פעילות של נוירונים אפרנט קו לרוחב אחורי במהלך שחייה בזברהפיש

Elias  T. Lunsford; James C. Liao

doi:10.3791/62233

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

אנו מתארים פרוטוקול לניטור שינויים בפעילות הנוירונים האדיבים במהלך פקודות מוטוריות במערכת תאי שיער של בעלי חוליות מודל.

Abstract

מערכות חושיות אוספות רמזים החיוניים להכוונת התנהגות, אך בעלי חיים חייבים לפענח איזה מידע רלוונטי ביולוגית. תנועה מייצרת רמזים חוזרים כי בעלי חיים חייבים להתנתק מרמזים חושיים רלוונטיים של הסביבה שמסביב. לדוגמה, כאשר דג שוחה, זרימה הנוצרת מגלי גוף מזוהה על ידי נוירומסטים מכניים, הכוללים תאי שיער, המרכיבים את מערכת הקו לרוחב. תאי השיער מעבירים מידע על תנועת נוזלים מהחיישן למוח דרך תאי העצב החושיים. במקביל, פריקה corollary של הפקודה המוטורית מועברת לתאי השיער כדי למנוע עומס חושי. חשבונאות ההשפעה המעכבת של אותות מנוע חזוי במהלך הקטר הוא, אם כן, קריטי בעת הערכת הרגישות של מערכת הקו לרוחב. פיתחנו גישה אלקטרופיזיולוגית in vivo כדי לפקח בו זמנית על נוירון afferent קו לרוחב אחורי ופעילות שורש מנוע הגחוני בזחלים זברה (4-7 ימים לאחר הפריה) שיכול להימשך מספר שעות. הקלטות חוץ-תאיות של נוירונים afferent מושגות באמצעות טכניקת מהדק תיקון רופף, אשר יכול לזהות פעילות של נוירונים בודדים או מרובים. הקלטות שורש גחוני מבוצעות דרך העור עם אלקטרודות זכוכית כדי לזהות פעילות נוירון מוטורי. הפרוטוקול הניסיוני שלנו מספק את הפוטנציאל לנטר שינויים אנדוגניים או מעוררים בקלט חושי על פני התנהגויות מוטוריות בחולייתן שלם ומתנהג.

Introduction

נוירונים afferent של מערכות mechanosensory להעביר מידע מתאי שיער למוח במהלך שמיעה ואיזון. אלקטרופיזיולוגיה יכולה לחשוף את הרגישות של נוירונים afferent באמצעות הקלטות ישירות. בעוד תיקון תאים שלמים מתאי שיער יכול להיות מאתגר, הקלטה מתאי עצב afferent במורד הזרם קל יותר ומאפשר הערכה של פוטנציאל פעולה בתגובה גירויים מבוקרים¹^,²^,³. מגרה תאי שיער להוביל הסטה שלהם, אשר משנה מבנים mechanosensory, ובכך לעורר עלייה בפוטנציאל הפעולה (קוצים) בתאי עצב אדיש⁴^,⁵^,⁶. בהיעדר גירויים חיצוניים, נוירונים afferent גם ספייק באופן ספונטני עקב דליפת גלוטמט מתאי השיער על מסופים פוסט סינפטיים afferent⁷^,⁸, והוכחו לתרום לשמירה על רגישות⁹^,¹⁰. הקלטת מלחציים של פעילות afferent מאפשרת תצפית על רגישות לתאי השיער ודינמיקת אותות שאינם אפשריים באמצעות טכניקות ברזולוציה זמנית נמוכה יותר, כגון במיקרופוניקה¹¹^,¹² או הדמיית סידן תפקודית¹³^,¹⁴^,¹⁵. הפרוטוקול הבא יאפשר הקלטה של פעילות afferent במקביל לפקודות המנוע לחשוף שינויים מיידיים ברגישות לתאי השיער.

דגי זברה(Danio rerio)משתמשים בתאי שיער הכלולים בנוירומסטים המרכיבים את מערכת הקו לרוחב כדי לזהות תנועת מים יחסית לגופם, המתורגמת לאותות עצביים החיוניים לניווט¹⁶^,¹⁷^,¹⁸, הימנעות טורפים, לכידת טרף¹⁹^,²⁰, ולימוד²¹. זרימת מים יכולה להיווצר גם על ידי תנועות של שחייה²²^,²³^,²⁴,^{נשימה 22}^,²⁵^,²⁶, והאכלה²⁷. התנהגויות אלה מהוות תנועות חוזרות ונשנות שיכולות להתעייף מתאי השיער ולפגוע בחישה. לכן, זה קריטי כי מערכת הקו לרוחב מבדיל בין חיצוני (exafferent) ו עצמית שנוצר (reafferent) גירויים זרימה. פריקה קורולית מקלה על אותות זרימה עצמיים במהלך תנועה בזברה. אות מנוע חיזוי מעכב זה מועבר באמצעות נוירונים יורדים לקולטנים החושיים כדי לשנות את הקלט או להפריע לעיבוד המשוב החביב²⁸^,²⁹. עבודה מהותית שתרמה להבנתנו המוקדמת את מערכת ההזנה הזו הסתמכה על הכנות במבחנה שבהן הקישוריות והפעילות האנדוגנית של המעגל העצבי לא נשמרו^28,^30,^31,^32,^33,^34,³⁵. פרוטוקול זה מתאר גישה לשימור מעגל עצבי שלם שבו נשמרת דינמיקת משוב אנדוגני ובכך מאפשר הבנה טובה יותר של הפרשות corollary ב vivo.

