АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Описан протокол мониторинга изменений активности афферентных нейронов во время двигательных команд в модельной системе волосковых клеток позвоночных.

Аннотация

Сенсорные системы собирают сигналы, необходимые для направления поведения, но животные должны расшифровать, какая информация является биологически значимой. Локомоция генерирует повторяющиеся сигналы, которые животные должны отпутать от соответствующих сенсорных сигналов окружающей среды. Например, когда рыба плавает, поток, генерируемый волнами тела, обнаруживается механорецептивными невриномачами, состоящими из волосковых клеток, которые составляют систему боковой линии. Затем волосковые клетки передают информацию о движении жидкости от датчика к мозгу через сенсорные афферентные нейроны. Одновременно, сопутствующий разряд двигательной команды передается волосковые клетки для предотвращения сенсорной перегрузки. Поэтому учет ингибирующего эффекта прогностических двигательных сигналов во время локомоции имеет решающее значение при оценке чувствительности системы боковых линий. Мы разработали электрофизиологический подход in vivo для одновременного мониторинга активности афферентного нейрона задней боковой линии и вентрального двигательного корня у личинок рыбок данио (4-7 дней после оплодотворения), которая может длиться в течение нескольких часов. Внеклеточные записи афферентных нейронов достигаются с использованием техники свободного зажима пластыря, которая может обнаруживать активность от одного или нескольких нейронов. Записи вентральных корней выполняются через кожу со стеклянными электродами для обнаружения активности двигательных нейронов. Наш экспериментальный протокол обеспечивает возможность мониторинга эндогенных или вызванных изменений сенсорного ввода в двигательном поведении у неповрежденного позвоночного.

Введение

Афферентные нейроны механосенсорных систем передают информацию от волосковых клеток к мозгу во время слуха и равновесия. Электрофизиология может выявить чувствительность афферентных нейронов через прямые записи. В то время как патчинг целых клеток из волосковых клеток может быть сложным, запись из нисходящих афферентных нейронов проще и позволяет оценить потенциалы действия в ответ на контролируемые стимуляции1,2,3. Стимуляция волосковых клеток приводит к их отклонению, что модифицирует механосенсорные структуры, тем самым запуская увеличение потенциалов действия (шипов) в афферентных нейронах4,5,6. В отсутствие внешних стимулов афферентные нейроны также спонтанно скачут из-за утечки глутамата из волосковых клеток на афферентные постсинаптические терминали7,8и, как было показано, способствуют поддержанию чувствительности9,10. Запись афферентной активности за патч-зажимом позволяет наблюдать чувствительность волосковых клеток и динамику сигнала, которые невозможны с использованием методов с более низким временным разрешением, таких как в микрофонике11,12 или функциональной кальциевой визуализации13,14,15. Следующий протокол позволит регистрировать афферентную активность одновременно с двигательными командами, чтобы выявить мгновенные изменения чувствительности волосковых клеток.

Рыбки данио (Danio rerio) используют волосковые клетки, содержащиеся в нейромаматах, которые составляют систему боковой линии, для обнаружения движения воды относительно их тела, что переводится в нейронные сигналы, необходимые для навигации16,17,18,избегания хищников, захвата добычи19,20и стайки21. Поток воды также может быть самогенерируемым движениями плавания22,23,24,дыхания22,25,26и кормления27. Это поведение включает в себя повторяющиеся движения, которые могут утомлять волосковые клетки и ухудшать восприятие. Поэтому крайне важно, чтобы система боковых линий различала внешние (экзафферентные) и самогенерируемые (рефафферентные) стимулы потока. Вытекающий из этого разряд ожижает самогенерируемые сигналы потока во время передвижения у рыбок данио. Этот тормозной прогностический двигательный сигнал передается через нисходящие нейроны к сенсорным рецепторам для изменения входного сигнала или прерывания обработки обратной обратной связи28,29. Основополагающая работа, способствовающая нашему раннему пониманию этой системы, опиралась на препараты in vitro, где связь и эндогенная активность нейронной цепи не поддерживались28,30,31,32,33,34,35. Этот протокол описывает подход к сохранению неповрежденной нейронной цепи, где поддерживается динамика эндогенной обратной связи, что позволяет лучше понять сопутствующий разряд in vivo.

Протокол, описанный здесь, описывает, как контролировать активность афферентных нейронов задней боковой линии и двигательных нейронов одновременно у личинок рыбок данио. Характеристика динамики афферентного сигнала до, во время и после двигательных команд дает представление о эндогенной обратной связи центральной нервной системы в режиме реального времени, которая модулирует чувствительность волосковых клеток во время передвижения. В этом протоколе описывается, какие материалы необходимо будет подготовить до экспериментов, а затем описывается, как парализовать и подготовить личинок рыбок данио. Протокол будет описывать, как установить стабильную запись свободных пятен афферентных нейронов и внеклеточных вентральных корневых (VR) записей двигательных нейронов. Репрезентативные данные, которые могут быть получены с помощью этого протокола, представлены образцовым индивидуумом и анализ проводился на нескольких репликах экспериментального протокола. Предварительная обработка данных выполняется с использованием пользовательских письменных скриптов в MATLAB. В целом, эта экспериментальная парадигма in vivo готова обеспечить лучшее понимание сенсорной обратной связи во время передвижения в модельной системе волосковых клеток позвоночных.

протокол

Все исследования по уходу за животными и эксперименты проводились в соответствии с протоколами, утвержденными Комитетом по уходу и использованию животных Университета Флориды.

1. Подготовка материалов для электрофизиологических записей

  1. Сделайте силиконовую эластомерную записывающее блюдо.
    1. Разрежьте тонкий слой самосмешивающихся компонентов силиконового эластомера (например, Sylgard) в чашку для культивирования тканей со стеклянным дном до тех пор, пока она не выровняется с ободком неглубокого колодца. Достаточно примерно 0,5 мл.
    2. Накройте крышкой и отверждайте блюдо минимум 48 ч при комнатной температуре.
  2. Сделайте рассечение булавок.
    1. Обеспечьте отрицательный заряд (5 В) к 100 мл травильного травильного крема (3 М КОН) с помощью источника питания постоянного тока и подключите вольфрамовый провод (0,002 дюйма; диаметр 50,8 мкм) к положительно заряженному выходу.
      ВНИМАНИЕ: Отрицательные и положительные провода не должны контактировать друг с другом во время этой процедуры, так как вы можете столкнуться с риском образования искр, которые могут представлять потенциальную опасность пожара.
    2. Травить вольфрамовую проволоку, быстро и многократно погружая наконечник проволоки в травильные ванны до тех пор, пока наконечник не сузится до острой точки. Под стереомикроскопом отрежьте проволоку примерно в 1 мм от наконечника лезвием бритвы с прямым краем. Повторите еще три раза, а затем вставьте штифты в отвержденную записывающее блюдо с помощью тонких щипцов.
  3. Подготовьте записывающие электроды.
    1. Вытяните боросиликатную стеклянную капиллярную трубку (внутренний диаметр: 0,86 мм, наружный диаметр: 1,50 мм) с помощью горизонтального съемника микропипетки с коробчатой нитью на электроды с наконечником диаметром 30 мкм с небольшим конусом(Рисунок 1 Ai),который будет использоваться для записи афферентных нейронов с задней боковой линии.
    2. Потяните дополнительную боросиликатную стеклянную капиллярную трубку в пару электродов с меньшим диаметром наконечника (1-5 мкм). Держа по одному электроду в каждой руке, осторожно провести кончиками друг по другу, чтобы разбить их под углом ~ 30 °. Используя микроковалку, отполирует скошенный наконечник до однородной массы. Конечный диаметр наконечника должен быть между 30-50 мкм и будет использоваться в качестве регистрирующем электрода вентрального корня (VR)(рисунок 1 Aii).
    3. Отметьте боковую часть электрода VR передней кромкой перманентными чернилами, чтобы помочь ориентировать отверстие наконечника вниз при вставке электрода в держатель пипетки головной ступени (шаг 3.2).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Механическая модификация записывающего электрода VR является неточной, и шаг 1.3.2 может потребовать нескольких попыток до тех пор, пока перед полировкой не будет достигнута подходящая морфология наконечника. Регистрирующий электрод VR скошен, чтобы соответствовать изгибу тела личинок. После изготовления записывающий электрод VR можно использовать многократно, пока наконечник остается чистым и чистым между экспериментами.
  4. Сгенерируйте протокол в программах электрофизиологической записи.
    1. Убедитесь, что правая головная сцена подключена к входу канала 1 в задней части микроэлектродного усилителя тока и напряжения для записи афферентных нейронов, а левая головная сцена подключена к входу канала 2 для записей VR.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Компьютерные спецификации для усилителя тока и напряжения минимально требуют 1 ГГц или лучшего процессора, Windows XP Pro или Mac OS X 10.46.6, привода CD-ROM с 512 МБ ОЗУ, 500 МБ места на жестком диске и 2 портов USB.
    2. Откройте программное обеспечение усилителя с компьютерным управлением.
    3. Установите канал 1 и канал 2 в режим текущего зажима, нажав кнопку IC для каждого канала.
    4. Введите следующие параметры под вкладками I-Clamp 1 и I-Clamp 2. Первичный выход: 100x AC Мембранный потенциал (100 000 мВ / мВ), Усиление:1000, Бессель:1 кГц, Переменный ток:300 Гц, Область применения:Байпас. Вторичный выход: 100x AC Мембранный потенциал (100 мВ / мВ), усиление:1, Фильтр нижних частот: 10 Гц.
    5. Сохранение параметров канала в Ch1_Aff и Ch2_VR.
    6. Установите и откройте патч-зажим электрофизиологического программного обеспечения.
    7. Нажмите «Настроить» и выберите «Лабораторный стенд», чтобы настроить аналоговые сигналы, добавив Ch1_Aff и Ch2_Vr к каналам дигитайзера (например, аналоговый IN #0 и аналоговый IN #1),которые подключены коаксиальным кабелем BNC к соответствующим масштабируемым выходам усилителя Channel 1 и Channel 2. Нажмите OK.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Минимальные требования к компьютеру для дигитайзера: процессор с тактовой частотой 1 ГГц или выше, Windows XP Pro или Mac OS X 10.46.6, привод CD-ROM 512 МБ ОЗУ, 500 МБ места на жестком диске и 2 порта USB.
    8. Нажмите «Получить» и выберите «Новый протокол».
    9. На вкладке Режим/Скорость выберите Без разрывов; В разделе Режим полученияустановите для параметра Пробная длина значение Использовать доступное дисковое пространство (т. е. запись до остановки) или требуемый набор Длительность (чч:мм:сс),а затем установите для параметра Частота дискретизации на сигнал (Гц) значение 20 000, чтобы максимизировать разрешение.
    10. На вкладке Входы выберите ранее настроенные аналоговые IN-каналы (на шаге 1.4.6) и выберите Ch1_Aff и Ch2_VR для соответствующего канала.
    11. На вкладке Выходы выберите Cmd 0 и Cmd 1 для #0 каналов и #1 каналовсоответственно.
      1. Подключите команду Channel 1 на усилителе к Analog Ouput 0 на дигитайзере через коаксиальный кабель BNC и повторите команду канала 2 на аналоговый выход 1.
    12. Остальные вкладки могут оставаться в настройках по умолчанию. Нажмите OK и сохраните протокол.

