Impression 3D de microporteurs d’hydrogel in vitro par jet de force visqueuse-inertielle alternée

Résumé

Présenté ici est une technique d’impression 3D douce entraînée par l’alternance de forces visqueuses-inertielles pour permettre la construction de microporteurs d’hydrogel. Les buses faites maison offrent une flexibilité, permettant un remplacement facile pour différents matériaux et diamètres. Des microtransporteurs de liaison cellulaire d’un diamètre de 50 à 500 μm peuvent être obtenus et collectés pour une culture ultérieure.

Résumé

Les microtransporteurs sont des billes d’un diamètre de 60 à 250 μm et d’une grande surface spécifique, qui sont couramment utilisées comme supports pour les cultures cellulaires à grande échelle. La technologie de culture par microtransporteur est devenue l’une des principales techniques de la recherche cytologique et est couramment utilisée dans le domaine de l’expansion cellulaire à grande échelle. Il a également été démontré que les microtransporteurs jouent un rôle de plus en plus important dans la construction d’ingénierie tissulaire in vitro et le dépistage clinique des médicaments. Les méthodes actuelles de préparation des microporteurs comprennent les puces microfluidiques et l’impression à jet d’encre, qui reposent souvent sur une conception complexe du canal d’écoulement, une interface biphasée incompatible et une forme de buse fixe. Ces méthodes sont confrontées aux défis du traitement complexe des buses, des changements de buse gênants et des forces d’extrusion excessives lorsqu’elles sont appliquées à plusieurs bioencres. Dans cette étude, une technique d’impression 3D, appelée projection de force visqueuse-inertielle alternée, a été appliquée pour permettre la construction de microporteuses en hydrogel d’un diamètre de 100 à 300 μm. Les cellules ont ensuite été ensemencées sur des microtransporteurs pour former des modules d’ingénierie tissulaire. Par rapport aux méthodes existantes, cette méthode offre un diamètre de pointe de buse libre, une commutation flexible de la buse, un contrôle libre des paramètres d’impression et des conditions d’impression douces pour une large gamme de matériaux bioactifs.

Introduction

Les microporteurs sont des billes d’un diamètre de 60 à 250 μm et d’une grande surface spécifique et sont couramment utilisées pour la culture à grande échelle de ^cellules1,2. Leur surface externe fournit des sites de croissance abondants pour les cellules, et l’intérieur fournit une structure de soutien pour la prolifération spatiale. La structure sphérique offre également une commodité dans la surveillance et le contrôle des paramètres, y compris le pH, l’O2 et la concentration de nutriments et de métabolites. Lorsqu’ils sont utilisés en combinaison avec des bioréacteurs à cuve agitée, les microtransporteurs peuvent atteindre des densités cellulaires plus élevées dans un volume relativement faible par rapport aux cultures conventionnelles, offrant ainsi un moyen rentable d’obtenir des cultures à grande ^échelle3. La technologie de culture par microtransporteur est devenue l’une des principales techniques de la recherche cytologique, et de nombreux progrès ont été réalisés dans le domaine de l’expansion à grande échelle des cellules souches, des hépatocytes, des chondrocytes, des fibroblastes et d’autres ^structures4. Ils se sont également avérés être des véhicules d’administration de médicaments idéaux et des unités ascendantes, jouant ainsi un rôle de plus en plus important dans le dépistage clinique des médicaments et la réparation de l’ingénierie tissulaire in vitro5.

Pour répondre aux exigences de propriétés mécaniques dans différents scénarios, plusieurs types de matériaux d’hydrogel ont été développés pour être utilisés dans la construction de microporteurs6,7,8,9,10,11. Les hydrogels d’alginate et d’acide hyaluronique (HA) sont deux des matériaux de microtransporteur les plus utilisés en raison de leur bonne biocompatibilité et de leur réticulabilité12,13. L’alginate peut être facilement réticulé par le chlorure de calcium, et ses propriétés mécaniques peuvent être modulées en modifiant le temps de réticulation. L’AH conjuguée à la tyramine est réticulée par le couplage oxydatif des fractions de tyramine catalysées par le peroxyde d’hydrogène et la peroxydase ^{de raifort14}. Le collagène, en raison de sa structure spirale unique et de son réseau de fibres réticulées, est souvent utilisé comme adjuvant pour se mélanger aux microtransporteurs afin de favoriser davantage l’attachement ^{cellulaire15,16}.