הפרוטוקול המתואר כאן מתאר כיצד לפקח על הנוירונים האחוריים לרוחב קו פעילות נוירון מוטורי בו זמנית זברה זחל. אפיון דינמיקת האותות לפני, במהלך ואחרי פקודות מוטוריות מספק תובנות לגבי משוב אנדוגני בזמן אמת ממערכת העצבים המרכזית המווסתת את רגישות תאי השיער במהלך התנועה. פרוטוקול זה מתאר אילו חומרים יצטרכו להיות מוכנים לפני הניסויים ולאחר מכן מתאר כיצד לשתק ולהכין זחלי זברה. הפרוטוקול יתאר כיצד להקים הקלטה יציבה של תיקון רופף של נוירונים afferent ואת השורש הגחוני חוץ תאי (VR) הקלטות של נוירונים מוטוריים. נתונים מייצגים שניתן להשיג באמצעות פרוטוקול זה מוצגים מאדם למופת וניתוח בוצע בשכפולים מרובים של הפרוטוקול הניסיוני. עיבוד מראש של נתונים מתבצע באמצעות קבצי Script כתובים מותאמים אישית ב- MATLAB. בסך הכל, פרדיגמה ניסיונית זו in vivo צפויה לספק הבנה טובה יותר של משוב חושי במהלך תנועה במערכת תאי שיער בעלי חוליות מודל.

Protocol

כל הטיפול והניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת פלורידה.

1. הכנת חומרים להקלטות אלקטרופיזיולוגיות

מכינים צלחת הקלטה עם תחתית סיליקון.
1. לוותר על שכבה דקה של רכיבים אלסטומר סיליקון ערבוב עצמי (למשל, Sylgard) לתוך צלחת תרבית רקמות תחתית זכוכית כיסוי עד שהוא מפלס עם שפת באר רדודה. כ 0.5 מ"ל מספיק.
2. מכסים ומרפאים את המנה למינימום של 48 שעות בטמפרטורת החדר.
הפוך סיכות ניתוח.
1. לספק מטען שלילי (5 V) כדי 100 מל של תחריט (3M KOH) באמצעות ספק כוח DC ולחבר חוט טונגסטן (0.002 אינץ '; 50.8 מיקרומטר קוטר) לפלט טעון חיובית.
  התראה: חוטים שליליים וחיוביים לא צריכים ליצור קשר זה עם זה במהלך הליך זה כפי שאתה עלול להסתכן בהפקת ניצוצות, אשר עלול להוות סכנת שריפה פוטנציאלית.
2. תחוט טונגסטן על ידי טבילה מהירה ושוב ושוב את קצה החוט לתוך האמבטיה תחריט עד הקצה מצטמצם לנקודה חדה. תחת סטריאומיקרוסקופ, חותכים את החוט כ 1 מ"מ מהקצה עם סכין גילוח קצה ישר. חזור על הפעולה שלוש פעמים נוספות ולאחר מכן הכנס סיכות לצלחת הקלטה שנרפאה באמצעות מלקחיים עדינים.
הכן אלקטרודות הקלטה.
1. משוך צינור נימי זכוכית בורוסיליקט (קוטר פנימי: 0.86 מ"מ, קוטר חיצוני: 1.50 מ"מ) באמצעות משיכה מיקרופיפט אופקית עם חוט תיבת לאלקטרודות עם קצה בקוטר 30 מיקרומטר עם התחדדות קלה (איור 1 Ai) שישמש לתיעוד נוירונים אמידים מהקו האחורי לרוחב.
2. משוך צינור נימי זכוכית בורוסיליקט נוסף לתוך זוג אלקטרודות עם קטרים קצה קטן יותר (1-5 מיקרומטר). מחזיקים אלקטרודה אחת בכל יד, מפעילים בעדינות את הטיפים זה על פני זה כדי לשבור אותם לזווית של ~ 30°. בעזרת מיקרופורג', יש ללטש את הקצה המשופע עד לקבלת מרקם חלק. קוטר הקצה הסופי צריך להיות בין 30-50 מיקרומטר וישמש כרשת הגחון (VR) המתעדת אלקטרודה(איור 1 Aii).
3. סמן את הצד של אלקטרודה VR עם הקצה המוביל עם דיו קבוע כדי לסייע בכיוון צמצם קצה כלפי מטה בעת החדרת האלקטרודה לתוך מחזיק פיפטה של כיסוי הראש (שלב 3.2).
  הערה: שינוי מכני של אלקטרודת הקלטת VR אינו מקרי וצעד 1.3.2 עשוי לדרוש ניסיונות מרובים עד מורפולוגיה טיפ מתאים מושגת לפני הליטוש. אלקטרודה הקלטת VR משופע כדי להתאים את עקומת הגוף של הזחלים. לאחר ייצור, אלקטרודה הקלטת VR ניתן להשתמש שוב ושוב כל עוד הקצה נשאר ברור ונקי בין ניסויים.
צור את הפרוטוקול בתוכניות הקלטה אלקטרופיזיולוגיות.
1. ודאו שהראש הימני מחובר לקלט של ערוץ 1 בחלק האחורי של זרם המיקרואלקטרוניקה ומגבר מלחצי המתח להקלטות הנוירונים והראש השמאלי מחובר לקלט של ערוץ 2 להקלטות ה-VR.
  הערה: מפרטי המחשב עבור מגבר מהדק הזרם והמתח דורשים באופן מינימלי 1 ג'יגה-הרץ או מעבד טוב יותר, Windows XP Pro או Mac OS X 10.46.6, כונן תקליטורים עם זיכרון RAM של 512 מגה-בתים, שטח כונן קשיח של 500 MB ו-2 יציאות USB.
2. פתח את תוכנת המגבר הנשלטת על-ידי המחשב.
3. הגדר את ערוץ 1 ואת ערוץ 2 למצב הידוק נוכחי על-ידי לחיצה על לחצן IC עבור כל ערוץ.
4. הזן את הפרמטרים הבאים הן תחת הכרטיסיות I-Clamp 1 והן I-Clamp 2 . תפוקה ראשית: 100x AC פוטנציאל קרום (100,000 mV/mV), רווח: 1,000, בסל: 1 kHz , AC: 300 הרץ , היקף: מעקף . פלט משני: 100x AC פוטנציאל קרום (100 mV / mV) , רווח: 1 , מסנן Lowpass: 10 הרץ.
5. שמור פרמטרי ערוץ כ Ch1_Aff וכ- Ch2_VR.
6. התקן ופתח את תוכנת האלקטרופיזיולוגיה של מהדק התיקון.
7. לחץ על קביעת תצורה ובחר ספסל מעבדה כדי להגדיר את האותות האנלוגיים על ידי הוספת Ch1_Aff Ch2_Vr לערוצי דיגיטייזר (למשל, אנלוגי IN #0 אנלוגי in #1)המחוברים, על ידי כבל קואקסיאלי BNC, לערוץ המתאים 1 וערוץ 2 יציאות קנה מידה של המגבר. לחץ על אישור.
  הערה: דרישות המחשב המינימליות עבור הדיגיטציה הן: מעבד 1 ג'יגה-הרץ או מעבד טוב יותר, Windows XP Pro או Mac OS X 10.46.6, כונן תקליטורים 512 MB RAM, שטח כונן קשיח של 500 MB ו- 2 יציאות USB.
8. לחץ על רכוש ובחר פרוטוקול חדש.
9. בכרטיסייה 'מצב/תעריף', בחרו 'ללא רווחים'; תחת מצב רכישה, הגדר את אורך הניסיון לשימוש בשטח דיסק זמין (כלומר, רשומה עד לעצירה) או כמשך מוגדר רצוי (hh:mm:ss)ולאחר מכן הגדר את קצב הדגימה לאות (Hz) ל- 20,000 כדי למקסם את הרזולוציה.
10. תחת הכרטיסיה כניסות, בחר את ערוצי IN אנלוגיים שתצורתם נקבעה בעבר (בשלב 1.4.6) ובחר Ch1_Aff Ch2_VR עבור הערוץ המתאים.
11. תחת הכרטיסיה יציאות, בחר Cmd 0 ו- Cmd 1 עבור #0 ערוצים וערוץ #1, בהתאמה.
  1. חבר את פקודת ערוץ 1 במגבר לאנלוגי Ouput 0 על הדיגיטציה באמצעות כבל קואקסיאלי BNC וחזור על פקודת ערוץ 2 לפלט אנלוגי 1.
12. הכרטיסיות הנותרות יכולות להישאר תחת הגדרות ברירת המחדל. לחץ על אישור ולשמור את הפרוטוקול.

