada uma vez que a atividade do neurônio motor com dinâmica bem estereotipado do sinal de explosão é observada^29,37 (Figura 1E).
      NOTA: As crises de natação fictícias são os padrões de atividade dos neurônios motores VR que continuam a transmitir apesar da preparação estar paralisada. Portanto, os natações fictícias são um meio acessível de determinar o estado comportamental do animal e medir parâmetros locomotores ao mesmo tempo em que realizam gravações de neurônios diferentes que requerem uma preparação imobilizada. Em nossas mãos, uma vez que uma gravação vr é alcançada, uma preparação saudável provocará lutas voluntárias de natação fictícia a cada poucos segundos. Lembre-se, uma preparação saudável tem sustentado o fluxo sanguíneo rápido. Esteja avisado, a obtenção de um sinal VR suficiente pode levar vários minutos e a relação sinal-ruído pode melhorar após a detecção inicial. No interesse do tempo, é aceitável passar para a seção 5.
   4. Se uma gravação vr ainda não for alcançada após completar a seção 5, solte a pressão negativa, levante o eletrodo e repita a partir da etapa 4.4.2 em diante em um myoseptum diferente se a saúde da larva ainda estiver ótima.

5. Gravação de neurônios diferentes

1. Encha o eletrodo de gravação aferente com 30 μL de solução extracelular; inserir no suporte de pipeta do palco direito(Figura 1B,C), e inferior à solução de prato, aplicando pressão positiva (1-2 mm Hg) produzida por um transdutor pneumático.
2. Localizar e fixar-se vagamente à linha lateral posterior um gânglio diferente.
   1. Usando um micromanipulador, abaixe a ponta de eletrodo diferente até que esteja mantendo posição acima do cleithrum.
   2. Aumente a ampliação para imersão de 40x e localize a intersecção do nervo da linha lateral posterior e cleithrum. Siga o nervo da linha lateral anterior do cleithrum até onde as fibras inervam a linha lateral posterior afferent gânglio, distinguido pelo discreto aglomerado de soma(Figura 1F).
   3. Leve a ponta do eletrodo sobre o gânglio aferente e baixe a pipeta até que a ponta entre em contato com o epitélio. Suavemente, manobre o eletrodo para que toda a circunferência da ponta entre em contato com o gânglio aferente.
   4. Aplique pressão negativa (20-50 mm Hg) com o transdutor pneumático e segure.
      NOTA: A pressão negativa aplicada ao gânglio aferente é mais suave do que a sucção aplicada durante a gravação da raiz ventral. O aumento da pressão negativa pode melhorar o sinal-ruído, mas a saúde dos neurônios diminui sob sucção agressiva sustentada, o que diminui a probabilidade de um registro bem-sucedido.
3. Registrar uma atividade de neurônio diferente.
   1. Certifique-se de que o headstage direito esteja conectado em uma sequência semelhante à descrita na etapa 4.5.1.
   2. Em pClamp10, clique no botão Reproduzir na barra de ferramentas para monitorar neurônios e sinais VR diferentes simultaneamente.
   3. Certifique-se de que toda a célula, a gravação de remendos soltos de neurônios diferentes é alcançada uma vez que os picos ocorrem espontaneamente, aproximadamente a cada 100-200 ms^1,29 (Figura 1E).
   4. Gradualmente, aumente a pressão de eletrodo de gravação de neurônios aferentes de volta para atmosférico (0 mm Hg) e segure para o restante da gravação.

6. Aquisição de dados

1. Gravação simultânea.
   1. Uma vez detectada a atividade de neurônios e neurônios motores, clique no botão Gravar na barra de ferramentas em pClamp10 para capturar gravações simultâneas livres de lacunas em ambos os canais.
   2. Registro para a duração desejada(Figura 1E).
      NOTA: Uma gravação em uma preparação saudável pode durar muitas horas e permanecer respondendo a estímulos externos.
   3. Salve a gravação como um tipo de arquivo suportado (.abf, pClamp10) para preservar metadados, como parâmetros de aquisição.

7. Eutanásia

1. Aplique pressão positiva (10 mm Hg) tanto para os eletrodos de gravação aferentes quanto vr usando transdutores pneumáticos e levante os eletrodos da placa de gravação usando os micromanipuladores.
2. Transfira o prato de gravação do microscópio DIC de estágio fixo para o estereóscópio de dissecção.
3. Usando fórceps finos, remova os pinos de tungstênio da cápsula notochord e otic, e transfira as larvas usando uma pipeta de transferência para uma placa de Petri (35 mm) contendo 5 mL de solução de eutanásia por um mínimo de 5 min.

8. Pré-processamento e análise de dados

NOTA: O pré-processamento e a análise de dados exigirão uma compreensão básica da codificação da linha de comando.