Les méthodes actuelles de préparation des microtransporteurs comprennent les puces microfluidiques, l’impression à jet d’encre et l’électropulvérisation17,18,19,20,21,22,23. Les puces microfluidiques se sont avérées rapides et efficaces dans la production de microporte-porteuses de taille ^uniforme24. Cependant, cette technologie repose sur un processus complexe de conception et de fabrication de canaux ^{d’écoulement25}. Des températures élevées ou des forces d’extrusion excessives lors de l’impression à jet d’encre, ainsi que des champs électriques intenses dans l’approche par électropulvérisation, peuvent nuire aux propriétés du matériau, en particulier à son activité ^biologique19. En outre, lorsqu’elles sont appliquées à divers biomatériaux et diamètres, les buses personnalisées utilisées dans ces méthodes entraînent une complexité de traitement limitée, un coût élevé et une faible flexibilité.

Pour fournir une méthode pratique pour la préparation des microtransporteurs, une technique d’impression 3D appelée jet de forces visqueuses-inertielles alternées (AVIFJ) a été appliquée pour construire des microporte-porteuses d’hydrogel. La technique utilise les forces motrices vers le bas et la pression statique générée lors de vibrations verticales pour surmonter la tension superficielle de la pointe de la buse et ainsi former des gouttelettes. Au lieu de forces sévères et de conditions thermiques, de petits déplacements rapides agissent directement sur la buse pendant l’impression, provoquant un effet mineur sur les propriétés physico-chimiques de la bioencre et présentant un grand attrait pour les matériaux bioactifs. En utilisant la méthode AVIFJ, des microtransporteurs de plusieurs biomatériaux d’un diamètre de 100 à 300 μm ont été formés avec succès. En outre, il a été prouvé que les microtransporteurs lient bien les cellules et fournissent un environnement de croissance approprié pour les cellules adhérentes.

Protocole

1. Culture cellulaire

1. Complétez le milieu essentiel minimum (H-DMEM) modifié de Dulbecco à haute teneur en glucose avec 10% de sérum fœtal bovin (FBS), 1% de solution d’acides aminés non essentiels (NEAA), 1% de pénicilline G et de streptomycine, et 1% de glutamine comme milieu de culture pour les cellules A549.
2. Culture de cellules A549 dans un incubateur à _CO2 à 37 °C et avec 5 % de _CO2
3. Dissocier les cellules pour la sous-culture en utilisant la trypsine à environ 80% de confluence.
   1. Utilisez 3 mL de trypsine pour traiter les cellules de la fiole de culture T75 à 37 °C pendant 3 min, puis ajoutez 6 mL de milieu de culture pour arrêter la trypsinisation.
   2. Pipettez le milieu de culture pour récolter les cellules faiblement adhérentes.
   3. Centrifuger à 72,5 x g pendant 3 min. Retirer le surnageant et remettre en suspension avec 3 mL de milieu frais.
   4. Transférer 1 mL de suspension cellulaire dans une nouvelle fiole de culture T75 contenant 10 mL de milieu frais. Changez le milieu de culture tous les 2 jours.

