Zebra Balıklarında Yüzme Sırasında Posterior Lateral Line Afferent Neurons'un Aktivitesi

Özet

Model omurgalı saç hücresi sisteminde motor komutlar sırasında afferent nöron aktiviteslerindeki değişiklikleri izlemek için bir protokol açıklıyoruz.

Özet

Duyusal sistemler davranışları yönlendirmek için gerekli ipuçlarını toplar, ancak hayvanlar hangi bilgilerin biyolojik olarak ilgili olduğunu deşifre etmelidir. Locomotion, hayvanların çevredeki çevrenin ilgili duyusal ipuçlarından ayrılmaları gereken farklı ipuçları üretir. Örneğin, bir balık yüzdüğünde, vücut dalgalanmalarından oluşan akış, yanal çizgi sistemini oluşturan saç hücrelerinden oluşan mekanoresptif nöromstlar tarafından tespit edilir. Saç hücreleri daha sonra duyusal afferent nöronlar aracılığıyla sensörden beyne sıvı hareket bilgilerini iletir. Eş zamanlı olarak, sensörlü aşırı yüklemeyi önlemek için motor komutunun corollary deşarjı saç hücrelerine aktarılır. Bu nedenle, yanal hat sisteminin hassasiyetini değerlendirirken, locomotion sırasında tahmine dayalı motor sinyallerinin inhibitör etkisinin muhasebesi kritik öneme sahiptir. Zebra balığı larvalarında (döllenme sonrası 4-7 gün) posterior lateral çizgi afferent nöron ve ventral motor kök aktivitesini aynı anda izlemek için birkaç saat sürebilen in vivo elektrofizyolojik bir yaklaşım geliştirdik. Afferent nöronların hücre dışı kayıtları, tek veya birden fazla nörondan aktiviteyi algılayabilen gevşek yama kelepçe tekniği kullanılarak elde edilir. Motor nöron aktivitesini tespit etmek için cam elektrotlarla deriden ventral kök kayıtları yapılır. Deneysel protokolümüz, sağlam ve neşeli bir omurgalıda motor davranışlarda duyusal girişteki endojen veya çağrıştırılan değişiklikleri izleme potansiyeli sağlar.

Giriş

Mekanosensory sistemlerinin afferent nöronları işitme ve denge sırasında saç hücrelerinden beyne bilgi aktarır. Elektrofizyoloji, afferent nöronların hassasiyetini doğrudan kayıtlarla ortaya alabilir. Saç hücrelerinden tüm hücre yamalama zor olsa da, aşağı akış afferent nöronlardan kayıt yapmak daha kolaydır ve kontrollü stimülasyonlara yanıt olarak eylem potansiyellerinin değerlendirilmesine izin verir^1,2,3. Saç hücrelerini uyarmak, mekanosensör yapıları değiştiren sapmalarına yol açar, böylece afferent nöronlarda eylem potansiyellerinde (sivri) bir artışı tetikler^4,5,6. Dış uyaranların yokluğunda, afferent nöronlar da saç hücrelerinden^7,8sonrası afferent post-sinaptik terminallere glutamat sızıntısı nedeniyle kendiliğinden yükselir ve duyarlılığın korunmasına katkıda bulunduğu gösterilmiştir^9,10. Afferent aktivitenin yama kelepçesi kaydı, mikrofonikler 11 , 12 veya fonksiyonelkalsiyum görüntüleme^{13, 14,15} gibi daha düşük zamansal çözünürlüğe sahip teknikler kullanılarak mümkün olmayan saç hücresi hassasiyetinin ve sinyal dinamiklerinin gözlemlenmesine olanak tanır. Aşağıdaki protokol, saç hücresi duyarlılığındaki anlık değişiklikleri ortaya çıkarmak için motor komutlarla eşzamanlı afferent aktivitenin kaydedilmasına izin verecektir.

Zebra balığı (Danio rerio) vücutlarına göre su hareketini tespit etmek için yanal çizgi sistemini oluşturan nöromistiklerde bulunan saç hücrelerini kullanır, bu da navigasyon için gerekli sinir sinyallerine çevrilir^16,17,18, avcı kaçınma, av yakalama^19,20ve okul²¹. Su akışı ayrıca yüzme hareketleri ile kendi kendine üretilebilir^{22 , 23,24}, solunum^22,25,26ve besleme²⁷. Bu davranışlar saç hücrelerini yorabilen ve algılamayı bozabilen tekrarlayan hareketlerden oluşur. Bu nedenle, yanal çizgi sisteminin dış (exafferent) ve kendi kendine oluşturulan (reafferent) akış uyaranları arasında ayrım yaptığı kritik öneme sahiptir. Bir corollary deşarjı, zebra balıklarında hareket sırasında kendi kendine oluşturulan akış sinyallerini hafifletir. Bu inhibitör tahmine dayalı motor sinyal, girişi değiştirmek veya reafferent geri bildirimin işlenmesini kesmek için azalan nöronlar aracılığıyla duyu reseptörlerine aktarılır^28,29. Bu besleme sistemini erken anlamamıza katkıda bulunan ufuk açıcı çalışma, nöral devrenin bağlantı ve endojen aktivitesinin korunmadığı in vitro preparatlara dayanıyordu²⁸, 30^,31,32,33,^34,35. Bu protokol, endojen geri bildirim dinamiklerinin korunduğu bozulmamış bir sinir devresini korumaya yönelik bir yaklaşımı açıklar, böylece corollary deşarj in vivo'nun daha iyi anlaşılmasını sağlar.