1. Converta o arquivo de gravação para pré-processamento.
   1. Instale o software Matlab.
   2. Baixe o script escrito personalizado, abfload.m³⁸ e salve o arquivo na mesma pasta que armazena o arquivo de gravação bruto.
   3. Na janela Do Editor do Matlab, abra abfload.m e clique em Executar na barra de ferramentas. Selecione A pasta de alteração, se solicitado.
   4. Execute a função na janela de comando com o arquivo de gravação bruto como a entrada,
      > [d,si,h] = abfload('[nome do arquivo de gravação bruto].abf')
      e salvar o espaço de trabalho de saída com um nome de arquivo que inclui designação de larva, idade e data experimental, como [número de amostra]_[idade em dpf]_[nome do arquivo de gravação bruta (inclui data experimental por padrão)].
      NOTA: O nome do arquivo convertido deve incluir apenas inteiros delineados.
2. Realize o pré-processamento de dados.
   1. Baixe o script matlab AffVR_preprocess.m e funções associadas, escritas sob medida pelos autores.
   2. Na janela do editor, abra AffVR_preprocess.m.
   3. Em Variáveis,ajuste limiares de detecção de picos de borda inferior para gravações aferentes e vr(spk_detect_lb e vr_detect_lb, linhas 8 e 14, respectivamente) dependendo da gravação da relação sinal-ruído.
      NOTA: A detecção de picos depende de limiares manuais para classificar e isolar sinais de mais de um neurônio aferente por amplitude. O ruído e a atividade da linha de base de outras unidades são filtrados por limiares para incluir apenas amplitudes de pico dentro de uma porcentagem (por exemplo, spk_detect_lb) do máximo (por exemplo, spk_detect_ub). O limiar também garante o binning preciso dos picos de atividade motora em rajadas e lutas coletivas de natação fictícia. Geralmente, comece com um limite inferior de 0,5, e diminua gradualmente até que a detecção precisa seja alcançada. Por exemplo, a fixação spk_detect_lb como 0,5 e spk_detect_ub como 1.0 detectará todos os picos iguais ou superiores a 50% da amplitude de pico máximo e excluirá ruídos ou neurônios adicionais de amplitudes de picos mais baixos(Figura 2A). Alternativamente, também pode-se reduzir o spk_detect_ub de 1,0 para excluir neurônios de amplitudes de pico mais altas, a fim de isolar os neurônios de amplitudes de pico mais baixas. As saídas de números de pré-processamento (ver etapa 7.2.6) informarão se ajustes e repetições da etapa 7.2.2 são necessários.
   4. Na janela Editor, clique em Executar para executar AffVR_preprocess.m.
   5. Navegue até o arquivo de dados .mat convertido anteriormente (ver etapa 7.1.3); selecionar e clicar em Abrir para iniciar o pré-processamento automatizado.
      NOTA: Enquanto o script personalizado estiver sendo executado, as saídas aparecerão na janela de comando informando seu progresso através de etapas de processamento como "filtragem de dados...", "detectando atividade raiz ventral..." e "gerar figuras...".
   6. Os números gerados pelo AffVR_preprocess.m visualizarão a detecção de picos e VR diferentes e indicarão se quaisquer variáveis de análise devem ser ajustadas(Figura 2).
   7. Digite "Y" no teclado para salvar metadados pré-processados em uma pasta preprocess_output.
   8. Os dados pré-processados serão automaticamente produzidos à medida que data_out.xls.
3. Analise os dados pré-processados conforme desejado.

Resultados

Depois que as larvas de zebrafish são devidamente imobilizadas e a linha lateral posterior é alcançada, a atividade em neurônios aferentes e motores pode ser medida simultaneamente. Os canais de gravação são exibidos usando protocolos de gravação livres de lacunas (etapa 1.4) para monitoramento contínuo de atividades aferentes e vr. Em tempo real, podem ser observadas reduções na taxa de pico espontâneo efervescente, concomitantemente com atividade vr indicativa de natação fictícia(Fi...

Discussão

O protocolo experimental descrito fornece o potencial para monitorar mudanças endógenas na entrada sensorial através de comportamentos motores em um vertebrado intacto e comportado. Especificamente, ele detalha uma abordagem in vivo para realizar gravações extracelulares simultâneas de neurônios de linha lateral e raízes motoras ventrais em zebrafish larval. A atividade aferente espontânea tem sido previamente caracterizada em zebrafish sem considerar a potencial atividade motor simultânea¹