2. Préparation des buses

1. Chargez les micropipettes en verre sur le extracteur en suivant les instructions du fabricant. Le diamètre extérieur, le diamètre intérieur et la longueur du tuyau à micro-jet sont respectivement de 1,5 mm, 1,1 mm et 100 mm.
2. Définissez les paramètres de traction de l’extracteur. Plus précisément, les valeurs HEAT, PULL, VELOCITY, TIME et PRESSURE sont définies sur 560, 255, 255, 150 et 500 par défaut, respectivement. Retirez la buse sous ces paramètres.
   ATTENTION: La buse obtenue après le retrait est très tranchante et un fonctionnement imprudent peut causer des blessures.
3. Coupez la buse résultante (étape 2.2) au diamètre désigné à l’aide d’un dispositif de micro-forge en suivant les instructions du fabricant pour obtenir un diamètre de pointe spécifique. Plus précisément, localisez le diamètre spécifié de la buse sur le fil de platine chauffé. Chauffez le fil jusqu’à 60 °C pendant environ 5 s et écartez la buse.
4. Immergez la tête d’impression de la buse dans un agent hydrophobe pendant 30 min, suivie de trois cycles de rinçage à l’eau stérilisée.
5. Avant l’impression, stériliser la buse dans de l’alcool pendant 5 min et la rincer à l’eau stérilisée trois fois pour éliminer l’alcool résiduel.

3. Préparation de l’hydrogel bioink

1. Dissoudre le NaCl (0,45 g) dans 50 mL d’eau stérile pour obtenir une solution de NaCl à 0,9 % (p/v). Faire vibrer la solution pour favoriser la dissolution. Après avoir été complètement dissoute, filtrer la solution à travers une membrane filtrante en polyéthylène téréphtalate de 0,45 μm.
2. Peser la poudre d’alginate de sodium à faible viscosité (1 g) et la dissoudre dans 25 mL de solution de NaCl (étape 3.1) à une température élevée de 60-80 °C pendant la nuit pour obtenir une solution mère d’alginate de sodium à 4 % (p/v). La solution mère peut être conservée à 4 °C pendant 1 mois.
3. Stériliser la solution mère d’alginate de sodium (étape 3.2) en la chauffant trois fois dans un four (70 °C) pendant 30 min.
4. Diluer le volume approprié de la solution mère d’alginate de sodium (étape 3.3) dans une solution de NaCl à 0,9 % (étape 3.1) à des concentrations de 2 %, 1,5 % et 0,5 % (p/v).
   REMARQUE: En plus du chauffage au four, d’autres processus de préparation de la solution d’alginate de sodium doivent être effectués dans la hotte.
5. Dissoudre 1 g de poudre de gélatine dans 25 mL de solution de NaCl (étape 3.1) à haute température de 60-80 °C pendant la nuit pour obtenir une solution mère de gélatine à 4 % (p/v). La solution mère peut être conservée à 4 °C pendant 1 mois.
6. Stériliser la solution mère de gélatine (étape 3.5) en la chauffant trois fois au four (70 °C) pendant 30 min.
7. Diluer le volume approprié de solution mère de gélatine (étape 3.6) dans une solution de NaCl à 0,9 % (étape 3.1) à une concentration de 1,5 % (p/v).
   REMARQUE: En plus du chauffage au four, d’autres processus de préparation de la solution de gélatine doivent être effectués dans la hotte.
8. Pour favoriser la liaison cellulaire sur les microporteurs, préparer la solution d’alginate-collagène en mélangeant la solution d’alginate de sodium à 2 % (p/v) et la solution de collagène de type I de la queue de rat (4 mg/mL) dans un rapport de 3:1. Ajuster la solution à un pH de 7,2 avec une solution de NaOH de 0,1 M et l’utiliser immédiatement après la préparation.
9. Dissoudre le solide floculant HA modifié par la tyrosine dans une solution saline tampon phosphate (PBS) à 60-80 °C pendant la nuit pour obtenir une solution PBS d’acide hyaluronique modifiée à 0,8 % p/p. La solution mère peut être conservée à 4 °C pendant 1 mois.
10. Stériliser la solution HA PBS modifiée par la tyrosine en la chauffant trois fois dans un four (70 °C) pendant 30 min.
11. Dissoudre la poudre de peroxydase de raifort (500 unités d’activité enzymatique/mg) dans une solution de PBS pour obtenir 8 unités d’activité enzymatique/mg de solution de peroxydase PBS de raifort.
12. Diluer la solution de peroxyde d’hydrogène (30 %, p/p) par de l’eau DI à 4 mM.
13. Préparer la solution modifiée de peroxydase DE HA-raifort en mélangeant la solution d’acide hyaluronique PBS modifiée par la tyrosine et la solution de PEROXYDASE PBS de raifort dans un rapport de 1:1.
    REMARQUE: En plus du chauffage au four, d’autres processus de préparation de la solution de peroxydase DE RAIFORT doivent être effectués dans la hotte.