Burada özetlenen protokol, larva zebra balıklarında posterior lateral çizgi afferent nöron ve motor nöron aktivitesinin aynı anda nasıl izleneceğini açıklar. Motor komutlarından önce, sırasında ve sonrasında farklı sinyal dinamiklerini karakterize etmek, merkezi sinir sisteminden gelen ve hareket sırasında saç hücresi hassasiyetini modüle eden gerçek zamanlı, endojen geri bildirimler hakkında içgörüler sağlar. Bu protokol, deneylerden önce hangi malzemelerin hazırlanması gerektiğini özetler ve daha sonra zebra balığı larvalarının nasıl felç edileceğini ve hazırlanacağını açıklar. Protokol, afferent nöronların ve motor nöronların hücre dışı ventral kök (VR) kayıtlarının istikrarlı bir gevşek yama kaydının nasıl oluşturulacağını açıklayacaktır. Bu protokol kullanılarak elde edilebilen temsili veriler örnek bir bireyden sunulur ve deneysel protokolün birden fazla çoğaltması üzerinde analiz yapılır. Verilerin önceden işlenmesi MATLAB'da özel yazılı komut dosyaları kullanılarak gerçekleştirilir. Genel olarak, bu in vivo deneysel paradigma, model omurgalı saç hücresi sistemindeki hareket sırasında duyusal geri bildirimlerin daha iyi anlaşılmasını sağlamaya hazırdır.

Protokol

Tüm hayvan bakım ve deneyleri Florida Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanan protokollere uygun olarak gerçekleştirildi.

1. Elektrofizyolojik kayıtlar için malzemelerin hazırlanması

1. Silikon elastomer tabanlı bir kayıt kabı yapın.
   1. Kendinden karıştırmalı silikon elastomer bileşenlerinin ince bir tabakasını (örneğin, Sylgard) sığ kuyunun kenarıyla düzleşene kadar bir kapak camı tabanlı doku kültürü kabına dağıtın. Yaklaşık 0,5 mL yeterlidir.
   2. Yemeği oda sıcaklığında en az 48 saat örtün ve iyileştirin.
2. Diseksiyon iğneleri yapın.
   1. DC güç kaynağı kullanarak 100 mL'lik bir etchant (3M KOH) kabına negatif şarj (5 V) sağlayın ve pozitif yüklü çıkışa bir tungsten teli (0,002 inç; 50,8 μm çapında) takın.
      DİkKAT: Potansiyel bir yangın tehlikesi oluşturabilecek kıvılcım üretme riskiyle karşı karşıya kalabileceğiniz için, negatif ve pozitif teller bu işlem sırasında birbirleriyle temas etmemelidir.
   2. Ucu keskin bir noktaya darana kadar telin ucunu hızlı ve tekrar tekrar etchant banyosuna batırarak tungsten telini kazıyın. Stereomikroskop altında, düz kenarlı bir jiletle teli ucundan yaklaşık 1 mm kesin. Üç kez daha tekrarlayın ve ardından ince forseps kullanarak kürlenmiş kayıt kabına pimler yerleştirin.
3. Kayıt elektrotlarını hazırlayın.
   1. Arka yan çizgiden afferent nöronları kaydetmek için kullanılacak hafif konik ( Şekil 1 Ai ) hafif konik ( Şekil 1 Ai) ile 30 μm çapında uçlu elektrotlara kutu filamentli yatay bir mikropipette çekme kullanarak bir borosilikat cam kılcal boru (iç çap: 0.86 mm, dış çap:1.50 mm) çekin.
   2. Ek bir borosilikat cam kılcal boru, daha küçük uç çaplarına (1-5 μm) sahip bir çift elektrot içine çekin. Her elde bir elektrot tutarak, uçları ~30° açıya kırmak için yavaşça birbirine doğru çalıştırın. Bir mikroforge kullanarak, eğimli ucu pürüzsüz olana kadar parlatın. Son uç çapı 30-50 μm arasında olmalıdır ve ventral kök (VR) kayıt elektrodu olarak kullanılacaktır (Şekil 1 Aii).
   3. Vr elektrodun ön kenarı ile yan tarafını, elektrodu başlığın pipet tutucusuna yerleştirirken uç diyaframının aşağı doğru yönlendirildiğinde yardımcı olmak için kalıcı mürekkeple işaretleyin (adım 3.2).
      NOT: VR kayıt elektrodunun mekanik modifikasyonu kesin değildir ve 1.3.2. adım, parlatmadan önce uygun bir uç morfolojisi elde edilene kadar birden fazla deneme gerektirebilir. VR kayıt elektrotunun larvaların vücut eğrisine uyacak şekilde eğimli olması gerekir. Bir kez imal edildikten sonra, VR kayıt elektronu, uç deneyler arasında açık ve temiz kaldığı sürece tekrar tekrar kullanılabilir.
4. Elektrofizyoloji kayıt programlarında protokolü oluşturun.
   1. Afferent nöron kayıtları için mikroelektrod akımının ve gerilim kelepçesi amplifikatörünün arkadaki Kanal 1 girişine sağ başlığın bağlı olduğundan ve sol başlığın VR kayıtları için Kanal 2 girişine bağlandığından emin olun.
      NOT: Akım ve voltaj kelepçe amplifikatörü için bilgisayar özellikleri en az 1 Ghz veya daha iyi bir işlemci, Windows XP Pro veya Mac OS X 10.46.6, 512 MB RAM'li CD-ROM sürücüsü, 500 MB sabit disk alanı ve 2 USB bağlantı noktası gerektirir.
   2. Bilgisayar kontrollü amplifikatör yazılımını açın.
   3. Her kanal için ŞA düğmesini tıklatarak Kanal 1 ve Kanal 2'yi geçerli kelepçe moduna ayarlayın.
   4. Aşağıdaki parametreleri hem I-Clamp 1 hem de I-Clamp 2 sekmeleri altına girin. Birincil Çıkış: 100x AC Membran Potansiyeli (100.000 mV/mV), Kazanç: 1.000, Bessel: 1 kHz , AC: 300 Hz , Kapsam: Bypass . İkincil Çıkış: 100x AC Membran Potansiyeli (100 mV/mV) , Kazanç: 1 , Lowpass Filtresi: 10 Hz.
   5. Kanal parametrelerini Ch1_Aff ve Ch2_VR olarak kaydedin.
   6. Yama kelepçe elektrofizyoloji yazılımını yükleyin ve açın.
   7. BNC koaksiyel kablo ile amplifikatörün ilgili Kanal 1 ve Kanal 2 Ölçekli Çıkışlarına bağlanan Sayısallaştırıcı Kanallara (örneğin, Analog IN #0 ve Analog IN #1) Ch1_Affve Ch2_Vr ekleyerek analog sinyalleri ayarlamak için Yapılandırma'yı tıklatın ve Laboratuvar Tezgahı'nı seçin. Tamam'a tıklayın.
      NOT: Sayısallaştırıcı için en düşük bilgisayar gereksinimleri şunlardır: 1 Ghz veya daha iyi işlemci, Windows XP Pro veya Mac OS X 10.46.6, CD-ROM sürücüsü 512 MB RAM, 500 MB sabit sürücü alanı ve 2 USB bağlantı noktası.
   8. Edin 'i tıklatın ve Yeni Protokol 'üseçin.
   9. Mod/Hız sekmesinde Boş Boşluk 'useçin; Alma Modualtında Deneme Süresini kullanılabilir disk alanını kullan (yani durdurulana kadar kayıt yap) veya istenen süreyi (ss:mm:ss)ayarlayın ve ardından çözünürlüğü en üst düzeye çıkarmak için sinyal başına Örnekleme hızını (Hz) 20.000 olarak ayarlayın.
   10. Girişler sekmesinin altında, daha önce yapılandırılmış Analog IN Kanallarını seçin (adım 1.4.6'da) ve ilgili kanal için Ch1_Aff ve Ch2_VR seçin.
   11. Çıkışlar sekmesinin altında sırasıyla Kanal #0 ve Kanal #1 için Cmd 0 ve Cmd 1'i seçin.
       1. Amplifikatördeki Kanal 1 Komutunu BNC koaksiyel kablo ile sayısallaştırıcıdaki Analog Ouput 0'a bağlayın ve Kanal 2 Komutu için Analog Çıkış 1'e tekrarlayın.
   12. Kalan sekmeler varsayılan ayarlar altında kalabilir. Tamam'a tıklayın ve protokolü kaydedin.

2. Çözüm hazırlığı

1. Hank'in çözümünü hazırlayın: 137 mM NaCL, 5.4 mM KCl, 0.25 mM Na₂HPO₄, 0.44 mM KH₂PO₄, 1.3 mM CaCl₂, 1.0 mM MgSO₄, 4.2 mM NaHCO_4; pH 7.3. Stoka uygun deiyonize su hacmini ekleyerek Hank'in çözeltisini% 10'a kadar seyreltin.
2. Hücre dışı çözelti hazırlayın: 134 mM NaCl, 2.9 mM KCl, 1.2 mM MgCl₂, 2.1 mM CaCl₂, 10 mM glikoz, 10 mM HEPES tampon; pH 7.8 NaOH ile ayarlanır. Vakum filtresi hücre dışı çözeltiyi 0,22 μm gözenek boyutuna sahip filtreden geçirir.
3. α hazırlayın -bungarotoxin: % 0.1 seyreltme üretmek için 10 mL hücre dışı çözeltide 1 mg lyophilized α-bungarotoxin çözün.
4. Ötenazi çözeltisi hazırlayın: %10 Hank'in çözeltisinde %50 (mg/L) tamponlu farmasötik sınıf MS-222.
   DİkKAT: α-bungarotoksin, kolinerjik reseptörleri bloke ederek kasları felç eden güçlü bir nörotoksindir. Eldiven gereklidir ve paralitik ile ilgilenirken göz koruması önerilir.

3. Elektrofizyolojik kayıtlar için larvaların hazırlanması

1. Zebra balığı larvalarını hareketsiz hale getirdi.
   1. Laboratuvarda yetiştirilen zebra balığı popülasyonundan(Danio rerio; döllenmeden 4-7 gün sonra) larvaları kullanın ve 27 °C'de embriyo çözeltisinde (%10 Hank'in çözeltisi) barındırın.
   2. Larvaları büyük uçlu bir transfer pipeti kullanarak küçük bir Petri kabına (35 mm) aktarın ve çevredeki çözeltinin mümkün olduğunca çoğunu çıkarın.
      NOT: Embriyo çözeltisinin çıkarılması paralitikin seyreltilmesini önler ve etkinliğini arttırır. Bir görev mendilinin köşesi, kalan embriyo çözeltisini yok etmek için kullanılabilir ve larvalara temas etmemek veya larvaları havaya maruz bırakmamak önemlidir.
   3. Larvaları yaklaşık 5 dakika boyunca% 0.1 α-bungarotoxin 10 μL'ye daldırın.
      NOT: Larvaları hareketsiz hale getirmek için gerekli süre preparatlar arasında değişir. Sağlıklı bir hazırlık, sürekli hızlı kan akışının ve azalan motor tepkilerin yakından izlenmesine bağlıdır. Paralitik için kısa bir aşırı pozlama, kapsamlı bir yıkamadan sonra bile preparatın genel sağlığında yavaş bir düşüşe neden olabilir. Larva tamamen hareketsiz hale gelmeden önce, hala ince kas titreşimleri belirtileri gösterirken bir yıkama uygulamak en iyisidir.
   4. Felçli larvaları hücre dışı çözelti ile yıkayın ve 10 dakika boyunca yıkayın.
      NOT: Yıkama, larvaların ince kas titreşimlerinden felci tamamlamak için geçişini sağlar. Ayrıca, α-bungarotoxin, bu protokolün gözlemlediği endojen geri bildirim devresinin kritik bir bileşeni olan nikotinik asetilkolin reseptörü (nAChR) α9-subunit'in bir antagonistidir; bununla birlikte, bu etkinin Xenopus ve zebra balığı saç hücrelerinde 10 dakikalık bir yıkamadan sonra geri döndürülebilir olduğu gösterilmiştir^36,29.
2. Balıkları kayıt kabına sabitle.
   NOT: Hayvan sağlığına müdahale ettiği için larva zebra balığı (4-7 dpf) hazırlanırken anestezi (örneğin MS-222, Tricaine) gerekli değildir. Aslında, larva zebra balıkları belirli omurgalı protokollerden muaftır.
   1. Transfer pipetini kullanarak larvaları hücre dışı çözelti banyosundan silikon tabanlı kayıt kabına taşıyın. Yemeğin geri kalanını hücre dışı çözelti ile doldurun.
   2. Bir stereomikroskop altında, larvaları silikon paspasın merkezinin üzerinde ince uçlu ön uçlarla, yanal tarafı yukarı doğru, vücudun ön ve arka uçları sırasıyla soldan sağa doğru akarak hafifçe yerleştirin. Daha sonra ince uçlu önpsler kullanarak silikon paspastan kazınmış bir pim kavrayın ve pimi, doğrudan anüse dorsal dorsal olmayan larvaların dorsal notochord'u aracılığıyla silikona ortogonal olarak yerleştirin. İkinci pimi kuyruğun ucuna yakın notochord'dan yerleştirin ve üçüncü pimi gaz mesanesinin notochord dorsalına yerleştirin (Şekil 1B).
      NOT: Pimler takarken, kan akışının engellenmesini veya çevredeki kas yapısına zarar vermesini önlemek için notochord genişliğinin merkezini hedeflemek önemlidir. Notochord arka lateral çizgi sinirine dorsaldır, bu nedenle uygun sabitleme ile yanal çizgi duyusal nöronlarında hasar beklenmez. Çevredeki dokuyu rahatsız etmemek için ilk temastan sonra yerleştirin. İdeal olarak, pimin çapı temiz yerleştirmeyi sağlamak için notochord'un genişliğinin yarısından daha azdır. Pimler bu genişliği aşarsa, istenen pim genişliği elde edilene kadar 1.2 adımını yineleyin. Sabitleme işleminden sonra kan akışı yavaşlarsa, 1.3.
   3. Dördüncü pimi otik veziklikten geçirin ve pim kapsüle yerleştirilirken ön kısma doğru hafif bir dönüş sağlar (Şekil 1B). Hafif bir dönüş uygulandığında, afferent somata kümesini ortaya çıkarmak için klatrorum ve otik vezikül arasındaki dokuyu izleyin.
      NOT: Dördüncü pimin açılı takılması, büyük otik veziklin tarafından engellenen arka yanal çizgi afferent ganglionun maruz kalmasını sağlamaktır.

