Impresión 3D de microportadores de hidrogel in vitro mediante chorro de fuerza viscoso-inercial alternado

Resumen

Aquí se presenta una técnica de impresión 3D suave impulsada por fuerzas viscosas-inerciales alternas para permitir la construcción de microportadores de hidrogel. Las boquillas caseras ofrecen flexibilidad, lo que permite un fácil reemplazo para diferentes materiales y diámetros. Se pueden obtener y recolectar microportadores de unión celular con un diámetro de 50-500 μm para su posterior cultivo.

Resumen

Los microportadores son perlas con un diámetro de 60-250 μm y una gran superficie específica, que se utilizan comúnmente como portadores para cultivos celulares a gran escala. La tecnología de cultivo de microportadores se ha convertido en una de las principales técnicas en la investigación citológica y se utiliza comúnmente en el campo de la expansión celular a gran escala. También se ha demostrado que los microportadores desempeñan un papel cada vez más importante en la construcción de ingeniería de tejidos in vitro y la detección clínica de fármacos. Los métodos actuales para preparar microportadoras incluyen chips microfluídicos e impresión de inyección de tinta, que a menudo se basan en un diseño de canal de flujo complejo, una interfaz bifásica incompatible y una forma de boquilla fija. Estos métodos enfrentan los desafíos del procesamiento complejo de boquillas, cambios inconvenientes en las boquillas y fuerzas de extrusión excesivas cuando se aplican a múltiples biotintas. En este estudio, se aplicó una técnica de impresión 3D, llamada chorro de fuerza viscoso-inercial alterna, para permitir la construcción de microportadores de hidrogel con un diámetro de 100-300 μm. Posteriormente, las células se sembraron en microportadores para formar módulos de ingeniería de tejidos. En comparación con los métodos existentes, este método ofrece un diámetro de punta de boquilla libre, conmutación de boquilla flexible, control libre de los parámetros de impresión y condiciones de impresión suaves para una amplia gama de materiales bioactivos.

Introducción

Los microportadores son perlas con un diámetro de 60-250 μm y una gran superficie específica y se utilizan comúnmente para el cultivo a gran escala de ^células1,2. Su superficie externa proporciona abundantes sitios de crecimiento para las células, y el interior proporciona una estructura de soporte para la proliferación espacial. La estructura esférica también proporciona conveniencia en el monitoreo y control de parámetros, incluyendo pH, _O2 y concentración de nutrientes y metabolitos. Cuando se utilizan en combinación con biorreactores de tanque agitado, los microportadores pueden lograr densidades celulares más altas en un volumen relativamente pequeño en comparación con los cultivos convencionales, proporcionando así una forma rentable de lograr cultivos a gran ^escala3. La tecnología de cultivo de microportadores se ha convertido en una de las principales técnicas de investigación citológica, y se ha avanzado mucho en el campo de la expansión a gran escala de células madre, hepatocitos, condrocitos, fibroblastos y otras ^estructuras4. También se ha encontrado que son vehículos ideales de administración de fármacos y unidades de abajo hacia arriba, por lo que asumen un papel cada vez más importante en el cribado clínico de fármacos y la reparación de ingeniería de tejidos in vitro5.

Para cumplir con los requisitos de propiedad mecánica en diferentes escenarios, se han desarrollado múltiples tipos de materiales de hidrogel para su uso en la construcción de microportadoras6,7,8,9,10,11. Los hidrogeles de alginato y ácido hialurónico (HA) son dos de los materiales de microportadora más utilizados debido a su buena biocompatibilidad y reticulabilidad12,13. El alginato puede ser fácilmente reticulado por cloruro de calcio, y sus propiedades mecánicas pueden ser moduladas cambiando el tiempo de reticulación. La HA conjugada con tiramina está reticulada por el acoplamiento oxidativo de las partes de tiramina catalizadas por peróxido de hidrógeno y peroxidasa de rábano ^picante14. El colágeno, debido a su estructura espiral única y a su red de fibras reticuladas, se utiliza a menudo como adyuvante para mezclarse en los microportadores para promover aún más la unión ^celular15,16.

Los métodos actuales para preparar microportadores incluyen chips microfluídicos, impresión de inyección de tinta y electropulverización17,18,19,20,21,22,23. Se ha demostrado que los chips microfluídicos son rápidos y eficientes en la producción de microportadores de tamaño ^uniforme24. Sin embargo, esta tecnología se basa en un complejo proceso de diseño y fabricación de canales de ^flujo25. Las fuerzas de extrusión excesivas o de alta temperatura durante la impresión por inyección de tinta, así como los intensos campos eléctricos en el enfoque de electropulverización, pueden afectar negativamente las propiedades del material, especialmente su actividad ^biológica19. Además, cuando se aplican a varios biomateriales y diámetros, las boquillas personalizadas utilizadas en estos métodos dan como resultado una complejidad de procesamiento limitada, un alto costo y una baja flexibilidad.