4. Formation de microgouttelettes basée sur AVIFJ

1. Utilisez un système d’impression cellulaire établi à domicile comme indiqué précédemment (Figure 1A)²⁶. La sortie du signal électrique par le générateur de forme d’onde est d’abord amplifiée, puis entraîne des céramiques piézoélectriques pour générer une déformation contrôlable. La buse fixée sur la céramique piézoélectrique produit ainsi des vibrations contrôlables.
2. Stérilisez le système d’impression en essuyant avec une exposition à 75% (v / v) à l’alcool et aux ultraviolets (UV) pendant la nuit.
3. Chargez 5 mL de bioencre (étape 3.1) dans une seringue stérile jetable. Installez la seringue sur la pompe à seringue.
4. Connectez la seringue (étape 4.3) et la buse (étape 2.5) avec un tuyau en silicone de 1 mm de diamètre intérieur.
5. Fixez la buse (étape 4.4) à utiliser pour l’impression en ajustant l’étanchéité de la vis de serrage. Gardez l’extrémité de la buse loin du substrat pendant l’installation pour éviter les dommages et la contamination.
   ATTENTION: Si la buse est cassée pendant l’installation, veuillez porter des gants plus épais et nettoyer soigneusement les fragments de verre et les résidus.
6. Poussez rapidement la pompe à seringue et chargez la bioencre (étape 4.3) sur la buse (étape 4.5). Réglez le débit à 30 μL/min. Essuyez l’excès de matière à la pointe.
7. Définissez les paramètres du générateur de signaux. Importez une forme d’onde auto-conçue contenant 500 000 points d’échantillonnage. Réglez la fréquence d’échantillonnage et la tension de crête à crête (Vpp) sur 5 millions d’échantillons/s et 10 V, respectivement.
8. Nettoyez les toboggans ou les boîtes de Petri avec de l’eau désionisée. Placez-les sous la buse comme substrat d’impression.
9. Préréglez la trajectoire de mouvement et le mode de déclenchement de la vibration en tant que goutte à la demande.
10. Imprimez les gouttelettes en suivant les motifs prédéfinis.

5. Formation de microporteurs basée sur AVIFJ

1. Répétez les étapes 4.1 à 4.4, sauf changer la bioencre en solution d’alginate à 2 % (p/v) (étape 3.4), en solution d’alginate-collagène (étape 3.8) ou en solution modifiée de peroxydase HA-raifort (étape 3.13).
2. Dissoudre 3 g de chlorure de calcium dans 100 mL d’eau stérile pour obtenir une solution de chlorure de calcium à 3 % (p/v). Après avoir été complètement dissoute, filtrer la solution à travers une membrane filtrante en polyéthylène téréphtalate de 0,45 μm.
3. Ajouter 5 mL de solution de réticulation (solution de chlorure de calcium ou solution de peroxyde d’hydrogène) dans une boîte de Pétri. Placez la boîte de Petri sous la buse pour qu’elle fonctionne comme substrat.
4. Après l’impression, reliez les microtransporteurs pendant 3 min.
5. Recueillir la suspension du microtransporteur dans un tube centrifuge et enrichir les microporteurs par centrifugation à 29 x g pendant 3 min. Remettre en suspension les microporteurs dans des milieux de culture à environ 600 microporteurs/mL.