4. Ventral kök kaydı

1. Sabitlenmiş larvaları sabit bir aşama diferansiyel girişim kontrastı (DIC) dik mikroskop üzerine 10x su daldırma hedefinin altına yerleştirin ve sol baş sahne yaklaşım vektörüne paralel olarak kas bloklarının myseptal yarıklarını yönlendirin (Şekil 1B).
   1. Optik hava tablasında yüzen sabit kademeli DIC mikroskop, titreşimlerin kayıtlara müdahale etmesini önlemek için en iyi sonucu sağlar. Motorlu bir pozisyoner kullanarak, mikroskop daha sonra preparatın ve başlık başlıklarının monte edildiği sabit aşama etrafında serbestçe hareket edebilir (Şekil 1C).
   2. Zemin telini banyo çözeltisine yerleştirin ve sol sahne başlığına bağlı olduğundan emin olun.
2. ESNEK jel yükleme pipet ucu kullanarak VR kayıt elektrodunu 30 μL hücre dışı çözelti ile doldurun ve sol baş kulis pipet tutucusuna yerleştirin.
3. Bir pnömatik dönüştürücü tarafından üretilen pozitif basınç (1-2 mmHg) uygularken kayıt pipetini bir mikromanipülatör ile bulaşık çözeltisine küçümseyin. 10x büyütme altında, uç diyaframının yönünün aşağı doğru olduğunu onaylayın.
   1. Pnömatik dönüştürücü, pipet tutucu bağlantı noktasına silikon boru ile bağlanmalıdır.
4. VR elektrotunun mioseptum üzerine yerleştirilmesi
   1. Mikromanipülatör'ü tekrar kullanarak, VR elektrot ucunu larva üzerinde pozisyon tutana kadar küçümseyin. Büyütmeyi 40x daldırma için artırın.
   2. Yarık VR elektrot ucu diyaframında ortalanana kadar elektrot ucunu iki miyomer ventral arasındaki bir mioseptum üzerinden yanal çizgiye getirin (Şekil 1D).
   3. Pipeti, uç diyaframın gecikme kenarı epitel ile hafifçe temas edene kadar küskünleyin. İlk temastan sonra, öndeki kenarın temas etmesini ve bir conta oluşturabilmesini sağlamak için pipeti çapraz olarak manevra yap.
   4. Pnömatik dönüştürücü ile negatif basınç (~100 mm Hg) uygulayın ve tutun.
      NOT: VR pipetinin mioseptum ve sürekli negatif basınca göre doğru yönlendirilir, motor nöron aktivitesinin cilt boyunca yüksek sinyal-gürültü oranıyla algılanmasını optimize eder.
5. Motor nöron aktivitesini tespit edin.
   1. Sol başlık amplifikatöre bağlanmalıdır, bu da güçlendirilmiş sinyali bitişik bir bilgisayarda izlenecek yama kelepçesi elektrofizyoloji yazılımına veren bir sayısallaştırıcıya aktarır (bkz. bölüm 1.4).
   2. Yama kelepçe yazılımında, VR sinyalini izlemek için araç çubuğundaki Oynat düğmesine tıklayın (Şekil 1E).
   3. İyi kalıplaşmış patlama sinyali dinamiklerine sahip motor nöron aktivitesi gözlendikten sonra VR kaydının sağlandığından emin olun^29,37 (Şekil 1E).
      NOT: Fiktif yüzme nöbetleri, hazırlığın felç olmasına rağmen iletmeye devam eden VR motor nöronlarının aktivite kalıplarıdır. Bu nedenle, fiktif yüzmeler, hayvanın davranışsal durumunu belirlemenin ve aynı zamanda hareketsiz bir hazırlık gerektiren afferent nöron kayıtlarını gerçekleştirirken lokomotor parametrelerini ölçmenin erişilebilir bir yoludur. Elimizde, bir VR kaydı elde edildikten sonra, sağlıklı bir hazırlık her birkaç saniyede bir gönüllü fiktif yüzme nöbetleri ortaya çıkarır. Unutmayın, sağlıklı bir hazırlık hızlı kan akışını sürdürüp sürdürebilir. Yeterli bir VR sinyali elde etmek birkaç dakika sürebilir ve ilk algılamadan sonra sinyal-gürültü oranı iyileşebilir. Zamanın yararına, bölüm 5'e geçmek kabul edilebilir.
   4. Bölüm 5 tamamlandıktan sonra bir VR kaydı hala sağlanamazsa, negatif basıncı bırakın, elektrodu yükseltin ve larva sağlığı hala en uygunsa, farklı bir mioseptum üzerinde 4.4.2 adımından itibaren tekrarlayın.