Para proporcionar un método conveniente para la preparación de microportadores, se ha aplicado una técnica de impresión 3D llamada chorro de fuerzas viscosas-inerciales alternas (AVIFJ) para construir microportadores de hidrogel. La técnica utiliza fuerzas motrices hacia abajo y presión estática generada durante la vibración vertical para superar la tensión superficial de la punta de la boquilla y así formar gotas. En lugar de fuerzas severas y condiciones térmicas, pequeños desplazamientos rápidos actúan directamente sobre la boquilla durante la impresión, causando un efecto menor en las propiedades fisicoquímicas de la biotinta y presentando una gran atracción por los materiales bioactivos. Utilizando el método AVIFJ, se formaron con éxito microportadores de múltiples biomateriales con diámetros de 100-300 μm. Además, se demostró además que los microportadores se unen bien a las células y proporcionan un entorno de crecimiento adecuado para las células adheridas.

Protocolo

1. Cultivo celular

1. Complemente el Medio Esencial Mínimo Modificado (H-DMEM) modificado de Dulbecco con 10% de suero fetal bovino (FBS), 1% de solución de aminoácidos no esenciales (NEAA), 1% de penicilina G y estreptomicina, y 1% de suplemento de glutamina como medio de cultivo para células A549.
2. Cultivo de células A549 en incubadora de _CO2 a 37 °C y con 5% de _CO2
3. Disociar las células para el subcultivo utilizando tripsina en aproximadamente el 80% de confluencia.
   1. Use 3 ml de tripsina para tratar las células en el matraz de cultivo T75 a 37 °C durante 3 min, y luego agregue 6 ml de medio de cultivo para detener la tripsinización.
   2. Pipetear el medio de cultivo para cosechar células adheridas libremente.
   3. Centrífuga a 72,5 x g durante 3 min. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender con 3 ml de medio fresco.
   4. Transfiera 1 ml de suspensión celular a un nuevo matraz de cultivo T75 que contenga 10 ml de medio fresco. Cambie el medio de cultivo cada 2 días.

2. Preparación de boquillas

1. Cargue micropipetas de vidrio en el extractor siguiendo las instrucciones del fabricante. El diámetro exterior, el diámetro interior y la longitud de la tubería de microchorro son de 1,5 mm, 1,1 mm y 100 mm, respectivamente.
2. Establezca los parámetros de extracción para el extractor. Específicamente, los valores de CALOR, TRACCIÓN, VELOCIDAD, TIEMPO y PRESIÓN se establecen en 560, 255, 255, 150 y 500 de forma predeterminada, respectivamente. Retire la boquilla bajo estos parámetros.
   PRECAUCIÓN: La boquilla obtenida después de arrancar es muy afilada, y la operación descuidada puede causar lesiones.
3. Corte la boquilla resultante (paso 2.2) en el diámetro designado por un dispositivo de micro-forja siguiendo las instrucciones del fabricante para obtener un diámetro de punta específico. Específicamente, ubique el diámetro especificado de la boquilla en el cable de platino calentado. Calentar el cable hasta 60 °C durante unos 5 s y separar la boquilla.
4. Sumerja el cabezal de impresión de la boquilla en un agente hidrófobo durante 30 minutos, seguido de tres ciclos de enjuague con agua esterilizada.
5. Antes de imprimir, esterilizar la boquilla en alcohol durante 5 min y enjuagarla con agua esterilizada tres veces para eliminar el alcohol residual.

3. Preparación de biotinta de hidrogel

1. Disolver NaCl (0,45 g) en 50 ml de agua estéril para obtener una solución de NaCl al 0,9% (p/v). Vibrar la solución para promover la disolución. Después de disolverse completamente, filtre la solución a través de una membrana de filtro de tereftalato de polietileno de 0,45 μm.
2. Pesar el polvo de alginato de sodio de baja viscosidad (1 g) y disolverlo en 25 ml de solución de NaCl (paso 3.1) a una temperatura alta de 60-80 °C durante la noche para obtener una solución madre de alginato de sodio al 4% (p/v). La solución madre se puede almacenar a 4 °C durante 1 mes.
3. Esterilizar la solución madre de alginato de sodio (paso 3.2) calentándola tres veces en un horno (70 °C) durante 30 min.
4. Diluya el volumen adecuado de la solución madre de alginato de sodio (paso 3.3) en solución de NaCl al 0,9% (paso 3.1) a concentraciones de 2%, 1,5% y 0,5% (p/v).
   NOTA: Además del calentamiento en el horno, se deben llevar a cabo otros procesos de preparación de solución de alginato de sodio en la campana.
5. Disolver 1 g de gelatina en polvo en 25 ml de solución de NaCl (paso 3.1) a una temperatura alta de 60-80 °C durante la noche para obtener una solución madre de gelatina al 4% (p/v). La solución madre se puede almacenar a 4 °C durante 1 mes.
6. Esterilizar la solución madre de gelatina (paso 3.5) calentándola tres veces en un horno (70 °C) durante 30 min.
7. Diluir el volumen adecuado de solución madre de gelatina (paso 3.6) en solución de NaCl al 0,9% (paso 3.1) a una concentración del 1,5% (p/v).
   NOTA: Además del calentamiento en el horno, se deben llevar a cabo otros procesos de preparación de solución de gelatina en la campana.
8. Para promover la unión celular en los microportadores, prepare la solución de alginato-colágeno mezclando la solución de alginato de sodio al 2% (p/v) y la solución de colágeno tipo I de cola de rata (4 mg /ml) en una proporción de 3: 1. Ajuste la solución a pH 7.2 con una solución de NaOH de 0,1 M y úsela inmediatamente después de la preparación.
9. Disolver el sólido floculante de HA modificado con tirosina en solución salina tampón de fosfato (PBS) a 60-80 °C durante la noche para obtener una solución de PBS de ácido hialurónico modificado con tirosina al 0,8% en peso. La solución madre se puede almacenar a 4 °C durante 1 mes.
10. Esterilizar la solución de HA PBS modificada con tirosina calentándola tres veces en un horno (70 °C) durante 30 min.
11. Disolver la peroxidasa de rábano picante en polvo (500 unidades de actividad enzimática/mg) en solución de PBS para obtener 8 unidades de actividad enzimática/mg de solución de PBS de peroxidasa de rábano picante.
12. Diluir la solución de peróxido de hidrógeno (30%, p/p) por agua DI a 4 mM.
13. Prepare la solución modificada de ha-rábano picante peroxidasa mezclando la solución de PBS de ácido hialurónico modificado con tirosina y la solución de PBS de peroxidasa de rábano picante en una proporción de 1:1.
    NOTA: Además del calentamiento en el horno, se deben llevar a cabo otros procesos de preparación de la solución de peroxidasa de ha-rábano picante en la campana.

4. Formación de microgotas basadas en AVIFJ

1. Utilice un sistema de impresión celular establecido en el hogar como se informó anteriormente (Figura 1A)²⁶. La salida de señal eléctrica por el generador de forma de onda se amplifica primero y luego impulsa la cerámica piezoeléctrica para generar una deformación controlable. La boquilla fijada en la cerámica piezoeléctrica produce así vibraciones controlables.
2. Esterilice el sistema de impresión limpiando con alcohol al 75% (v / v) y exposición ultravioleta (UV) durante la noche.
3. Cargue 5 ml de biotinta (paso 3.1) en una jeringa estéril desechable. Instale la jeringa en la bomba de la jeringa.
4. Conecte la jeringa (paso 4.3) y la boquilla (paso 2.5) con una manguera de silicona de 1 mm de diámetro interior.
5. Fije la boquilla (paso 4.4) que se utilizará para imprimir ajustando la estanqueidad del tornillo de sujeción. Mantenga la punta de la boquilla alejada del sustrato durante la instalación para evitar daños y contaminación.
   PRECAUCIÓN: Si la boquilla se rompe durante la instalación, use guantes más gruesos y limpie cuidadosamente los fragmentos y residuos de vidrio.
6. Empuje rápidamente la bomba de la jeringa y cargue la biotinta (paso 4.3) en la boquilla (paso 4.5). Ajuste el caudal a 30 μL/min. Limpie el exceso de material en la punta.
7. Establezca los parámetros del generador de señales. Importe formas de onda de diseño propio que contengan 500.000 puntos de muestreo. Establezca la frecuencia de muestreo y el voltaje de pico a pico (Vpp) como 5 millones de muestras / s y 10 V, respectivamente.
8. Limpie toboganes o placas de Petri con agua desionizada. Colóquelos debajo de la boquilla como sustrato de impresión.
9. Preestablezca la trayectoria de movimiento y el modo de disparo de vibración como caída bajo demanda.
10. Imprima las gotas siguiendo los patrones prediseñados.