2. הכנת פתרון

הכן את הפתרון של האנק: 137 mM NaCL, 5.4 mM KCl, 0.25 mM Na₂HPO₄, 0.44 mM KH₂PO₄, 1.3 mM CaCl₂, 1.0 mM MgSO₄, 4.2 mM NaHCO₄; עמ' 7.3. לדלל 10% הפתרון של האנק על ידי הוספת הנפח המתאים של מים deionized למניה.
הכן פתרון חוץ-תאי: 134 mM NaCl, 2.9 מ"מ KCl, 1.2 מ"מ MgCl₂, 2.1 mM CaCl₂, 10 מ"מ גלוקוז, 10 mM HEPES מאגר; pH 7.8 מותאם עם NaOH. פתרון חוץ תאי מסנן ואקום דרך המסנן עם גודל נקבובית 0.22 מיקרומטר.
מכינים α -bungarotoxin: להמיס 1 מ"ג של α-bungarotoxin ליאופילי בתמיסה חוץ תאית 10 מ"ל לייצר 0.1% דילול.
הכן פתרון המתת חסד: 50% (מ"ג / L) אגירה פרמצבטית כיתה MS-222 ב 10% הפתרון של האנק.
התראה: α-bungarotoxin הוא רעלן עצבי חזק המשתק את השרירים על ידי חסימת קולטנים שימוש. כפפות נדרשות והגנה על העיניים מומלץ בעת טיפול משותק.

3. הכנת זחלים להקלטות אלקטרופיזיולוגיות

לשתק זחלי זברה.
1. השתמש זחלים מן האוכלוסייה במעבדה bred של זברה (דניו rerio; 4-7 ימים לאחר ההפריה) ובית בתמיסת העובר (10% הפתרון של האנק) ב 27 °C (69 °F).
2. מעבירים זחלים מדיור לצלחת פטרי קטנה (35 מ"מ) באמצעות פיפטה העברה גדולה ומסירים כמה שיותר מהפתרון שמסביב.
  הערה: הסרת פתרון העובר מונעת דילול של משותק ומגבירה את יעילותו. הפינה של ניגוב משימה יכולה לשמש כדי לפתיל את פתרון העובר הנותר, וזה קריטי לא ליצור קשר עם הזחלים או להשאיר זחלים חשופים לאוויר.
3. לטבול זחלים ב 10 μL של 0.1% α-bungarotoxin במשך כ 5 דקות.
  הערה: הזמן הדרוש כדי לשתק זחלים משתנה בין ההכנות. הכנה בריאה תלויה במעקב צמוד אחר זרימת דם מהירה מתמשכת וירידה בתגובות המוטוריות. חשיפת יתר קצרה לשיתוק יכולה להוביל לירידה איטית בבריאות הכללית של ההכנה גם לאחר סחף יסודי. עדיף ליישם לשטוף לפני הזחל הוא משותק לחלוטין בזמן שהוא עדיין מראה סימנים של תנודות שרירים עדינות.
4. לשטוף זחל משותק עם פתרון חוץ תאי להתרחץ במשך 10 דקות.
  הערה: הסחף מאפשר לזחל לעבור מתנודות שרירים עדינות לשיתוק מוחלט. כמו כן, α-bungarotoxin הוא אנטגוניסט של קולטן אצטילכולין nicotinic (nAChR) α9-subunit, המהווה מרכיב קריטי של מעגל משוב אנדוגני פרוטוקול זה מתבונן; עם זאת, אפקט זה הוכח להיות הפיך בתאי השיער קסנופוס ו זברה לאחר 10 דקות סחף³⁶^,²⁹.
הצמד דגים בצלחת ההקלטה.
הערה: הרדמה (למשל, MS-222, Tricaine) אינה נדרשת בעת הכנת זברה זחל (4-7 dpf) כפי שהוא מפריע לבריאות בעלי החיים. למעשה, דגי זברה זחל פטורים מפרוטוקולים מסוימים של בעלי חוליות.
1. באמצעות פיפטה העברה, להעביר את הזחל מאמבט פתרון חוץ תאי לצלחת הקלטה עם תחתית סיליקון. ממלאים את שארית המנה בתמיסה חוץ-תאית.
2. תחת סטריאומיקרוסקופ, מקמו בעדינות את הזחלים עם מלקחיים עדינים מעל מרכז מחצלת הסיליקון, צד לרוחב למעלה, כאשר הקצוות הצדדיים והאחוריים של הגוף רצים משמאל לימין, בהתאמה. ואז לתפוס סיכה חרוטה מן מחצלת סיליקון באמצעות מלקחיים עדינים ולהכניס את הסיכה, orthogonally לסיליקון, דרך notochord הגב של הזחלים ישירות הגב לפי הטבעת. הכנס את הסיכה השנייה דרך הנוכורדרד בסמוך לסוף הזנב והכנס את הסיכה השלישית דרך הגב הנוכורד של שלפוחית הגז(איור 1B).
  הערה: בעת החדרת סיכות, חשוב למקד את מרכז רוחב notochord כדי למנוע פגיעה בזרימת הדם או פגיעה בשרירים שמסביב. הנוכורד הוא גב לעצב הקו לרוחב האחורי, כך שעם הצמדה נכונה, לא צפוי נזק לנוירונים החושיים של הקו לרוחב. הכנס לאחר המגע הראשון כדי לא להפריע את הרקמה שמסביב. באופן אידיאלי, קוטר הסיכה הוא פחות ממחצית רוחב הנוכורד כדי להבטיח הכנסה נקייה. אם הפינים חורגים מרוחב זה, חזור על שלב 1.2 עד להשגת רוחב הסיכה הרצוי. אם זרימת הדם מאטה לאחר ההצמדה, חזור משלב 1.3 ואילך עם דגימה חדשה.
3. הכנס את הפינה הרביעית דרך מעטה האוטי תוך מתן סיבוב קל לכיוון הצפני כאשר הסיכה מכניסה לתוך האנקפסולאנט (איור 1B). כמו סיבוב קל מוחל, לצפות את הרקמה בין cleithrum ואת vesicle אוטי לחשוף את האשכול של סומטה afferent.
  הערה: החדרה זוויתית של הסיכה הרביעית היא להבטיח את החשיפה של גנגליון afferent קו לרוחב האחורי, אשר נחסם אחרת על ידי vesicle otic גדול.

4. הקלטת שורש גחוני

הניחו זחל מוצמד מתחת למטרת הטבילה במים 10x על מיקרוסקופ הפרעה דיפרנציאלית שלב קבוע (DIC) זקוף וכוונו את שסועות myseptal של גושי השרירים במקביל לווקטור הגישה לראש שמאל (איור 1B).
1. מיקרוסקופ DIC בשלב קבוע צף על שולחן אוויר אופטי פועל בצורה הטובה ביותר כדי למנוע תנודות מלהפריע להקלטות. באמצעות מיקום ממונע, המיקרוסקופ יכול לנוע בחופשיות סביב השלב הקבוע שבו נערכים ההכנה והראש (איור 1C).
2. מניחים את חוט הקרקע בתמיסת האמבטיה ומבטיחים שהוא מחובר לראש שמאל.
מלאו את אלקטרודת הקלטת ה-VR ב-30 μL של פתרון חוץ-תאי בעזרת קצה פיפטה גמיש לטעינת ג'ל והכנסו למחזיק פיפטה שמאלי.
מנמיכים את פיפט ההקלטה לתמיסת המנה עם מיקרומניפולטור תוך הפעלת לחץ חיובי (1-2 מ"מ-ח"ג) המיוצר על ידי מתמר פנאומטי. תחת הגדלה של 10x, ודא שהכיוון של פתח הקצה פונה כלפי מטה.
1. המתמר הפנאומטי צריך להיות מחובר ליציאת מחזיק פיפטה באמצעות צינורות סיליקון.
הנח את אלקטרודה VR על myoseptum
1. באמצעות micromanipulator שוב, להוריד את קצה אלקטרודה VR עד שהוא מחזיק עמדה מעל הזחל. הגדל את ההגדלה לטבילה של פי 40.
2. הביאו את קצה האלקטרודה מעל תמיסת ביניים בין שני מיומרים גחוניים לקו לרוחב עד שהסדק יתרכז בפתח קצה האלקטרודה VR(איור 1D).
3. מנמיכים את הפיפט עד לקצה הפיגור של פתח הקצה בעדינות מגעים אפיתל. לאחר מגע ראשוני, לתמרן את פיפטה באלכסון כדי להבטיח את הקצה המוביל יוצר קשר והוא יכול ליצור חותם.
4. החל לחץ שלילי (~ 100 מ"מ Hg) עם מתמר פנאומטי להחזיק.
  הערה: כיוון נכון של פיפטה VR ביחס myoseptum ולחץ שלילי מתמשך מייעל זיהוי פעילות נוירון מוטורי עם יחס אות לרעש גבוה דרך העור.
לזהות פעילות נוירון מוטורי.
1. יש לחבר את כיסוי הראש השמאלי למגבר, המעביר את האות המוגבר לדיגיטייזר המפיק את האות האמור לתוכנת האלקטרופיזיולוגיה של מלחצי התיקון לניטור במחשב סמוך (ראה סעיף 1.4).
2. בתוכנת מלחציים לתיקון, לחץ על לחצן הפעל בסרגל הכלים כדי לנטר את אות ה- VR (איור 1E).
3. ודאו שהקלטת ה-VR מושגת ברגע שפעילות הנוירונים המוטוריים עם דינמיקת אות פרץ סטריאוטיפית היטב נצפית²⁹^,³⁷ (איור 1E).
  הערה: התקפי שחייה פיקטיביים הם דפוסי הפעילות של הנוירונים המוטוריים VR שממשיכים לשדר למרות שההכנה משותקת. לכן, שחייה פיקטיבית היא אמצעי נגיש לקביעת המצב ההתנהגותי של החיה ומדידת פרמטרים לוקומוטוריים ובו זמנית ביצוע הקלטות נוירון afferent הדורשים הכנה משותקת. בידיים שלנו, ברגע שהקלטת VR מושגת, הכנה בריאה תעורר התקפי שחייה פיקטיביים מרצון כל כמה שניות. זכור, הכנה בריאה סבלה מזרימת דם מהירה. שים לב, השגת אות VR מספיק עשויה להימשך מספר דקות ויחס האות לרעש עשוי להשתפר לאחר הגילוי הראשוני. לטובת הזמן, מקובל לעבור לסעיף 5.
4. אם הקלטת VR עדיין לא מושגת לאחר השלמת סעיף 5, שחרר לחץ שלילי, העלה את האלקטרודה וחזור משלב 4.4.2 ואילך על myoseptum שונה אם בריאות הזחל עדיין אופטימלית.

5. הקלטת נוירון Afferent

למלא את אלקטרודה הקלטה afferent עם 30 μL של פתרון חוץ תאי; הכנס לתוך מחזיק פיפטה הראש הימני(איור 1B,C),ונמוך יותר לתוך תמיסת המנה תוך הפעלת לחץ חיובי (1-2 מ"מ Hg) המיוצר על ידי מתמר פנאומטי.
אתר והצמד באופן רופף לגנגליון אחורי לרוחב קו.
1. באמצעות micromanipulator, להוריד את קצה אלקטרודה afferent עד שהוא מחזיק עמדה מעל cleithrum.
2. הגדל את ההגדלה לטבילה של פי 40 ואתר את ההצטלבות של עצב הקו לרוחב האחורי וקליטרום. עקבו אחר קו העצבים הלרוחב מהקליתרום למקום שבו הסיבים הפנימיים את הגנגליון האחורי של הקו לרוחב, שניתן להבחין בו על ידי הצביר הדיסקרטי של סומה(איור 1F).
3. מביאים את קצה האלקטרודה מעל הגנגליון האדיש ומנמיכים את הפיפט עד שהקצה יוצר קשר עם האפיתל. בעדינות, לתמרן את האלקטרודה כך היקף הקצה כולו יוצר קשר עם גנגליון afferent.
4. יש להפעיל לחץ שלילי (20-50 מ"מ גרם) עם המתמר הפנאומטי ולהחזיק.
  הערה: הלחץ השלילי המופעל על הגנגליון האדיש עדין יותר מהיניקה המיושמת במהלך הקלטת השורש הגחוני. הגברת הלחץ השלילי יכולה לשפר את האות לרעש, אך בריאות הנוירונים פוחתת תחת שאיבה אגרסיבית מתמשכת, מה שמפחית את ההסתברות להקלטה מוצלחת.
הקלט פעילות נוירון afferent.
1. ודא שהראש הימני מחובר ברצף דומה כמתואר בשלב 4.5.1.
2. ב pClamp10, לחץ על כפתור הפעל בסרגל הכלים כדי לפקח על נוירון afferent ואות VR בו זמנית.
3. ודא כי התא כולו, הקלטת תיקון רופף של נוירונים afferent מושגת פעם קוצים להתרחש באופן ספונטני, בערך כל 100-200 ms¹^,²⁹ (איור 1E).
4. בהדרגה, להגדיל את הנוירון afferent הקלטת לחץ אלקטרודה בחזרה אטמוספרי (0 מ"מ Hg) ולהחזיק לשארית ההקלטה.

6. רכישת נתונים

הקלטה בו זמנית.
1. לאחר נוירון afferent ופעילות נוירון מוטורי מזוהים שניהם, לחץ על כפתור הקלטה בסרגל הכלים ב pClamp10 כדי ללכוד הקלטות ללא פער בו זמנית בשני הערוצים.
2. רשומה למשך הרצוי (איור 1E).
  הערה: הקלטה בהכנה בריאה יכולה להימשך שעות רבות ולהישאר מגיבה לגירויים חיצוניים.
3. שמור את ההקלטה כסוג קובץ נתמך ( .abf, pClamp10) כדי לשמר מטה-נתונים כגון פרמטרי רכישה.

7. המתת חסד

החל לחץ חיובי (10 מ"מ Hg) הן אלקטרודות הקלטה afferent ו- VR באמצעות מתמרים פנאומטיים ולהרים את האלקטרודות מצלחת ההקלטה באמצעות micromanipulators.
מעבירים את צלחת ההקלטה מהמיקרוסקופ DIC בשלב קבוע לסטריאומיקרוסקופ הנתיחה.
באמצעות מלקחיים קצה דק, להסיר סיכות טונגסטן מן notochord כמוסה אוטי, ולהעביר את הזחלים באמצעות פיפטה העברה לתוך צלחת פטרי (35 מ"מ) המכיל 5 מ"ל של פתרון המתת חסד במשך מינימום של 5 דקות.

8. עיבוד מקדים וניתוח נתונים

הערה: עיבוד וניתוח מראש של נתונים יחייבו הבנה בסיסית של קידוד שורת הפקודה.

המר את קובץ ההקלטה לעיבוד מקדים.
1. התקן את תוכנת Matlab.
2. הורד את קובץ ה- Script הכתוב המותאם אישית, abfload.m³⁸ ושמור את הקובץ באותה תיקיה המאחסנת את קובץ ההקלטה הגולמי.
3. בחלון עורך Matlab, פתח את abfload.m ולחץ על הפעל בסרגל הכלים. בחר שנה תיקיה, אם תתבקש לעשות זאת.
4. בצע את הפונקציה בחלון הפקודה עם קובץ ההקלטה הגולמי כקלט,
  > [ד,סי,ח] = abfload('[שם קובץ הקלטה גולמי].abf')
  ושמור את סביבת העבודה של הפלט בשם קובץ הכולל ייעוד זחל, גיל ותאריך ניסיוני כגון [מספר דגימה]_[גיל ב- dpf]_[שם קובץ הקלטה גולמי (כולל תאריך ניסיוני כברירת מחדל)].
  הערה: שם הקובץ המומר צריך לכלול רק מספר שלם שלם של תווי מקף תחתון.
בצע עיבוד מקדים של נתונים.
1. הורד קובץ Script של Matlab AffVR_preprocess.m ופונקציות משויכות, שנכתבו בהתאמה אישית על ידי המחברים.
2. בחלון העורך, פתח את AffVR_preprocess.m.
3. תחת משתנים, התאם את ספי זיהוי ספייק הגבול התחתון הן עבור הקלטות afferent והן עבור הקלטות VR (spk_detect_lb ו- vr_detect_lb, קווים 8 ו - 14, בהתאמה) בהתאם להקלטה של יחס האות לרעש.
  הערה: זיהוי ספייק מסתמך על סף ידני כדי למיין ולבודד אותות מיותר מתא עצב אחד על ידי משרעת. רעש בסיסי ופעילות מיחידות אחרות מסוננים על-ידי סף כדי לכלול משרעת ספייק רק בתוך אחוז (למשל, spk_detect_lb) מהמקסימום (למשל, spk_detect_ub). סף גם מבטיח binning מדויק של פעילות מוטורית קוצים לתוך התפרצויות והתקפי שחייה פיקטיביים קולקטיביים. בדרך כלל, התחל עם גבול תחתון סף של 0.5, והקטן בהדרגה עד שיושג זיהוי מדויק. לדוגמה, הגדרת spk_detect_lb כ- 0.5 ו- spk_detect_ub כ- 1.0 תזהה את כל הקוצים השווים או גדולים מ- 50% מהמקסימום של משרעת ספייק ולא תכלול רעש או נוירונים נוספים של משרעת ספייק נמוכה יותר (איור 2A). לחלופין, אפשר גם להוריד את spk_detect_ub מ 1.0 כדי לא לכלול נוירונים של משרעת ספייק גבוה יותר על מנת לבודד את הנוירונים של משרעת ספייק נמוך. פלטי איורים לעיבוד מקדים (ראה שלב 7.2.6) יודיעו אם יש צורך בהתאמות וחזרה משלב 7.2.2.
4. בחלון עורך, לחץ על הפעל כדי לבצע AffVR_preprocess.m.
5. נווט אל קובץ הנתונים .mat שהומר בעבר (ראה שלב 7.1.3); בחר ולחץ על פתח כדי להתחיל עיבוד מקדים אוטומטי.
  הערה: בזמן שקובץ ה- Script המותאם אישית פועל, פלטים יופיעו בחלון הפקודה המודיעים על התקדמותו באמצעות שלבי עיבוד כגון "סינון נתונים ...", "זיהוי פעילות שורש גחוני ...", ו"יצירת דמויות ...".
6. נתונים הנוצרים על ידי AffVR_preprocess.m ימחישו ספייק וזיהוי מציאות מדומה ויציינו אם יש להתאים משתני ניתוח כלשהם (איור 2).
7. הזן "Y" בלוח המקשים כדי לשמור מטה-נתונים מעובדים מראש בתיקיית preprocess_output.
8. נתונים מעובדים מראש יופקו באופן אוטומטי כ- data_out.xls.
נתח את הנתונים המעובדים מראש כרצונך.

תוצאות

לאחר זחלי זברה משתקים כראוי ואת גנגליון קו לרוחב האחורי והקלטת VR מושגת, פעילות הן נוירונים afferent ומוטורי ניתן למדוד בו זמנית. ערוצי הקלטה מוצגים באמצעות פרוטוקולי הקלטה ללא פערים (שלב 1.4) לניטור רציף של פעילות afferent ו- VR. בזמן אמת, ניתן להבחין בירידות בשיעור הזינוק הספונטני במקביל לפעילות מצי?...

Discussion

הפרוטוקול הניסיוני המתואר מספק את הפוטנציאל לניטור שינויים אנדוגניים בקלט החושי על פני התנהגויות מוטוריות בחולייתן שלם ומתנהג. באופן ספציפי, הוא מפרט גישה in vivo לביצוע הקלטות חוץ תאיות בו זמנית של נוירונים afferent קו לרוחב ושורשים מוטוריים גחוניים בזברה זחל. פעילות ספונטנית מתאפיינת בעבר בז...

Disclosures

המחברים מצהירים שאין אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgements

אנו מודים בהכרת תודה על תמיכת המכון הלאומי לבריאות (DC010809), הקרן הלאומית למדע (IOS1257150, 1856237), ומעבדת ויטני למדעי המוח הימיים ל J.C.L. ברצוננו להודות לחברי מעבדת ליאו בעבר ובהווה על הדיונים הממריצה.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mL beaker	PYREX	1000	resceptacle for etchant
10x water immersion objective	Olympus	UMPLFLN10xW	low magnification for positioning larvae and recording electrode
40x water immersion objective	Olympus	LUMPLFLN40XW	higher magnification for position electrode tip and establishing patch-clamp
abfload.m		supplemental coding file	custom written MATLAB script for converting raw electrophysiology recordings to .mat files
AffVR_preprocess.m		supplemental coding file	custom written MATLAB script for preprocessing recording data
BNC coaxial cables	ThorLabs	2249-C-12	connecting amplifier and digitizer channels; require 4
borosilicate glass capillaries w/ filament	Warner Instruments	G150F-3	inner diameter: 0.86, outer diameter: 1.50; capillary glass used to form recording electrodes
burst_detect		supplemental coding file	custom written MATLAB function necessary to run AffVR_preprocess.m
computer	N/A	N/A	any computer should work
DC Power Supply	Tenma	72-420	used for electrically etching dissection pins
electrophysiology digitizer	Axon Instruments, Molecular Devices	Axon DigiData 1440A	enables acquisition of patch-clamp data
filament	Sutter Instrument Company	FB255B	2.5 mm box filament used in micropipette puller
fine forceps	Fine Science Tools	Dumont #5 (0.05 x 0.02 mm) Item No. 11295-10	used to manipulate larvae and insert pins
fixed stage DIC microscope	Olympus	BX51WI	microscope used to visualize and establish patch-clamp recordings
flexible, tapered pipette tip	Fisher Scientific	02-707-169	flexible tips enable insertion into recording electrode to dispense extracellular solution at the tip
FluoroDish	World Precision Instruments Inc.	FD3510-100	cover glass bottomed dish recording dish
KimWipe	KimTech	34155	task wipe used for wicking away excess fluid from larvae
Kwik-Gard	World Precision Instruments Inc.	710172	self-mixing sylgard elastomer
MATLAB	MathWorks	R2020b	command line software for preprocessing data
microelectrode amplifier	Axon Instruments, Molecular Devices	MultiClamp 700B	patch clamp amplifier for dual channel recordings
microforge	Narishige	MF-830 microforge	to polish recording electrode
micromanipulator control unit	Siskiyou	MC1000-eR/T	4-axis dial coordinator for controlling micromanipulator
micropipette puller	Sutter Instrument Company	Flaming/Brown P-97	for pulling capillary glass into recording electrodes
microscope control unit	Siskiyou	MC1000e	positions the microscope around the fixed stage and preparation
motorized micromanipulator	Siskiyou	MX7600	positions the headstage and attached recording electrode for patch-clamp recording
MultiClamp Commander	Molecular Devices	2.2.2	downloadable from Axon MultiClamp 700B Commander download page
optical air table	Newport Corporation	VH3036W-OPT	breadboard isolation table to float microscope and minimize vibrations during recordings
pCLAMP	Molecular Devices	10.7.0	downloadable from Axon pCLAMP 10 Electrophysiology Data Acquisition & Analysis Software Download page
permanent ink marker	Sharpie	order from amazon.com	for marking the leading edge side of the VR electrode to ensure proper orientation when inserting into pipette holder
petri-dish	Falcon	35-3001	used to immerse larvae in paralytic
pipette holder	Molecular Devices	1-HL-U	hold recording electrode and connect to the headstage
pneumatic transducer	Fluke Biomedical Instruments	DPM1B	for controlling recording electrode internal pressure
potassium hydroxide	Sigma-Aldrich	221473-25G	etchant for etching dissection pins
silicone tubing	Tygon	14-169-1A	tubing to connect pneumatic transducer to pipette holder
spike_detect		supplemental coding file	custom written MATLAB function necessary to run AffVR_preprocess.m
stereomicroscope	Carl Zeiss	Stemi 2000-C	used to visualize pin tips and during preparation of larvae
straight edge razor blade	Canopus	order from amazon.com	cuts the tungsten wire while making dissection pins
swimbout_detect		supplemental coding file	custom written MATLAB function necessary to run AffVR_preprocess.m
syringe	Becton Dickinson Compoany	309602	filled with extracellular solution to inject into recording electrodes
transfer pipette	Sigma-Aldrich	Z135003-500EA	single use, non-sterile pipette for transfering larvae
tricaine methanesulfonate	Syndel	12854	pharmaceutical aneasthetic used to euthanize larvae with high dosage.
tungsten wire	World Precision Instruments Inc.	715500	0.002 inch, 50.8 μm diameter; used to make dissection pins
vacuum filtration unit	Sigma-Aldrich	SCGVU11RE	single use, sterile, vacuum filtration units used to sterilize extracellular solution used for electrophysiology electrode ringer
voltage-clamp current-clamp headstage	Molecular Devices	CV-7B	supplied with MultiClamp 700B amplifier used as left and right headstages
α-bungarotoxin	ThermoFisher	B1601	for immobilizing the larvae prior to recording

References

Trapani, J. G., Nicolson, T. Mechanism of spontaneous activity in afferent neurons of the zebrafish lateral-line organ. The Journal of Neuroscience. 31 (5), 1614-1623 (2011).
Haehnel-Taguchi, M., Akanyeti, O., Liao, J. C. Afferent and motorneuron activity in response to single neuromast stimulation in the posterior lateral line of larval zebrafish. Journal of Neurophysiology. 112 (6), 1329-1339 (2014).
Levi, R., Akanyeti, O., Ballo, A., Liao, J. C. Frequency response properties of primary afferent neurons in the posterior lateral line system of larval zebrafish. Journal of Neurophysiology. 113 (2), 657-668 (2015).
Harris, G. G., Fishkopf, L. S., Flock, A. Receptor potentials from hair cells of the lateral line. Science. 167 (3914), 76-79 (1970).
Dow, E., Jacobo, A., Hossain, S., Siletti, K., Hudspeth, A. J. Connectomics of the zebrafish's lateral line neuromast reveals wiring and miswiring in a simple microcircuit. eLife. 7, 33988 (2018).
Obholzer, N., et al. Vesicular glutamate transporter 3 is required for synaptic transmission in zebrafish hair cells. The Journal of Neuroscience. 28 (9), 2110-2118 (2008).
Keen, E. C., Hudspeth, A. J. Transfer characteristics of the hair cell's afferent synapse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (14), 5537-5542 (2006).
Li, G., Keen, E., Andor-Ardó, D., Hudspeth, A. J., von Gersdorff, H. The unitary event underlying multiquantal EPSCs at a hair cell's ribbon synapse. The Journal of Neuroscience. 29 (23), 7558-7568 (2009).
Manley, G. A., Robertson, D. Analysis of spontaneous activity of auditory neurons in the spiral ganglion of the guinea-pig cochlea. The Journal of Physiology. 258 (2), 323-336 (1976).
Kiang, N. Y. S., Watanabe, T., Thomas, E., Clark, L. . Discharge patterns of single fibers in the cat's auditory nerve. , (1965).
Corey, D. P., Hudspeth, A. J. Ionic basis of the receptor potential in a vertebrate hair cell. Nature. 281 (5733), 675-677 (1979).
Trapani, J. G., Nicolson, T. Physiological recordings from zebrafish lateral-line hair cells and afferent neurons. Methods in Cell Biology. 100, 219-231 (2010).
Reinig, S., Driever, W., Arrenberg, A. B. The descending diencephalic dopamine system is tuned to sensory stimuli. Current Biology. 27 (3), 318-333 (2017).
Zhang, Q., et al. Synaptically silent sensory hair cells in zebrafish are recruited after damage. Nature Communications. 9 (1), 1388 (2018).
Pichler, P., Lagnado, L. Motor behavior selectively inhibits hair cells activated forward motion in the lateral line of zebrafish. Current Biology. 30 (1), 150-157 (2020).
Olszewski, J., Haehnel, M., Taguchi, M., Liao, J. C. Zebrafish larvae exhibit rheotaxis and can escape a continuous suction source using their lateral line. PloS One. 7 (5), 36661 (2012).
Suli, A., Watson, G. M., Rubel, E. W., Raible, D. W. Rheotaxis in larval zebrafish is mediated by lateral line mechanosensory hair cells. PLoS One. 7 (2), 29727 (2012).
Oteiza, P., Odstcil, I., Lauder, G., Portugues, R., Engert, F. A novel mechanism for mechanosensory-based rheotaxis in larval zebrafish. Nature. 547 (7664), 445-448 (2017).
McHenry, M. J., Feitl, K. E., Strother, J. A. Larval zebrafish rapidly sense the water flow of a predator's strike. Biology Letters. 5 (4), 477-479 (2009).
Stewart, W. J., Cardenas, G. S., McHenry, M. J. Zebrafish larvae evade predators by sensing water flow. The Journal of Experimental Biology. 216, 388-398 (2013).
Mekdara, P. J., Schwalbe, M. A. B., Coughlin, L. L., Tytell, E. D. The effects of lateral line ablation and regeneration in schooling giant danios. The Journal of Experimental Biology. 221, 175166 (2018).
Palmer, L. M., Giuffrida, B. A., Mensinger, A. F. Neural recordings from the lateral line in free-swimming toadfish, Opsanus tau. The Biological Bulletin. 205 (2), 216-218 (2003).
Ayali, A., Gelman, S., Tytell, E. D., Cohen, A. H. Lateral line activity during undulatory body motions suggests a feedback link in closed-loop control of sea lamprey swimming. Canadian Journal of Zoology. 87 (8), 671-683 (2009).
Mensinger, A. F., Van Wert, J. C., Rogers, L. S. Lateral line sensitivity in free-swimming toad fish Opsanus tau. The Journal of Experimental Biology. 222, 190587 (2019).
Montgomery, J., Bodznick, D., Halstead, M. Hindbrain signal processing in the lateral line system of the dwarf scorpionfish Scopeana papillosus. The Journal of Experimental Biology. 199, 893-899 (1996).
Montgomery, J. C., Bodznick, D. An adaptive filter that cancels self-induced noise in the electrosensory and lateral line mechanosensory systems of fish. Neuroscience Letters. 174 (2), 145-148 (1994).
Palmer, L. M., Deffenbaugh, M., Mensinger, A. F. Sensitivity of the anterior lateral line to natural stimuli in the oyster toadfish, Opsanus tau (Linnaeus). The Journal of Experimental Biology. 208, 3441-3450 (2005).
Russell, I. J., Roberts, B. L. Inhibition of spontaneous lateral-line activity of efferent nerve stimulation. The Journal of Experimental Biology. 57, 77-82 (1972).
Lunsford, E. T., Skandalis, D. A., Liao, J. C. Efferent modulation of spontaneous lateral line activity during and after zebrafish motor commands. Journal of Neurophysiology. 122 (6), 2438-2448 (2019).
Russell, I. J. The pharmacology of efferent synapses in the lateral-line system of Xenopus laevis. The Journal of Experimental Biology. 54 (3), 643-659 (1971).
Roberts, B. L., Russell, I. J. The activity of lateral-line efferent neurons in stationary and swimming dogfish. The Journal of Experimental Biology. 57 (2), 435-448 (1972).
Flock, A., Russell, I. J. The post-synaptic action of efferent fibres in the lateral line organ of the burbot Lota lota. The Journal of Physiology. 235 (3), 591-605 (1973).
Montgomery, J. C. Noise cancellation in the electrosensory system of the thornback ray; common mode rejection of input produced by the animal's own ventilatory movement. Journal of Comparative Physiology. 155, 103-111 (1984).
Tricas, T. C., Highstein, S. M. Action of the octavolateralis efferent system upon the lateral line of free-swimming toadfish, Opsanus tau. Journal of Comparative Physiology. 169 (1), 25-37 (1991).
Weeg, M. S., Land, B. R., Bass, A. H. Vocal pathways modulate efferent neurons to the inner ear and lateral line. The Journal of Neuroscience. 25 (25), 5967-5974 (2005).
Elgoyhen, A. B., Johnson, D. S., Boulter, J., Vetter, D. E., Heinemann, S. α9: an acetylcholine receptor with novel pharmacological properties expressed in rat cochlear hair cells. Cell. 79 (4), 705-715 (1994).
Masino, M. A., Fetcho, J. R. Fictive swimming motor patterns in wild type and mutant larval zebrafish. Journal of Neurophysiology. 93 (6), 3177-3188 (2005).
Hentschke, H. abfload. 1.4.0.0. MATLAB Central File Exchange. , (2020).
Harris, G. G., Milne, D. C. Input-output characteristics of the lateral-line sense organs of Xenopus laevis. The Journal of the Acoustical Society of America. 40 (1), 32-42 (1966).
Liao, J. C., Haehnel, M. Physiology of afferent neurons in larval zebrafish provides a functional framework for lateral line somatotopy. Journal of Neurophysiology. 107 (10), 2615-2623 (2012).
Song, S., et al. Mathematical modeling and analyses of interspike-intervals of spontaneous activity in afferent neurons of the zebrafish lateral line. Nature Science Reports. 8, 14851 (2018).
Liao, J. C., Fetcho, J. R. Shared versus specialized glycinergic spinal interneurons in axial motor circuits of larval zebrafish. The Journal of Neuroscience. 28 (48), 12982-12992 (2008).
von Holst, E., Mittelstaedt, H. The principle of reafference: interactions between the central nervous system and the peripheral organs. Die Naturwissenschften. 37, 463 (1950).
Crapse, T. B., Sommer, M. A. Corollary discharge across the animal kingdom. Nature Reviews. Neuroscience. 9 (8), 587-600 (2008).
Brichta, A. M., Goldberg, J. M. Responses to efferent activation and excitatory response-intensity relations of turtle posterior-crista afferents. Journal of Neurophysiology. 83 (3), 1224-1242 (2000).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

168

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated: