점성-관성 포스 제팅을 번갈아 가며 생체외 하이드로겔 마이크로캐리어의 3D 프린팅

요약

하이드로겔 마이크로캐리어의 시공을 가능하게 하는 점성 관성력을 번갈아 가며 구동되는 온화한 3D 프린팅 기술이 여기에 제시되어 있다. 수제 노즐은 유연성을 제공하므로 다양한 재료와 직경을 쉽게 대체할 수 있습니다. 직경 50-500 μm의 세포 결합 마이크로 캐리어는 추가 배양을 위해 얻어서 수집할 수 있습니다.

초록

마이크로 캐리어는 직경 60-250 μm및 대규모 세포 배양을 위한 운반체로 일반적으로 사용되는 큰 특정 표면적을 가진 구슬입니다. 마이크로 캐리어 배양 기술은 세포 학 연구의 주요 기술 중 하나가되었으며 대규모 세포 확장 분야에서 일반적으로 사용됩니다. 마이크로 캐리어는 또한 체외 조직 엔지니어링 건설 및 임상 약물 선별에서 점점 더 중요한 역할을 하는 것으로 나타났습니다. 마이크로 캐리어를 준비하기위한 현재 의 방법은 종종 복잡한 흐름 채널 설계, 호환되지 않는 2 상 인터페이스 및 고정 노즐 모양에 의존하는 미세 유체 칩과 잉크젯 인쇄를 포함한다. 이러한 방법은 여러 바이오잉크에 적용될 때 복잡한 노즐 처리, 불편한 노즐 변경 및 과도한 압출력의 과제에 직면해 있습니다. 이 연구에서는, 번갈아 점성-관성 힘 제팅이라고 불리는 3D 프린팅 기법이 직경 100-300 μm의 하이드로겔 마이크로 캐리어의 건설을 가능하게 하기 위해 적용되었다. 세포는 이후에 조직 공학 모듈을 형성하기 위해 마이크로 캐리어에 시드되었다. 기존 방법에 비해 이 방법은 무료 노즐 팁 직경, 유연한 노즐 스위칭, 인쇄 파라미터의 자유로운 제어, 광범위한 생리활성 재료에 대한 가벼운 인쇄 조건을 제공합니다.

서문

마이크로 캐리어는 직경 60-250 μm및 큰 특정 표면적을 가진 구슬이며 일반적으로 세포의 대규모 배양에 사용된다^1,2. 그들의 외부 표면은 세포에 대한 풍부한 성장 부위를 제공하고, 내부는 공간 확산을위한 지원 구조를 제공합니다. 구형 구조는 또한 pH, _O2 및 영양소와 대사 산물의 농도를 포함한 파라미터를 모니터링하고 제어하는 데 편리함을 제공합니다. 교반탱크 생물반응기와 함께 사용하면 마이크로캐리어는 기존 배양에 비해 상대적으로 적은 부피로 더 높은 세포 밀도를 달성할 수 있어 대규모 배양^{3를 달성하는} 비용 효율적인 방법을 제공한다. 마이크로캐리어 배양 기술은 세포학 연구의 주요 기술 중 하나가 되었으며, 줄기세포, 간세포, 연골세포, 섬유아세포 및 ^{기타 구조물의} 대규모 확장 분야에서 많은 진전이 이루어지고 있다. 그(것)들은 또한 이상적인 약 납품 차량 및 상향식 단위로, 그러므로 임상 약 검열 및 체외 조직 공학 수리에 있는 점점 중요한 역할을 취하는 것으로 밝혀졌습니다^5.

다양한 시나리오에서 기계적 특성 요구 사항을 충족하기 위해 여러 유형의 하이드로겔 재료가 마이크로 캐리어 ^{6,7,8,9,10,11}의 건설에 사용하기 위해 개발되었습니다. 알기네이트와 히알루론산(HA) 하이드로겔은 생체 적합성과 교차 연결성 ^12,13로 인해 가장 많이 사용되는 마이크로캐리어 물질 중 두 가지입니다. 알기네이트는 염화칼슘에 의해 쉽게 교차 연결될 수 있으며, 그 기계적 특성은 교차 연결 시간을 변경하여 변조될 수 있다. 티라민-공주 HA는 과산화수소와 고추냉이 과산화기 과산화기과 고추냉이 과산화기과 고추냉이에 의해 촉매된 티라민 모에이티의 산화 결합에 의해 교차 연결^됩니다. 콜라겐은 독특한 나선형 구조와 교차 연결된 섬유 네트워크로 인해 종종 세포 부착을 촉진하기 위해 마이크로 캐리어에 혼합하는 보조체로 사용됩니다^15,16.

마이크로 캐리어를 준비하기위한 현재 의 방법은 미세 유체 칩을 포함, 잉크젯 인쇄, 및 전기 스프레이17,18,19,20,21,22,23. 미세 유체 칩은 균일한 크기의 마이크로 캐리어²⁴를 생산하는 데 빠르고 효율적인 것으로 입증되었습니다. 그러나 이 기술은 복잡한 흐름 채널 설계 및 제조 프로세스²⁵에 의존합니다. 잉크젯 인쇄 시 고온 또는 과도한 압출력뿐만 아니라 전기 스프레이 접근법에서 강렬한 전기장은 재료, 특히 생물학적 활성의 특성에 부정적인 영향을 미칠 수 있다¹⁹. 또한, 다양한 생체 재료와 직경에 적용될 때, 이러한 방법에 사용되는 맞춤형 노즐은 제한된 처리 복잡성, 높은 비용 및 낮은 유연성을 초래합니다.

마이크로캐리어 준비를 위한 편리한 방법을 제공하기 위해, 수레겔 마이크로캐리어를 시공하기 위해 점성-관성력 분사(AVIFJ)를 번갈아 하는 3D 프린팅 기술이 적용되었다. 이 기술은 수직 진동 중에 발생하는 하향 구동력과 정적 압력을 활용하여 노즐 팁의 표면 장력을 극복하고 물방울을 형성합니다. 가혹한 힘 및 열 조건 대신, 작은 급속한 변위는 인쇄 도중 노즐에 직접 작용하여 생잉크의 물리화학적 특성에 사소한 영향을 미치고 생리 활성 물질에 대한 큰 매력을 제시합니다. AVIFJ 방법을 활용하여 직경 100-300 μm의 다중 생체 재료의 마이크로 캐리어가 성공적으로 형성되었습니다. 게다가, 마이크로 캐리어는 세포를 잘 결합하고 부착 된 세포에 적합한 성장 환경을 제공하는 것이 더 입증되었다.

프로토콜

1. 세포 배양

1. 고혈당 덜벡코의 수정된 최소 필수 매체(H-DMEM)를 10% 태아소 혈청(FBS), 1% 비필수 아미노산 용액(NEAA), 1% 페니실린 G 및 연쇄절제술증, 1% 글루타민 보충제를 A549 세포배양매체로 보충한다.
2. 37°C에서 _CO2 인큐베이터에 있는 배양 A549 세포와 5% _CO2
3. 약 80%의 합류에서 트립신을 사용하여 하위 배양을 위한 세포를 해리합니다.
   1. 3mL의 트립신을 사용하여 T75 배양물에서 37°C에서 3분 동안 플라스크를 치료한 다음 배양 배지 6mL을 추가하여 트립시화를 중지합니다.
   2. 느슨하게 부착 된 세포를 수확하는 배양 배지를 피펫.
   3. 원심 분리기 는 72.5 x g 에서 3 분 동안. 상체를 제거하고 신선한 매체의 3mL로 다시 중단합니다.
   4. 1mL의 새로운 T75 배양 플라스크에 1mL의 세포 현탁액을 신선한 배지의 10mL를 함유한다. 2일마다 배양 매체를 변경합니다.

2. 노즐 준비

1. 제조업체의 지시에 따라 유리 마이크로 파이프를 풀러에 로드합니다. 마이크로 제트 파이프의 외부 직경, 내부 직경 및 길이는 각각 1.5mm, 1.1mm 및 100mm입니다.
2. 풀러에 대한 당기는 매개 변수를 설정합니다. 구체적으로, 열, 당기기, 속도, 시간 및 압력의 값은 기본적으로 각각 560, 255, 255, 150 및 500으로 설정됩니다. 이러한 매개 변수 에서 노즐을 당깁니다.
   주의: 이륙 후 얻은 노즐은 매우 날카롭고 부주의한 수술로 인해 부상을 입을 수 있습니다.
3. 제조업체의 지시에 따라 마이크로 포지 장치에 의해 지정된 직경에서 생성된 노즐(2.2단계)을 잘라 내어 특정 팁 직경을 얻습니다. 구체적으로, 가열 된 백금 와이어에 노즐의 지정된 직경을 찾습니다. 와이어를 약 5s에 대해 60 °C까지 가열하고 노즐을 분리합니다.
4. 노즐의 인쇄헤드를 소수성 제제에 30분 동안 담그고, 그 다음에는 멸균된 물로 헹구는 세 사이클을 제공합니다.
5. 인쇄하기 전에 노즐을 알코올로 5분 동안 살균하고 살균된 물로 세 번 헹구어 잔류 알코올을 제거합니다.

3. 하이드로겔 바이오잉크 준비

1. NaCl(0.45 g)을 멸균수 50mL에 녹여 0.9%(w/v) NaCl 용액을 얻습니다. 용해를 촉진하기 위해 솔루션을 진동합니다. 완전히 용해 된 후 0.45 μm 폴리에틸렌 테레프탈레이트 필터 멤브레인을 통해 용액을 필터링합니다.
2. 저점도 나트륨 알기네이트 분말(1g)을 계량하고 NaCl 용액(Step 3.1)의 25mL에 하룻밤 사이에 60-80°C의 고온에서 용해하여 4%(w/v) 나트륨 알기네이트 스톡 용액을 얻습니다. 스톡 용액은 1개월 동안 4°C로 보관할 수 있습니다.
3. 알긴산 나트륨 스톡 용액(3.2단계)을 오븐(70°C)에서 3회 가열하여 30분 간 살균한다.
4. 알기네이트 나트륨 재고 용액(3.3단계)을 0.9% NaCl 용액(3.1단계)으로 희석하여 2%, 1.5%, 0.5%(w/v)로 희석합니다.
   참고: 오븐에서 가열하는 것 외에도, 알기네이트 나트륨 용액의 다른 준비 과정은 후드에서 수행되어야 합니다.
5. 4%(w/v) 젤라틴 스톡 용액을 얻기 위해 하룻밤 사이에 60-80°C의 고온에서 NaCl 용액(Step 3.1)의 25mL에 젤라틴 분말 1g을 녹입니다. 스톡 용액은 1개월 동안 4°C로 보관할 수 있습니다.
6. 젤라틴 스톡 용액(3.5단계)을 오븐(70°C)에서 3회 가열하여 30분 간 살균한다.
7. 젤라틴 주식 용액의 적절한 부피(3.6단계)를 0.9% NaCl 용액(단계 3.1)으로 희석하여 1.5%(w/v)의 농도로 희석합니다.
   참고 : 오븐에서 가열하는 것 외에도 젤라틴 용액의 다른 준비 과정이 후드에서 수행되어야합니다.
8. 마이크로 캐리어에 세포 결합을 촉진하기 위해, 2 % (w /v) 나트륨 알기네이트 용액과 3 :1의 비율로 쥐 꼬리 (4 mg / mL)에서 타입 I 콜라겐 용액을 혼합하여 알지네이트 콜라겐 용액을 준비합니다. 0.1 M NaOH 솔루션으로 pH 7.2로 솔루션을 조정하고 준비 후 즉시 사용하십시오.
9. 티로신 변형 HA flocculent 고체인 인산완충식 살린(PBS) 용액을 하룻밤 사이에 60-80°C에서 용해하여 티로신 변형 히알루론산 PBS 용액을 0.8% w/w로 확보한다. 스톡 용액은 1개월 동안 4°C로 보관할 수 있습니다.
10. 30분 동안 오븐(70°C)에서 3회 가열하여 티로신 변형 HA PBS 용액을 살균한다.
11. PBS 용액에 고추냉이 과산화효소 분말(500효소 활성 단위/mg)을 용해하여 8개의 효소 활성 유닛/mg 고추냉이 과산화구체 PBS 용액을 확보한다.
12. 디워터에서 4mM로 과산화수소 용액(30%, w/w)을 희석시 희석시켰다.
13. 티로신 변형 히알루론산 PBS 용액과 고추냉이 과록시다제 PBS 용액을 1:1의 비율로 혼합하여 수정된 HA-고추냉이 과록시다제 용액을 준비한다.
    참고: 오븐에서 가열하는 것 외에도 HA-고추냉이 과산화제 용액의 다른 준비 과정이 후드에서 수행되어야 합니다.

4. AVIFJ를 기반으로 한 마이크로 드롭렛 형성

1. 이전에 보고된 대로 가정용 세포 인쇄 시스템을 사용합니다(그림 1A)²⁶. 파형 발생기의 전기 신호 출력은 먼저 증폭된 다음 압전 세라믹을 구동하여 제어 가능한 변형을 생성합니다. 압전 세라믹에 고정된 노즐은 제어 가능한 진동을 생성합니다.
2. 하룻밤 사이에 75%(v/v) 알코올및 자외선(UV)으로 닦아 인쇄 시스템을 살균합니다.
3. 일회용 멸균 주사기에 5mL의 바이오잉크(3.1단계)를 적재한다. 주사기 펌프에 주사기를 설치합니다.
4. 주사기(4.3단계) 및 노즐(2.5단계)을 내부 직경 1mm의 실리콘 호스와 연결합니다.
5. 클램핑 나사의 압박감을 조정하여 인쇄에 사용할 노즐(4.4단계)을 수정합니다. 노즐 의 끝은 손상과 오염을 방지하기 위해 설치 하는 동안 기판에서 멀리 유지.
   주의: 설치 중에 노즐이 파손된 경우 두꺼운 장갑을 착용하고 유리 조각과 잔류물을 조심스럽게 청소하십시오.
6. 주사기 펌프를 빠르게 밀어 노즐(4.5단계)에 바이오잉크(4.3단계)를 적재한다. 유량을 30 μL/분으로 설정합니다. 끝에 여분의 재료를 닦아.
7. 신호 발생기 매개 변수를 설정합니다. 500,000개의 샘플링 점을 포함하는 자체 설계 파형을 가져옵니다. 샘플링 속도와 피크-투-피크 전압(Vpp)을 각각 500만 개의 샘플/s 및 10V로 설정합니다.
8. 깨끗한 슬라이드 또는 탈온화 된 물로 페트리 요리. 노즐 아래에 인쇄 기판으로 놓습니다.
9. 모션 경로를 미리 설정하고 진동 모드를 주문형 드롭으로 트리거합니다.
10. 미리 설계된 패턴에 따라 액적을 인쇄합니다.

5. AVIFJ를 기반으로 하는 마이크로 캐리어 형성

1. 반복 단계 4.1-4.4, 바이오 잉크를 2% (w/v) 알기네이트 용액(단계 3.4), 알기네이트 콜라겐 용액(Step 3.8) 또는 수정된 HA-고추냉이 과록시다제 용액(step 3.13)으로 변경하는 것을 제외하고는.
2. 염화칼슘 3g을 멸균수 100mL에 녹여 3%(w/v) 염화칼슘 용액을 얻습니다. 완전히 용해 된 후 0.45 μm 폴리에틸렌 테레프탈레이트 필터 멤브레인을 통해 용액을 필터링합니다.
3. 5mL의 교차 연결 용액(염화칼슘 용액 또는 과산화수소 용액)을 페트리 접시에 넣습니다. 페트리 접시를 노즐 아래에 놓아 기판으로 작동합니다.
4. 인쇄 후 마이크로 캐리어를 3 분 동안 교차 연결합니다.
5. 원심분리기 튜브에서 마이크로캐리어 서스펜션을 수집하고, 3분 동안 29 x g 의 원심분리로 마이크로캐리어를 풍부하게 합니다. 약 600 마이크로 캐리어 / mL에서 문화 매체에서 마이크로 캐리어를 다시 중단합니다.

6. 마이크로 캐리어의 표면에 세포를 접종

1. 세포의 관찰을 용이하게 하기 위해 세포 추적기 녹색 CMFDA를 가진 스테인 A549 세포. 구체적으로, 배양 매체를 제거하고, 10 μM 셀 트래커 염료를 함유한 혈청 없는 배지 5mL를 추가하고, 인큐베이터에서 30분 동안 세포를 배양한다. 그런 다음 염료 용액을 신선한 매체로 대체합니다.
2. 1.6 x ¹⁰⁶ 세포/mL의 밀도로 A549 세포 현탁액을 다시 중단합니다.
3. 알기네이트 콜라겐 마이크로캐리어 서스펜션(Step 5.3)과 A549 세포 서스펜션(Step 6.1)의 1mL을 저부착 6웰 배양판에 넣습니다.
4. 플레이트를 37°C 및 5% _CO2의 인큐베이터에 30rpm에 셰이커에 놓습니다.
5. 셰이커에서 접시를 꺼내 마이크로 캐리어가 정착 할 때까지 30 분 기다립니다. 절반은 2일마다 배양 매체를 변경합니다.

7. 마이크로 드롭렛 /마이크로 캐리어 형성의 분석

1. 노즐(2.2단계), 페트리 접시(4.10 단계 및 단계 5.4), 미세 운반체(6.5단계)를 가진 세포를 관찰하고 측정하여 밝은 필드 현미경 또는 공초점 현미경으로 측정한다. 구체적으로, 객관적배율은 4배, 10배, 20배이고 접안의 배율은 10배이다.
2. ImageJ 소프트웨어로 마이크로 캐리어의 직경을 측정합니다. 사진에서 촬영할 때 현미경과 함께 제공되는 스케일 바에 따르면 ImageJ에서 스케일의 실제 크기를 설정하고 마이크로 캐리어의 반경 또는 반경 또는 반주요 축의 10 줄을 그립니다. ImageJ는 이러한 선 세그먼트의 평균 크기와 표준 편차를 얻을 수 있습니다.

결과

다양한 수렴속도와 직경의 인쇄헤드는 여러 유형의 재료의 인쇄를 달성하기 위해 제작되었습니다. 당김 강도가 증가하여 얻은 노즐은 도 1B에 도시된다. 노즐은 저수지(III), 수축(II), 프린트헤드(I)의 세 가지 영역으로 나뉘었다. 저수지는 노즐의 처리되지 않은 부분으로, 액체가 인쇄를 위한 정적 압력 및 생체 잉크 입력을 제공했습니다. 수축 지역은 하향 구동력을 생성하는...

토론

여기에 설명된 프로토콜은 다중 유형의 하이드로겔 마이크로 캐리어 및 후속 세포 파종의 제조를 위한 지침을 제공합니다. 미세 유체 칩 및 잉크젯 인쇄 방법에 비해 마이크로 캐리어를 구축하는 AVIFJ 접근 방식은 더 큰 유연성과 생체 적합성을 제공합니다. 독립적인 노즐은 유리 마이크로파이프를 포함한 다양한 경량 노즐을 이러한 인쇄 시스템에 사용할 수 있습니다. 제어성이 높은 처리는 저수...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
A549 cells	ATCC	CCL-185	Human non-small cell lung cancer cell line
Bright field microscope	Olympus	DP70
Confocal microscope	Nikon	TI-FL
Fetal bovine serum, FBS	BI	04-001-1ACS
Gelatin	SIGMA	G1890
Glass micropipettes	sutter instrument	b150-110-10
GlutaMAX	GIBCO	35050-061
H-DMEM	GIBCO	11960-044	Dulbecco's modified eagle medium
Horseradish peroxidase powder	SIGMA	P6782
Hydrophobic agent	3M	PN7026	Follow the manufacturer's instructions and use after dilution
Micro-forge device	narishige	MF-900
Non-essential amino acids, NEAA	GIBCO	11140-050	non-essential amino acids
Penicillin G and streptomycin	GIBCO	15140-122
Petri dish	SIGMA	P5731-500EA
Puller	sutter instrument	P-1000
Sodium alginate	SIGMA	A0682
Trypsin	GIBCO	25200-056
Type I collagen solution from rat tail	SIGMA	C3867