5. Afferent nöron kaydı

1. Farklı kayıt elektrotlarını 30 μL hücre dışı çözelti ile doldurun; sağ başpıt pipet tutucusuna(Şekil 1B,C)yerleştirin ve pnömatik dönüştürücü tarafından üretilen pozitif basınç (1-2 mm Hg) uygulanırken çanak çözeltisine küçümser.
2. Arka yanal çizgi afferent ganglion'un yerini bulun ve gevşek bir şekilde takın.
   1. Bir mikromanipülatör kullanarak, afferent elektrot ucunu klatronun üzerinde pozisyon tutana kadar küçümseyin.
   2. Büyütmeyi 40x daldırma için artırın ve arka lateral çizgi siniri ve klatromunun kesişimini bulun. Cleithrum'dan liflerin arka lateral çizgi afferent ganglionu içselleştirdiklerine kadar olan yanal çizgi sinir ön kısmını takip edin, soma ayrı kümesi ile ayırt edilebilir (Şekil 1F).
   3. Elektrot ucunu afferent ganglionun üzerine getirin ve uç epitelle temas edene kadar pipetleri küçümseyin. Yavaşça, elektrot manevrası yaparak tüm uç çevresinin afferent ganglionla temas ettiğini belirtin.
   4. Pnömatik dönüştürücü ile negatif basınç (20-50 mm Hg) uygulayın ve tutun.
      NOT: Afferent ganglion'a uygulanan negatif basınç, ventral kök kaydı sırasında uygulanan emişten daha yumuşaktır. Artan negatif basınç sinyalden gürültüye iyileştirebilir, ancak sürekli agresif emiş altında afferent nöron sağlığı azalır ve bu da başarılı bir kayıt olasılığını azaltır.
3. Afferent nöron aktivitesini kaydedin.
   1. Sağ başlığın 4.5.1 adımında açıklandığı gibi benzer bir sırayla bağlandığından emin olun.
   2. pClamp10'da, afferent nöron ve VR sinyalini aynı anda izlemek için araç çubuğundaki Oynat düğmesine tıklayın.
   3. Ani artışlar kendiliğinden meydana geldiğinde, kabaca her 100-200^ms1 ,²⁹ (Şekil 1E)olduğunda tüm^hücrenin,afferent nöronların gevşek yama kaydının elde edildiğinden emin olun.
   4. Yavaş yavaş, afferent nöron kayıt elektrot basıncını atmosferik (0 mm Hg) geriye doğru artırın ve kaydın geri kalanı için tutun.

6. Veri toplama

1. Eşzamanlı kayıt.
   1. Afferent nöron ve motor nöron aktivitesi tespit edildikten sonra, her iki kanalda da eşzamanlı boşluksuz kayıtları yakalamak için pClamp10'daki araç çubuğundaki Kaydet düğmesine tıklayın.
   2. İstediğiniz süre için kayıt (Şekil 1E).
      NOT: Sağlıklı bir hazırlıkta bir kayıt saatler sürebilir ve dış uyaranlara yanıt vermeye devam edebilir.
   3. Alma parametreleri gibi meta verileri korumak için kaydı desteklenen bir dosya türü (.abf, pClamp10) olarak kaydedin.

7. Ötenazi

1. Pnömatik dönüştürücüler kullanarak hem afferent hem de VR kayıt elektrotlarına pozitif basınç (10 mm Hg) uygulayın ve elektrotları mikromanipülatörleri kullanarak kayıt çanaktan yükseltin.
2. Kayıt çanağını sabit aşama DIC mikroskobundan diseksiyon stereomikroskopa aktarın.
3. İnce uçlu forseps kullanarak, tungsten pimlerini notochord ve otik kapsülden çıkarın ve larvaları bir transfer pipeti kullanarak en az 5 dakika boyunca 5 mL ötanazi çözeltisi içeren bir Petri kabına (35 mm) aktarın.

8. Ön işleme ve veri analizi

NOT: Veri ön işleme ve analizi, komut satırı kodlamasının temel bir anlayışını gerektirecektir.