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mL beaker	PYREX	1000	resceptacle for etchant
10x water immersion objective	Olympus	UMPLFLN10xW	low magnification for positioning larvae and recording electrode
40x water immersion objective	Olympus	LUMPLFLN40XW	higher magnification for position electrode tip and establishing patch-clamp
abfload.m		supplemental coding file	custom written MATLAB script for converting raw electrophysiology recordings to .mat files
AffVR_preprocess.m		supplemental coding file	custom written MATLAB script for preprocessing recording data
BNC coaxial cables	ThorLabs	2249-C-12	connecting amplifier and digitizer channels; require 4
borosilicate glass capillaries w/ filament	Warner Instruments	G150F-3	inner diameter: 0.86, outer diameter: 1.50; capillary glass used to form recording electrodes
burst_detect		supplemental coding file	custom written MATLAB function necessary to run AffVR_preprocess.m
computer	N/A	N/A	any computer should work
DC Power Supply	Tenma	72-420	used for electrically etching dissection pins
electrophysiology digitizer	Axon Instruments, Molecular Devices	Axon DigiData 1440A	enables acquisition of patch-clamp data
filament	Sutter Instrument Company	FB255B	2.5 mm box filament used in micropipette puller
fine forceps	Fine Science Tools	Dumont #5 (0.05 x 0.02 mm) Item No. 11295-10	used to manipulate larvae and insert pins
fixed stage DIC microscope	Olympus	BX51WI	microscope used to visualize and establish patch-clamp recordings
flexible, tapered pipette tip	Fisher Scientific	02-707-169	flexible tips enable insertion into recording electrode to dispense extracellular solution at the tip
FluoroDish	World Precision Instruments Inc.	FD3510-100	cover glass bottomed dish recording dish
KimWipe	KimTech	34155	task wipe used for wicking away excess fluid from larvae
Kwik-Gard	World Precision Instruments Inc.	710172	self-mixing sylgard elastomer
MATLAB	MathWorks	R2020b	command line software for preprocessing data
microelectrode amplifier	Axon Instruments, Molecular Devices	MultiClamp 700B	patch clamp amplifier for dual channel recordings
microforge	Narishige	MF-830 microforge	to polish recording electrode
micromanipulator control unit	Siskiyou	MC1000-eR/T	4-axis dial coordinator for controlling micromanipulator
micropipette puller	Sutter Instrument Company	Flaming/Brown P-97	for pulling capillary glass into recording electrodes
microscope control unit	Siskiyou	MC1000e	positions the microscope around the fixed stage and preparation
motorized micromanipulator	Siskiyou	MX7600	positions the headstage and attached recording electrode for patch-clamp recording
MultiClamp Commander	Molecular Devices	2.2.2	downloadable from Axon MultiClamp 700B Commander download page
optical air table	Newport Corporation	VH3036W-OPT	breadboard isolation table to float microscope and minimize vibrations during recordings
pCLAMP	Molecular Devices	10.7.0	downloadable from Axon pCLAMP 10 Electrophysiology Data Acquisition & Analysis Software Download page
permanent ink marker	Sharpie	order from amazon.com	for marking the leading edge side of the VR electrode to ensure proper orientation when inserting into pipette holder
petri-dish	Falcon	35-3001	used to immerse larvae in paralytic
pipette holder	Molecular Devices	1-HL-U	hold recording electrode and connect to the headstage
pneumatic transducer	Fluke Biomedical Instruments	DPM1B	for controlling recording electrode internal pressure
potassium hydroxide	Sigma-Aldrich	221473-25G	etchant for etching dissection pins
silicone tubing	Tygon	14-169-1A	tubing to connect pneumatic transducer to pipette holder
spike_detect		supplemental coding file	custom written MATLAB function necessary to run AffVR_preprocess.m
stereomicroscope	Carl Zeiss	Stemi 2000-C	used to visualize pin tips and during preparation of larvae
straight edge razor blade	Canopus	order from amazon.com	cuts the tungsten wire while making dissection pins
swimbout_detect		supplemental coding file	custom written MATLAB function necessary to run AffVR_preprocess.m
syringe	Becton Dickinson Compoany	309602	filled with extracellular solution to inject into recording electrodes
transfer pipette	Sigma-Aldrich	Z135003-500EA	single use, non-sterile pipette for transfering larvae
tricaine methanesulfonate	Syndel	12854	pharmaceutical aneasthetic used to euthanize larvae with high dosage.
tungsten wire	World Precision Instruments Inc.	715500	0.002 inch, 50.8 μm diameter; used to make dissection pins
vacuum filtration unit	Sigma-Aldrich	SCGVU11RE	single use, sterile, vacuum filtration units used to sterilize extracellular solution used for electrophysiology electrode ringer
voltage-clamp current-clamp headstage	Molecular Devices	CV-7B	supplied with MultiClamp 700B amplifier used as left and right headstages
α-bungarotoxin	ThermoFisher	B1601	for immobilizing the larvae prior to recording