6. Inoculation de cellules à la surface des microtransporteurs

1. Colorez les cellules A549 avec Cell Tracker Green CMFDA pour faciliter l’observation des cellules. Plus précisément, retirez les milieux de culture, ajoutez 5 mL de milieu sans sérum contenant 10 μM de colorant Cell Tracker et incubez les cellules pendant 30 minutes dans un incubateur. Ensuite, remplacez la solution de colorant par un milieu frais.
2. Remettre en suspension la suspension de cellules A549 à la densité de 1,6 x ¹⁰⁶ cellules/mL.
3. Ajouter 1 mL de suspension de microporteuse d’alginate-collagène (étape 5.3) et 1 mL de suspension cellulaire A549 (étape 6.1) dans une plaque de culture à 6 puits peu adhérente.
4. Placer la plaque sur un agitateur à 30 tr/min dans un incubateur à 37 °C et 5 % de _CO2.
5. Retirez l’assiette du shaker et attendez 30 minutes pour laisser les microporteurs s’installer. La moitié change le milieu de culture tous les 2 jours.

7. Analyse de la formation de microgouttelettes/microporteurs

1. Observez et mesurez la buse (étape 2.2), les boîtes de Petri (étape 4.10 et étape 5.4) et les cellules avec des microtransporteurs (étape 6.5) sous un microscope à champ lumineux ou un microscope confocal. Plus précisément, le grossissement de l’objectif est de 4x, 10x ou 20x et le grossissement de l’oculaire est de 10x.
2. Mesurez le diamètre des microporteuses par le logiciel ImageJ. Selon la barre d’échelle fournie avec le microscope lors de la prise de vue dans l’image, définissez la taille réelle de l’échelle dans ImageJ et dessinez 10 lignes du rayon ou du demi-grand axe des microporteurs. ImageJ peut obtenir la taille moyenne et l’écart-type de ces segments de ligne.

Résultats

Des têtes d’impression de taux de convergence et de diamètres variés ont été fabriquées pour obtenir l’impression de plusieurs types de matériaux. Les buses obtenues avec une résistance à la traction croissante sont illustrées à la figure 1B. Les buses ont été divisées en trois zones : réservoir (III), contraction (II) et tête d’impression (I). Le réservoir était la partie non traitée de la buse, dans laquelle le liquide fournissait une pression statique et une entr?...

Discussion

Le protocole décrit ici fournit des instructions pour la préparation de multi-types de microporteurs d’hydrogel et l’ensemencement cellulaire ultérieur. Par rapport aux méthodes d’impression à puce microfluidique et à jet d’encre, l’approche AVIFJ pour la construction de microporte-porteurs offre une plus grande flexibilité et biocompatibilité. Une buse indépendante permet d’utiliser une large gamme de buses légères, y compris des micropipettes en verre, dans ces systèmes d’impression. Le traite...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
A549 cells	ATCC	CCL-185	Human non-small cell lung cancer cell line
Bright field microscope	Olympus	DP70
Confocal microscope	Nikon	TI-FL
Fetal bovine serum, FBS	BI	04-001-1ACS
Gelatin	SIGMA	G1890
Glass micropipettes	sutter instrument	b150-110-10
GlutaMAX	GIBCO	35050-061
H-DMEM	GIBCO	11960-044	Dulbecco's modified eagle medium
Horseradish peroxidase powder	SIGMA	P6782
Hydrophobic agent	3M	PN7026	Follow the manufacturer's instructions and use after dilution
Micro-forge device	narishige	MF-900
Non-essential amino acids, NEAA	GIBCO	11140-050	non-essential amino acids
Penicillin G and streptomycin	GIBCO	15140-122
Petri dish	SIGMA	P5731-500EA
Puller	sutter instrument	P-1000
Sodium alginate	SIGMA	A0682
Trypsin	GIBCO	25200-056
Type I collagen solution from rat tail	SIGMA	C3867