1. Kayıt dosyasını ön işleme için dönüştürün.
   1. Matlab yazılımını yükleyin.
   2. Özel yazılı komut dosyası, abfload.m^{38'i indirin} ve dosyayı ham kayıt dosyasını depolayan klasöre kaydedin.
   3. Matlab Düzenleyicisi penceresinde, abfload.m açın ve araç çubuğunda Çalıştır'a tıklayın. İstenirse Klasörü Değiştir'i seçin.
   4. Komutun penceresindeki işlevi, ham kayıt dosyası giriş olarak yürütün,
      > [d,si,h] = abfload('[ham kayıt dosyası adı].abf')
      ve çıktı çalışma alanını larva ataması, yaş ve [örnek numarası]_[dpf'deki yaş]_[ham kayıt dosyası adı (varsayılan olarak deneysel tarih içerir)] gibi deneysel tarih içeren bir dosya adıyla kaydedin.
      NOT: Dönüştürülen dosya adı yalnızca alt çizgiyle belirtilen tamsayıları içermelidir.
2. Veri ön işleme gerçekleştirin.
   1. Matlab komut dosyası AffVR_preprocess.m ve yazarlar tarafından özel olarak yazılmış ilişkili işlevleri indirin.
   2. Düzenleyici penceresinde AffVR_preprocess.m açın.
   3. Değişkenleraltında, sinyal-gürültü oranının kaydına bağlı olarak hem afferent hem de VR kayıtları(sırasıyla spk_detect_lb ve vr_detect_lb, satır 8 ve 14) için alt sınır çivi algılama eşiklerini ayarlayın.
      NOT: Ani algılama, birden fazla farklı nörondan gelen sinyalleri genlik olarak sıralamak ve izole etmek için manuel eşiğe dayanır. Diğer birimlerin temel gürültüsü ve etkinliği, yalnızca maksimumun yüzde biri (örneğin, spk_detect_ub) içindeki ani genlikleri (örneğin, spk_detect_lb) içerecek şekilde eşikle filtrelenir. Eşikleme ayrıca motor aktivitesi ani artışlarının patlamalara ve kolektif fiktif yüzme sıçramalarına doğru bir şekilde binningsini sağlar. Genellikle, 0,5 eşik alt sınırı ile başlayın ve doğru algılama elde edilene kadar kademeli olarak azaltın. Örneğin, spk_detect_lb 0,5 ve spk_detect_ub 1,0 olarak ayarlamak, en fazla ani genlik sayısının %50'sine eşit veya daha büyük tüm ani artışları algılar ve gürültüyü veya daha düşük sivri genliklerdeki ek nöronları hariç tutar (Şekil 2A). Alternatif olarak, daha düşük başak genliklerinin nöronlarını izole etmek için daha yüksek spike genliklerinin nöronlarını dışlamak için spk_detect_ub 1.0'dan düşürebilme de olabilir. Ön işleme rakamı çıktıları (bkz. adım 7.2.6), ayarlamaların ve 7.2.2 adımından yinelemenin gerekli olup olmadığını bildirir.
   4. Düzenleyici penceresinde, AffVR_preprocess.m yürütmek için Çalıştır'ı tıklatın.
   5. Önceden dönüştürülmüş .mat veri dosyasına gidin (bkz. adım 7.1.3); seçin ve otomatik ön işleme başlamak için Aç'ı tıklatın.
      NOT: Özel komut dosyası çalışırken, "verileri filtreleme ...", "ventral kök etkinliğini algılama ..." ve "şekil oluşturma ..." gibi işleme adımları aracılığıyla ilerlemesini bildiren çıktılar Komut Penceresi'nde görünecektir.
   6. AffVR_preprocess.m tarafından oluşturulan şekiller, farklı ani yükselişi ve VR algılamayı görselleştirecek ve herhangi bir analiz değişkenin ayarlanıp ayarlanmayacağını gösterecektir (Şekil 2).
   7. Önceden işlenmiş meta verileri preprocess_output klasörüne kaydetmek için klavyeye "Y" girin.
   8. Önceden işlenmiş veriler otomatik olarak data_out.xlsolarak çıktısını alacaktır.
3. Önceden işlenmiş verileri istediğiniz gibi analiz edin.

Sonuçlar

Zebra balığı larvaları düzgün bir şekilde hareketsiz hale getirildikten ve arka lateral çizgi afferent ganglion ve VR kaydı elde edildikten sonra, hem afferent hem de motor nöronlardaki aktivite aynı anda ölçülebilir. Kayıt kanalları, kayıtsız ve VR etkinliğinin sürekli izlenmesi için boşluksuz kayıt protokolleri (adım 1.4) kullanılarak görüntülenir. Gerçek zamanlı olarak, spontan afferent ani artış oranındaki düşüşler, fiktif yüzme nöbetlerinin göstergesi olan VR aktivitesi ile e?...

Tartışmalar

Açıklanan deneysel protokol, sağlam ve neşeli bir omurgalıda motor davranışlar arasında duyusal girişteki endojen değişiklikleri izleme potansiyeli sağlar. Özellikle, larva zebra balıklarında yanal çizgi afferent nöronların ve ventral motor köklerinin eşzamanlı hücre dışı kayıtlarını gerçekleştirmeye yönelik in vivo bir yaklaşımı detaylandırıyor. Spontan afferent aktivite daha önce zebra balıklarında potansiyel eşzamanlı motor^{aktivitesi 1,}2 ,

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mL beaker	PYREX	1000	resceptacle for etchant
10x water immersion objective	Olympus	UMPLFLN10xW	low magnification for positioning larvae and recording electrode
40x water immersion objective	Olympus	LUMPLFLN40XW	higher magnification for position electrode tip and establishing patch-clamp
abfload.m		supplemental coding file	custom written MATLAB script for converting raw electrophysiology recordings to .mat files
AffVR_preprocess.m		supplemental coding file	custom written MATLAB script for preprocessing recording data
BNC coaxial cables	ThorLabs	2249-C-12	connecting amplifier and digitizer channels; require 4
borosilicate glass capillaries w/ filament	Warner Instruments	G150F-3	inner diameter: 0.86, outer diameter: 1.50; capillary glass used to form recording electrodes
burst_detect		supplemental coding file	custom written MATLAB function necessary to run AffVR_preprocess.m
computer	N/A	N/A	any computer should work
DC Power Supply	Tenma	72-420	used for electrically etching dissection pins
electrophysiology digitizer	Axon Instruments, Molecular Devices	Axon DigiData 1440A	enables acquisition of patch-clamp data
filament	Sutter Instrument Company	FB255B	2.5 mm box filament used in micropipette puller
fine forceps	Fine Science Tools	Dumont #5 (0.05 x 0.02 mm) Item No. 11295-10	used to manipulate larvae and insert pins
fixed stage DIC microscope	Olympus	BX51WI	microscope used to visualize and establish patch-clamp recordings
flexible, tapered pipette tip	Fisher Scientific	02-707-169	flexible tips enable insertion into recording electrode to dispense extracellular solution at the tip
FluoroDish	World Precision Instruments Inc.	FD3510-100	cover glass bottomed dish recording dish
KimWipe	KimTech	34155	task wipe used for wicking away excess fluid from larvae
Kwik-Gard	World Precision Instruments Inc.	710172	self-mixing sylgard elastomer
MATLAB	MathWorks	R2020b	command line software for preprocessing data
microelectrode amplifier	Axon Instruments, Molecular Devices	MultiClamp 700B	patch clamp amplifier for dual channel recordings
microforge	Narishige	MF-830 microforge	to polish recording electrode
micromanipulator control unit	Siskiyou	MC1000-eR/T	4-axis dial coordinator for controlling micromanipulator
micropipette puller	Sutter Instrument Company	Flaming/Brown P-97	for pulling capillary glass into recording electrodes
microscope control unit	Siskiyou	MC1000e	positions the microscope around the fixed stage and preparation
motorized micromanipulator	Siskiyou	MX7600	positions the headstage and attached recording electrode for patch-clamp recording
MultiClamp Commander	Molecular Devices	2.2.2	downloadable from Axon MultiClamp 700B Commander download page
optical air table	Newport Corporation	VH3036W-OPT	breadboard isolation table to float microscope and minimize vibrations during recordings
pCLAMP	Molecular Devices	10.7.0	downloadable from Axon pCLAMP 10 Electrophysiology Data Acquisition & Analysis Software Download page
permanent ink marker	Sharpie	order from amazon.com	for marking the leading edge side of the VR electrode to ensure proper orientation when inserting into pipette holder
petri-dish	Falcon	35-3001	used to immerse larvae in paralytic
pipette holder	Molecular Devices	1-HL-U	hold recording electrode and connect to the headstage
pneumatic transducer	Fluke Biomedical Instruments	DPM1B	for controlling recording electrode internal pressure
potassium hydroxide	Sigma-Aldrich	221473-25G	etchant for etching dissection pins
silicone tubing	Tygon	14-169-1A	tubing to connect pneumatic transducer to pipette holder
spike_detect		supplemental coding file	custom written MATLAB function necessary to run AffVR_preprocess.m
stereomicroscope	Carl Zeiss	Stemi 2000-C	used to visualize pin tips and during preparation of larvae
straight edge razor blade	Canopus	order from amazon.com	cuts the tungsten wire while making dissection pins
swimbout_detect		supplemental coding file	custom written MATLAB function necessary to run AffVR_preprocess.m
syringe	Becton Dickinson Compoany	309602	filled with extracellular solution to inject into recording electrodes
transfer pipette	Sigma-Aldrich	Z135003-500EA	single use, non-sterile pipette for transfering larvae
tricaine methanesulfonate	Syndel	12854	pharmaceutical aneasthetic used to euthanize larvae with high dosage.
tungsten wire	World Precision Instruments Inc.	715500	0.002 inch, 50.8 μm diameter; used to make dissection pins
vacuum filtration unit	Sigma-Aldrich	SCGVU11RE	single use, sterile, vacuum filtration units used to sterilize extracellular solution used for electrophysiology electrode ringer
voltage-clamp current-clamp headstage	Molecular Devices	CV-7B	supplied with MultiClamp 700B amplifier used as left and right headstages
α-bungarotoxin	ThermoFisher	B1601	for immobilizing the larvae prior to recording