2. Приготовление раствора

  1. Готовят раствор Хэнка: 137 мМ NaCL, 5,4 мМ KCl, 0,25 мМ Na2HPO4,0,44 мМ KH2PO4,1,3 мМ CaCl2,1,0 мМ MgSO4,4,2 мМ NaHCO4; рН 7,3. Разбавить до 10% раствор Хэнка, добавив в бульон соответствующий объем деионизированной воды.
  2. Готовят внеклеточный раствор: 134 мМ NaCl, 2,9 мМ KCl, 1,2 мМ MgCl2,2,1 мМ CaCl2,10 мМ глюкозы, 10 мМ hePES буфера; pH 7,8 регулируется с помощью NaOH. Вакуумный фильтр внеклеточный раствор через фильтр с размером пор 0,22 мкм.
  3. Приготовить α-бунгаротоксин: растворить 1 мг лиофилизированного α-бунгаротоксина в 10 мл внеклеточного раствора с производством 0,1% разведения.
  4. Готовят раствор для эвтаназии: 50% (мг/л) буферизованный фармацевтический класс MS-222 в 10% растворе Хэнка.
    ВНИМАНИЕ: α-бунгаротоксин является мощным нейротоксином, который парализует мышцы, блокируя холинергические рецепторы. Перчатки обязательны, и рекомендуется защита глаз при обращении с паралитическими.

3. Подготовка личинок к электрофизиологическим записям

  1. Обездвиживайте личинок рыбок данио.
    1. Используют личинок из лабораторно выведенной популяции рыбокданио (Danio rerio;4-7 дней после оплодотворения) и размещают в растворе эмбриона (10% раствора Хэнка) при 27 °C.
    2. Переложите личинку из корпуса в небольшую чашку Петри (35 мм) с помощью переносной пипетки с большим наконечником и удалите как можно больше окружающего раствора.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Удаление эмбрионального раствора предотвращает разбавление паралитического вещества и повышает его эффективность. Уголочной салфетки можно использовать для оттока оставшегося раствора эмбриона, и очень важно не контактировать с личинками и не оставлять личинок под воздействием воздуха.
    3. Погружайте личинок в 10 мкл 0,1% α-бунгаротоксина в течение примерно 5 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Время, необходимое для обездвижиживать личинок, варьируется между препаратами. Здоровый препарат зависит от тщательного мониторинга устойчивого быстрого кровотока и снижения двигательных реакций. Кратковременное переэкспонировать паралитическое может привести к медленному ухудшению общего состояния здоровья препарата даже после тщательного вымывания. Лучше всего применять промывку до того, как личинка будет полностью обездвижена, пока она еще демонстрирует признаки тонких мышечных вибраций.
    4. Парализованную личинку промыть внеклеточным раствором и купать в течение 10 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вымывание позволяет личинке перейти от тонких мышечных колебаний к полному параличу. Кроме того, α-бунгаротоксин является антагонистом никотинового ацетилхолинового рецептора (nAChR) α9-субъединицы, которая является критическим компонентом эндогенной цепи обратной связи, которую наблюдает этот протокол; однако было показано, что этот эффект обратим в волосковых клетках ксенопусов и рыбок данио после 10-минутного вымывания36,29.
  2. Приколоть рыбу в записывающем блюде.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Анестезия (например, MS-222, трикаин) не требуется при приготовлении личинок рыбок данио (4-7 dpf), так как это мешает здоровью животных. Фактически, личинки рыбок данио освобождены от определенных протоколов позвоночных.
    1. Используя переносную пипетку, переместите личинку из внеклеточной ванны с раствором в тарелку с силиконовым дном. Наполнить оставшуюся часть блюда внеклеточным раствором.
    2. Под стереомикроскопом осторожно расположите личинок с мелкоконечными щипцами над центром силиконового мата, боковой стороной вверх, с передним и задним концами тела, идущими слева направо соответственно. Затем возьмите вытравленный штифт из силиконового коврика с помощью щипцов с тонкими наконечниками и вставьте штифт, ортогонально к силикону, через дорсальную нотохорду личинок непосредственно дорсально к анусу. Вставьте второй штифт через нотохорду ближе к концу хвоста и вставьте третий штифт через нотохордную дорсальную часть газового пузыря(рисунок 1B).
      ПРИМЕЧАНИЕ: При вставке штифтов важно нацеливаться на центр нотохорды ширины, чтобы предотвратить ущемление кровотока или повреждение окружающей мускулатуры. Нотохорда является дорсальной по отношению к заднему нерву боковой линии, поэтому при правильном закреплении не ожидается повреждения сенсорных нейронов боковой линии. Вводят после первого контакта, чтобы не нарушать окружающие ткани. В идеале диаметр штифта составляет менее половины ширины нотохорды, чтобы обеспечить чистую вставку. Если контакты превышают эту ширину, повторяйте шаг 1.2 до тех пор, пока не будет достигнута требуемая ширина контактов. Если кровоток замедляется после закрепления, повторите с шага 1.3 и далее с новым образцом.
    3. Вставьте четвертый штифт через отический везикулу, обеспечивая при этом небольшое вращение в сторону передней стороны, когда штифт вставляется в инкапсулятор(рисунок 1B). При небольшом вращении следите за тканью между клейтрумом и отическим везикулом, чтобы выявить скопление афферентных сомат.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Угловое вставление четвертого штифта предназначено для обеспечения обнажения афферентного ганглия задней боковой линии, который в противном случае блокируется большим лопочком отича.