5. Formación de microportadores basados en AVIFJ

1. Repita los pasos 4.1-4.4, excepto cambiar la biotinta a solución de alginato al 2% (p/v) (paso 3.4), solución de alginato-colágeno (paso 3.8) o solución modificada de HA-rábano picante peroxidasa (paso 3.13).
2. Disolver 3 g de cloruro de calcio en 100 ml de agua estéril para obtener una solución de cloruro de calcio al 3% (p/v). Después de disolverse completamente, filtre la solución a través de una membrana de filtro de tereftalato de polietileno de 0,45 μm.
3. Añadir 5 ml de solución reticulatoria (solución de cloruro de calcio o solución de peróxido de hidrógeno) en una placa de Petri. Coloque la placa de Petri debajo de la boquilla para que funcione como sustrato.
4. Después de imprimir, reticular los microportadores durante 3 min.
5. Recoger la suspensión del microportador en un tubo de centrífuga y enriquecer los microportadores por centrifugación a 29 x g durante 3 min. Resuspendir los microportadores en medios de cultivo a aproximadamente 600 microportadores/ml.

6. Células inoculantes en la superficie de los microportadores

1. Teñir células A549 con Cell Tracker Green CMFDA para facilitar la observación de células. Específicamente, retire los medios de cultivo, agregue 5 ml de medio libre de suero que contenga un tinte Cell Tracker de 10 μM e incube las células durante 30 minutos en una incubadora. Luego, reemplace la solución de tinte con medio fresco.
2. Resuspend la suspensión de celdas A549 a la densidad de 1,6 x ¹⁰⁶ celdas/ml.
3. Agregue 1 ml de suspensión de microportador de alginato-colágeno (paso 5.3) y 1 ml de suspensión celular A549 (paso 6.1) en una placa de cultivo de 6 pocillos de baja adherencia.
4. Coloque la placa en un agitador a 30 rpm en una incubadora a 37 °C y 5% de _CO2.
5. Retire la placa de la coctelera y espere 30 minutos para dejar que las microportadoras se asienten. La mitad cambia el medio de cultivo cada 2 días.

7. Análisis de la formación de microgotas/microportadoras

1. Observe y mida la boquilla (paso 2.2), las placas de Petri (paso 4.10 y paso 5.4) y las células con microportadores (paso 6.5) bajo un microscopio de campo brillante o un microscopio confocal. Específicamente, el aumento objetivo es 4x, 10x o 20x y el aumento del ocular es 10x.
2. Mida el diámetro de los microportadores mediante el software ImageJ. De acuerdo con la barra de escala que viene con el microscopio al disparar en la imagen, establezca el tamaño real de la escala en ImageJ y dibuje 10 líneas del radio o semieje mayor de los microportadores. ImageJ puede obtener el tamaño promedio y la desviación estándar de estos segmentos de línea.

Resultados

Se fabricaron cabezales de impresión de variadas tasas de convergencia y diámetros para lograr la impresión de múltiples tipos de materiales. Las boquillas obtenidas con el aumento de la fuerza de tracción se muestran en la Figura 1B. Las boquillas se dividieron en tres áreas: reservorio (III), contracción (II) y cabezal de impresión (I). El depósito era la parte no procesada de la boquilla, en la que el líquido proporcionaba presión estática y entrada de biotinta para la impresi...

Discusión

El protocolo descrito aquí proporciona instrucciones para la preparación de múltiples tipos de microportadores de hidrogel y la posterior siembra celular. En comparación con los métodos de impresión de chip microfluídico y de inyección de tinta, el enfoque AVIFJ para construir microportadores ofrece una mayor flexibilidad y biocompatibilidad. Una boquilla independiente permite utilizar una amplia gama de boquillas ligeras, incluidas las micropipetas de vidrio, en estos sistemas de impresión. El procesamiento alt...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
A549 cells	ATCC	CCL-185	Human non-small cell lung cancer cell line
Bright field microscope	Olympus	DP70
Confocal microscope	Nikon	TI-FL
Fetal bovine serum, FBS	BI	04-001-1ACS
Gelatin	SIGMA	G1890
Glass micropipettes	sutter instrument	b150-110-10
GlutaMAX	GIBCO	35050-061
H-DMEM	GIBCO	11960-044	Dulbecco's modified eagle medium
Horseradish peroxidase powder	SIGMA	P6782
Hydrophobic agent	3M	PN7026	Follow the manufacturer's instructions and use after dilution
Micro-forge device	narishige	MF-900
Non-essential amino acids, NEAA	GIBCO	11140-050	non-essential amino acids
Penicillin G and streptomycin	GIBCO	15140-122
Petri dish	SIGMA	P5731-500EA
Puller	sutter instrument	P-1000
Sodium alginate	SIGMA	A0682
Trypsin	GIBCO	25200-056
Type I collagen solution from rat tail	SIGMA	C3867