4. Запись вентрального корня

  1. Поместите закрепленную личинку под 10-кратный объектив погружения в воду на вертикальном микроскопе с фиксированной стадией дифференциального интерференционного контраста (ДВС-сигнал) и ориентируйте мизептальные расщелины мышечных блоков параллельно левому вектору подхода к головной сцене(рисунок 1B).
    1. Микроскоп с фиксированным этапом DIC, плавающий на оптическом воздушном столе, лучше всего работает, чтобы предотвратить вибрации от вмешательства в записи. Используя моторизованный позиционер, микроскоп может затем свободно перемещаться по фиксированной ступени, в которой установлены подготовительные и головные ступени(рисунок 1C).
    2. Поместите провод заземления в раствор ванны и убедитесь, что он подключен к левой головной сцене.
  2. Заполните записывающий электрод VR 30 мкл внеклеточного раствора с помощью гибкого наконечника пипетки с гелевой загрузкой и вставьте в левый держатель пипетки головной сцены.
  3. Опуская записывающую пипетку в раствор тарелки с помощью микроманипулятора, применяя положительное давление (1-2 мм рт.ст.), создаваемое пневматическим преобразователем. При 10-кратном увеличении убедитесь, что ориентация отверстия наконечника обращена вниз.
    1. Пневматический преобразователь должен быть подключен к порту держателя пипетки через силиконовую трубку.
  4. Поместите электрод VR на миосептум
    1. Снова используя микроманипулятор, опустите наконечник электрода VR, пока он не удержет положение над личинкой. Увеличьте увеличение до 40-кратного погружения.
    2. Поднесите наконечник электрода над миосектумом между двумя вентральными миомерами к боковой линии до тех пор, пока расщелина не будет центрирована в апертуре кончика электрода VR(рисунок 1D).
    3. Опустите пипетку до тех пор, пока запаздывающий край отверстия наконечника мягко не соприкнется с эпителием. После первоначального контакта маневрируйте пипеткой по диагонали, чтобы убедиться, что передовая кромка вступает в контакт и может генерировать уплотнение.
    4. Нанесите отрицательное давление (~100 мм рт.ст.) с помощью пневматического датчика и удерживайте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Правильная ориентация пипетки VR относительно миозептума и непрерывное отрицательное давление оптимизируют обнаружение активности двигательных нейронов с высоким отношением сигнал/шум через кожу.
  5. Обнаружение активности двигательных нейронов.
    1. Левая головная сцена должна быть подключена к усилителю, который ретранслирует усиленный сигнал в дигитайзер, который выводит указанный сигнал в электрофизиологическое программное обеспечение для мониторинга на соседнем компьютере (см. раздел 1.4).
    2. В программном обеспечении patch clamp нажмите кнопку Play на панели инструментов, чтобы контролировать сигнал VR(рисунок 1E).
    3. Убедитесь, что запись VR достигается после того, как активность двигательных нейронов с хорошо стереотипной динамикой сигнала всплеска наблюдается29,37 (рисунок 1E).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Фиктивные плавательные схватки - это паттерны активности двигательных нейронов VR, которые продолжают передаваться, несмотря на то, что подготовка парализована. Поэтому фиктивные заплывы являются доступным средством определения поведенческого состояния животного и измерения двигательных параметров при одновременном выполнении афферентных нейронных записей, требующих иммобилизованной подготовки. В наших руках, как только запись VR достигнута, здоровая подготовка вызовет добровольные фиктивные плавательные схватки каждые несколько секунд. Помните, что здоровый препарат поддерживает быстрый кровоток. Имейте в виду, что получение достаточного сигнала VR может занять несколько минут, а отношение сигнал/шум может улучшиться после первоначального обнаружения. В интересах времени приемлемо перейти к разделу 5.
    4. Если запись VR все еще не достигнута после завершения раздела 5, отпустите отрицательное давление, поднимите электрод и повторите с шага 4.4.2 и далее на другом миосекте, если здоровье личинки все еще оптимально.

5. Запись афферентных нейронов

  1. Заполнить афферентный записывающий электрод 30 мкл внеклеточного раствора; вставить в правый держатель пипетки головнойсцены (рисунок 1B,C)и опустить в раствор посуды при подаче положительного давления (1-2 мм рт.ст.), производимого пневматическим преобразователем.
  2. Расположите и свободно прикрепите к задней боковой линии афферентного ганглия.
    1. Используя микроманипулятор, опустите наконечник афферентного электрода до тех пор, пока он не удержит положение над клейтрумом.
    2. Увеличьте увеличение до 40-кратного погружения и найдите пересечение задней боковой линии нерва и клейтроума. Следуйте по боковой линии нерва, переднего от клейтрума туда, где волокна иннервируют заднюю боковую линию афферентного ганглия, различимого дискретным скоплением сомы(рисунок 1F).
    3. Поднесите наконечник электрода над афферентным ганглием и опустите пипетку до тех пор, пока наконечник не соприкнется с эпителием. Осторожно маневрируйте электродом так, чтобы вся окружность кончика контактировала с афферентным ганглием.
    4. Приложить отрицательное давление (20-50 мм рт.ст.) с помощью пневматического датчика и удерживать.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Отрицательное давление, приложенное к афферентной ганглии, является более мягким, чем всасывание, применяемое во время записи вентрального корня. Повышение отрицательного давления может улучшить сигнал-шум, но здоровье афферентных нейронов ухудшается при устойчивом агрессивном всасывании, что снижает вероятность успешной записи.
  3. Запись активности афферентных нейронов.
    1. Убедитесь, что правая головная ступень соединена в той же последовательности, что описано в шаге 4.5.1.
    2. В pClamp10 нажмите кнопку Play на панели инструментов, чтобы одновременно отслеживать афферентный нейрон и сигнал VR.
    3. Убедитесь, что вся клетка, свободный участок записи афферентных нейронов достигается, как только всплески происходят спонтанно, примерно каждые 100-200мс 1,29 (рисунок 1E).
    4. Постепенно увеличивают афферентный нейрон, регистрирующий давление электрода обратно в атмосферу (0 мм рт.ст.) и удерживают до конца записи.

6. Сбор данных

  1. Одновременная запись.
    1. Как только активность афферентных нейронов и двигательных нейронов обнаружена, нажмите кнопку «Запись» на панели инструментов в pClamp10, чтобы захватить одновременные записи без зазоров в обоих каналах.
    2. Запись на нужную продолжительность(рисунок 1E).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Запись в здоровом препарате может длиться в течение многих часов и оставаться восприимчивой к внешним раздражителям.
    3. Сохраните запись как поддерживаемый тип файла (.abf, pClamp10) для сохранения метаданных, таких как параметры получения.

7. Эвтаназия

  1. Применяйте положительное давление (10 мм рт.ст.) как к афферентным, так и к VR-записывающим электродам с помощью пневматических преобразователей и поднимайте электроды из записывающей тарелки с помощью микроманипуляторов.
  2. Перенесите записывающее блюдо с микроскопа с фиксированной стадией DIC на рассеченный стереомикроскоп.
  3. Используя тонкие щипцы наконечника, удалите вольфрамовые штифты из нотохорды и отической капсулы и перенесите личинок с помощью переносной пипетки в чашку Петри (35 мм), содержащую 5 мл раствора для эвтаназии в течение минимум 5 минут.

8. Предварительная обработка и анализ данных

ПРИМЕЧАНИЕ: Предварительная обработка и анализ данных потребуют базового понимания кодирования командной строки.

  1. Преобразуйте файл записи для предварительной обработки.
    1. Установите программное обеспечение Matlab.
    2. Загрузите пользовательский написанный сценарий, abfload.m38 и сохраните файл в той же папке, в которую хранится необработанный файл записи.
    3. В окне редактора Matlab откройте abfload.m и нажмите кнопку Выполнить на панели инструментов. Выберите Изменить папку, если появится соответствующий запрос.
    4. Выполните функцию в командном окне с необработанным файлом записи в качестве входных данных,
      > [d,si,h] = abfload('[имя файла записи raw].abf')
      и сохраните выходную рабочую область с именем файла, которое включает обозначение личинки, возраст и дату эксперимента, например [номер образца]_[возраст в dpf]_[имя файла необработанной записи (включает экспериментальную дату по умолчанию)].
      ПРИМЕЧАНИЕ: Преобразованное имя файла должно включать только очерченные целые числа с подчеркиванием.
  2. Выполните предварительную обработку данных.
    1. Скачайте скрипт Matlab AffVR_preprocess.m и связанные с ним функции, написанные авторами.
    2. В окне Редактор откройте AffVR_preprocess.m.
    3. В разделе Переменныенастройте пороговые значения обнаружения всплесков нижней границы как для афферентных, так и для VR-записей(spk_detect_lb и vr_detect_lb,строк 8 и 14 соответственно) в зависимости от записи отношения сигнал/шум.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обнаружение шипов основано на ручном пороговом значении для сортировки и изоляции сигналов от более чем одного афферентного нейрона по амплитуде. Базовый шум и активность от других единиц отфильтровываются путем порогового значения, чтобы включить только амплитуды шипов в пределах процента (например, spk_detect_lb) от максимума (например, spk_detect_ub). Пороговое значение также обеспечивает точное смешение всплесков двигательной активности в всплески и коллективные фиктивные плавательные схватки. Как правило, начинают с пороговой нижней границы 0,5 и постепенно уменьшают до тех пор, пока не будет достигнуто точное обнаружение. Например, установка spk_detect_lb как 0,5 и spk_detect_ub как 1,0 обнаружит все всплески, равные или превышающие 50% от максимальной амплитуды шипа, и исключит шум или дополнительные нейроны нижних амплитуд шипов(рисунок 2A). В качестве альтернативы можно также снизить spk_detect_ub с 1,0, чтобы исключить нейроны с более высокими амплитудами шипов, чтобы изолировать нейроны более низких амплитуд шипов. Результаты предварительной обработки рисунков (см. этап 7.2.6) будут информировать о необходимости корректировки и повторения с шага 7.2.2.
    4. В окне редактора нажмите кнопку Выполнить, чтобы выполнить AffVR_preprocess.m.
    5. Перейдите к ранее преобразованным файлу данных .mat (см. шаг 7.1.3); выберите и нажмите кнопку Открыть, чтобы начать автоматическую предварительную обработку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Во время выполнения пользовательского скрипта в командном окне будут отображаться выходные данные, информирующие о его ходе обработки, такие как «фильтрация данных...», «обнаружение активности вентрального корня...» и «генерация цифр...».
    6. Цифры, сгенерированные AffVR_preprocess.m, будут визуализировать афферентный всплеск и обнаружение VR и указывать, следует ли корректировать какие-либо переменные анализа(рисунок 2).
    7. Введите «Y» на клавиатуре, чтобы сохранить предварительно обработанные метаданные в папку preprocess_output.
    8. Предварительно обработанные данные будут автоматически выведены в виде data_out.xls.
  3. Анализируйте предварительно обработанные данные по желанию.

Результаты

После того, как личинки рыбок данио должным образом обездвижены и достигнут афферентный ганглий задней боковой линии и запись VR, активность как в афферентных, так и в двигательных нейронах может быть измерена одновременно. Каналы записи отображаются с использованием протоколов записи...

Обсуждение

Описанный экспериментальный протокол обеспечивает потенциал для мониторинга эндогенных изменений сенсорного ввода в двигательном поведении у неповрежденного, ведомого позвоночного. В частности, в нем подробно описывается подход in vivo к выполнению одновременных внеклеточных записей...

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Мы с благодарностью признаем поддержку со стороны Национального института здравоохранения (DC010809), Национального научного фонда (IOS1257150, 1856237) и Лаборатории морских биологических наук Уитни J.C.L. Мы хотели бы поблагодарить бывших и нынешних членов Лаборатории Ляо за стимулирование дискуссий.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
100 mL beakerPYREX1000resceptacle for etchant
10x water immersion objectiveOlympusUMPLFLN10xWlow magnification for positioning larvae and recording electrode
40x water immersion objectiveOlympusLUMPLFLN40XWhigher magnification for position electrode tip and establishing patch-clamp
abfload.msupplemental coding filecustom written MATLAB script for converting raw electrophysiology recordings to .mat files
AffVR_preprocess.msupplemental coding filecustom written MATLAB script for preprocessing recording data
BNC coaxial cablesThorLabs2249-C-12connecting amplifier and digitizer channels; require 4
borosilicate glass capillaries w/ filamentWarner InstrumentsG150F-3inner diameter: 0.86, outer diameter: 1.50; capillary glass used to form recording electrodes
burst_detectsupplemental coding filecustom written MATLAB function necessary to run AffVR_preprocess.m
computerN/AN/Aany computer should work
DC Power SupplyTenma72-420used for electrically etching dissection pins
electrophysiology digitizerAxon Instruments, Molecular DevicesAxon DigiData 1440Aenables acquisition of patch-clamp data
filamentSutter Instrument CompanyFB255B2.5 mm box filament used in micropipette puller
fine forcepsFine Science ToolsDumont #5 (0.05 x 0.02 mm) Item No. 11295-10used to manipulate larvae and insert pins
fixed stage DIC microscopeOlympusBX51WImicroscope used to visualize and establish patch-clamp recordings
flexible, tapered pipette tipFisher Scientific02-707-169flexible tips enable insertion into recording electrode to dispense extracellular solution at the tip
FluoroDishWorld Precision Instruments Inc.FD3510-100cover glass bottomed dish recording dish
KimWipeKimTech34155task wipe used for wicking away excess fluid from larvae
Kwik-GardWorld Precision Instruments Inc.710172self-mixing sylgard elastomer
MATLABMathWorksR2020bcommand line software for preprocessing data
microelectrode amplifierAxon Instruments, Molecular DevicesMultiClamp 700Bpatch clamp amplifier for dual channel recordings
microforgeNarishigeMF-830 microforgeto polish recording electrode
micromanipulator control unitSiskiyouMC1000-eR/T4-axis dial coordinator for controlling micromanipulator
micropipette pullerSutter Instrument CompanyFlaming/Brown P-97for pulling capillary glass into recording electrodes
microscope control unitSiskiyouMC1000epositions the microscope around the fixed stage and preparation
motorized micromanipulatorSiskiyouMX7600positions the headstage and attached recording electrode for patch-clamp recording
MultiClamp CommanderMolecular Devices2.2.2downloadable from Axon MultiClamp 700B Commander download page
optical air tableNewport CorporationVH3036W-OPTbreadboard isolation table to float microscope and minimize vibrations during recordings
pCLAMPMolecular Devices10.7.0downloadable from Axon pCLAMP 10 Electrophysiology Data Acquisition & Analysis Software Download page
permanent ink markerSharpieorder from amazon.comfor marking the leading edge side of the VR electrode to ensure proper orientation when inserting into pipette holder
petri-dishFalcon35-3001used to immerse larvae in paralytic
pipette holderMolecular Devices1-HL-Uhold recording electrode and connect to the headstage
pneumatic transducerFluke Biomedical InstrumentsDPM1Bfor controlling recording electrode internal pressure
potassium hydroxideSigma-Aldrich221473-25Getchant for etching dissection pins
silicone tubingTygon14-169-1Atubing to connect pneumatic transducer to pipette holder
spike_detectsupplemental coding filecustom written MATLAB function necessary to run AffVR_preprocess.m
stereomicroscopeCarl ZeissStemi 2000-Cused to visualize pin tips and during preparation of larvae
straight edge razor bladeCanopusorder from amazon.comcuts the tungsten wire while making dissection pins
swimbout_detectsupplemental coding filecustom written MATLAB function necessary to run AffVR_preprocess.m
syringeBecton Dickinson Compoany309602filled with extracellular solution to inject into recording electrodes
transfer pipetteSigma-AldrichZ135003-500EAsingle use, non-sterile pipette for transfering larvae
tricaine methanesulfonateSyndel12854pharmaceutical aneasthetic used to euthanize larvae with high dosage.
tungsten wireWorld Precision Instruments Inc.7155000.002 inch, 50.8 μm diameter; used to make dissection pins
vacuum filtration unitSigma-AldrichSCGVU11REsingle use, sterile, vacuum filtration units used to sterilize extracellular solution used for electrophysiology electrode ringer
voltage-clamp current-clamp headstageMolecular DevicesCV-7Bsupplied with MultiClamp 700B amplifier used as left and right headstages
α-bungarotoxinThermoFisherB1601for immobilizing the larvae prior to recording

Ссылки

  1. Trapani, J. G., Nicolson, T. Mechanism of spontaneous activity in afferent neurons of the zebrafish lateral-line organ. The Journal of Neuroscience. 31 (5), 1614-1623 (2011).
  2. Haehnel-Taguchi, M., Akanyeti, O., Liao, J. C. Afferent and motorneuron activity in response to single neuromast stimulation in the posterior lateral line of larval zebrafish. Journal of Neurophysiology. 112 (6), 1329-1339 (2014).
  3. Levi, R., Akanyeti, O., Ballo, A., Liao, J. C. Frequency response properties of primary afferent neurons in the posterior lateral line system of larval zebrafish. Journal of Neurophysiology. 113 (2), 657-668 (2015).
  4. Harris, G. G., Fishkopf, L. S., Flock, A. Receptor potentials from hair cells of the lateral line. Science. 167 (3914), 76-79 (1970).
  5. Dow, E., Jacobo, A., Hossain, S., Siletti, K., Hudspeth, A. J. Connectomics of the zebrafish's lateral line neuromast reveals wiring and miswiring in a simple microcircuit. eLife. 7, 33988 (2018).
  6. Obholzer, N., et al. Vesicular glutamate transporter 3 is required for synaptic transmission in zebrafish hair cells. The Journal of Neuroscience. 28 (9), 2110-2118 (2008).
  7. Keen, E. C., Hudspeth, A. J. Transfer characteristics of the hair cell's afferent synapse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (14), 5537-5542 (2006).
  8. Li, G., Keen, E., Andor-Ardó, D., Hudspeth, A. J., von Gersdorff, H. The unitary event underlying multiquantal EPSCs at a hair cell's ribbon synapse. The Journal of Neuroscience. 29 (23), 7558-7568 (2009).
  9. Manley, G. A., Robertson, D. Analysis of spontaneous activity of auditory neurons in the spiral ganglion of the guinea-pig cochlea. The Journal of Physiology. 258 (2), 323-336 (1976).
  10. Kiang, N. Y. S., Watanabe, T., Thomas, E., Clark, L. . Discharge patterns of single fibers in the cat's auditory nerve. , (1965).
  11. Corey, D. P., Hudspeth, A. J. Ionic basis of the receptor potential in a vertebrate hair cell. Nature. 281 (5733), 675-677 (1979).
  12. Trapani, J. G., Nicolson, T. Physiological recordings from zebrafish lateral-line hair cells and afferent neurons. Methods in Cell Biology. 100, 219-231 (2010).
  13. Reinig, S., Driever, W., Arrenberg, A. B. The descending diencephalic dopamine system is tuned to sensory stimuli. Current Biology. 27 (3), 318-333 (2017).
  14. Zhang, Q., et al. Synaptically silent sensory hair cells in zebrafish are recruited after damage. Nature Communications. 9 (1), 1388 (2018).
  15. Pichler, P., Lagnado, L. Motor behavior selectively inhibits hair cells activated forward motion in the lateral line of zebrafish. Current Biology. 30 (1), 150-157 (2020).
  16. Olszewski, J., Haehnel, M., Taguchi, M., Liao, J. C. Zebrafish larvae exhibit rheotaxis and can escape a continuous suction source using their lateral line. PloS One. 7 (5), 36661 (2012).
  17. Suli, A., Watson, G. M., Rubel, E. W., Raible, D. W. Rheotaxis in larval zebrafish is mediated by lateral line mechanosensory hair cells. PLoS One. 7 (2), 29727 (2012).
  18. Oteiza, P., Odstcil, I., Lauder, G., Portugues, R., Engert, F. A novel mechanism for mechanosensory-based rheotaxis in larval zebrafish. Nature. 547 (7664), 445-448 (2017).
  19. McHenry, M. J., Feitl, K. E., Strother, J. A. Larval zebrafish rapidly sense the water flow of a predator's strike. Biology Letters. 5 (4), 477-479 (2009).
  20. Stewart, W. J., Cardenas, G. S., McHenry, M. J. Zebrafish larvae evade predators by sensing water flow. The Journal of Experimental Biology. 216, 388-398 (2013).
  21. Mekdara, P. J., Schwalbe, M. A. B., Coughlin, L. L., Tytell, E. D. The effects of lateral line ablation and regeneration in schooling giant danios. The Journal of Experimental Biology. 221, 175166 (2018).
  22. Palmer, L. M., Giuffrida, B. A., Mensinger, A. F. Neural recordings from the lateral line in free-swimming toadfish, Opsanus tau. The Biological Bulletin. 205 (2), 216-218 (2003).
  23. Ayali, A., Gelman, S., Tytell, E. D., Cohen, A. H. Lateral line activity during undulatory body motions suggests a feedback link in closed-loop control of sea lamprey swimming. Canadian Journal of Zoology. 87 (8), 671-683 (2009).
  24. Mensinger, A. F., Van Wert, J. C., Rogers, L. S. Lateral line sensitivity in free-swimming toad fish Opsanus tau. The Journal of Experimental Biology. 222, 190587 (2019).
  25. Montgomery, J., Bodznick, D., Halstead, M. Hindbrain signal processing in the lateral line system of the dwarf scorpionfish Scopeana papillosus. The Journal of Experimental Biology. 199, 893-899 (1996).
  26. Montgomery, J. C., Bodznick, D. An adaptive filter that cancels self-induced noise in the electrosensory and lateral line mechanosensory systems of fish. Neuroscience Letters. 174 (2), 145-148 (1994).
  27. Palmer, L. M., Deffenbaugh, M., Mensinger, A. F. Sensitivity of the anterior lateral line to natural stimuli in the oyster toadfish, Opsanus tau (Linnaeus). The Journal of Experimental Biology. 208, 3441-3450 (2005).
  28. Russell, I. J., Roberts, B. L. Inhibition of spontaneous lateral-line activity of efferent nerve stimulation. The Journal of Experimental Biology. 57, 77-82 (1972).
  29. Lunsford, E. T., Skandalis, D. A., Liao, J. C. Efferent modulation of spontaneous lateral line activity during and after zebrafish motor commands. Journal of Neurophysiology. 122 (6), 2438-2448 (2019).
  30. Russell, I. J. The pharmacology of efferent synapses in the lateral-line system of Xenopus laevis. The Journal of Experimental Biology. 54 (3), 643-659 (1971).
  31. Roberts, B. L., Russell, I. J. The activity of lateral-line efferent neurons in stationary and swimming dogfish. The Journal of Experimental Biology. 57 (2), 435-448 (1972).
  32. Flock, A., Russell, I. J. The post-synaptic action of efferent fibres in the lateral line organ of the burbot Lota lota. The Journal of Physiology. 235 (3), 591-605 (1973).
  33. Montgomery, J. C. Noise cancellation in the electrosensory system of the thornback ray; common mode rejection of input produced by the animal's own ventilatory movement. Journal of Comparative Physiology. 155, 103-111 (1984).
  34. Tricas, T. C., Highstein, S. M. Action of the octavolateralis efferent system upon the lateral line of free-swimming toadfish, Opsanus tau. Journal of Comparative Physiology. 169 (1), 25-37 (1991).
  35. Weeg, M. S., Land, B. R., Bass, A. H. Vocal pathways modulate efferent neurons to the inner ear and lateral line. The Journal of Neuroscience. 25 (25), 5967-5974 (2005).
  36. Elgoyhen, A. B., Johnson, D. S., Boulter, J., Vetter, D. E., Heinemann, S. α9: an acetylcholine receptor with novel pharmacological properties expressed in rat cochlear hair cells. Cell. 79 (4), 705-715 (1994).
  37. Masino, M. A., Fetcho, J. R. Fictive swimming motor patterns in wild type and mutant larval zebrafish. Journal of Neurophysiology. 93 (6), 3177-3188 (2005).
  38. Hentschke, H. abfload. 1.4.0.0. MATLAB Central File Exchange. , (2020).
  39. Harris, G. G., Milne, D. C. Input-output characteristics of the lateral-line sense organs of Xenopus laevis. The Journal of the Acoustical Society of America. 40 (1), 32-42 (1966).
  40. Liao, J. C., Haehnel, M. Physiology of afferent neurons in larval zebrafish provides a functional framework for lateral line somatotopy. Journal of Neurophysiology. 107 (10), 2615-2623 (2012).
  41. Song, S., et al. Mathematical modeling and analyses of interspike-intervals of spontaneous activity in afferent neurons of the zebrafish lateral line. Nature Science Reports. 8, 14851 (2018).
  42. Liao, J. C., Fetcho, J. R. Shared versus specialized glycinergic spinal interneurons in axial motor circuits of larval zebrafish. The Journal of Neuroscience. 28 (48), 12982-12992 (2008).
  43. von Holst, E., Mittelstaedt, H. The principle of reafference: interactions between the central nervous system and the peripheral organs. Die Naturwissenschften. 37, 463 (1950).
  44. Crapse, T. B., Sommer, M. A. Corollary discharge across the animal kingdom. Nature Reviews. Neuroscience. 9 (8), 587-600 (2008).
  45. Brichta, A. M., Goldberg, J. M. Responses to efferent activation and excitatory response-intensity relations of turtle posterior-crista afferents. Journal of Neurophysiology. 83 (3), 1224-1242 (2000).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

168

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены