通过交替粘性 - 惯性力喷射进行 体外 水凝胶微载体的3D打印

摘要

这里介绍的是一种温和的3D打印技术，由交替的粘性惯性力驱动，以实现水凝胶微载体的构建。自制喷嘴具有灵活性，可轻松更换不同的材料和直径。可以获得直径为50-500μm的细胞结合微载体并收集以进行进一步培养。

摘要

微载体是直径为60-250μm且比表面积较大的微球，通常用作大规模细胞培养的载体。微载体培养技术已成为细胞学研究的主要技术之一，在大规模细胞扩增领域得到普遍应用。微载体也被证明 在体外 组织工程构建和临床药物筛选中发挥着越来越重要的作用。目前制备微载体的方法包括微流控芯片和喷墨打印，它们通常依赖于复杂的流道设计，不兼容的两相界面和固定的喷嘴形状。这些方法面临着复杂的喷嘴加工，不方便的喷嘴更换以及应用于多个生物墨水时挤出力过大的挑战。在这项研究中，应用了一种称为交替粘性 - 惯性力喷射的3D打印技术，以构建直径为100-300μm的水凝胶微载体。随后将细胞接种在微载体上以形成组织工程模块。与现有方法相比，该方法为各种生物活性材料提供了自由的喷嘴尖端直径，灵活的喷嘴切换，自由控制打印参数和温和的打印条件。

引言

微载体是直径为60-250μm，比表面积较大的微球，通常用于细胞的大规模培养^1，2。它们的外表面为细胞提供了丰富的生长位点，内部为空间增殖提供了支撑结构。球形结构还为监测和控制参数提供了便利，包括pH，_O2以及营养物质和代谢物的浓度。当与搅拌罐生物反应器结合使用时，与传统培养物相比，微载体可以在相对较小的体积内实现更高的细胞密度，从而为实现大规模培养提供了一种经济有效的方法³。微载体培养技术已成为细胞学研究的主要技术之一，在干细胞、肝细胞、软骨细胞、成纤维细胞和其他结构的大规模扩增领域取得了很大进展⁴。它们也被发现是理想的药物输送载体和自下而上的单位，因此在临床药物筛选和 体外 组织工程修复中发挥着越来越重要的作用⁵。

为了满足不同场景下的力学性能要求，开发了多种类型的水凝胶材料，用于微载体的建造^6，7，^{8，9，10，11}。海藻酸盐和透明质酸（HA）水凝胶是两种最常用的微载体材料，因为它们具有良好的生物相容性和交联性^12，13。海藻酸盐可以很容易地被氯化钙交联，其机械性能可以通过改变交联时间来调节。酪胺共轭HA通过过氧化氢和辣根过氧化物酶¹⁴催化的酪胺部分的氧化偶联而交联。胶原蛋白由于其独特的螺旋结构和交联纤维网络，经常被用作佐剂混合到微载体中，以进一步促进细胞附着^15，16。

目前制备微载体的方法包括微流控芯片，喷墨打印和电喷雾^{17，18，19，20，21，22，23}。微流控芯片已被证明在生产大小均匀的微载体方面具有快速高效的^特性24。然而，该技术依赖于复杂的流道设计和制造工艺²⁵。喷墨打印过程中的高温或过大的挤出力，以及电喷雾方法中的强电场，可能会对材料的性能产生不利影响，尤其是其生物活性¹⁹。此外，当应用于各种生物材料和直径时，这些方法中使用的定制喷嘴导致加工复杂性有限，成本高，灵活性低。

为了提供一种方便的微载体制备方法，应用了一种称为交替粘性惯性力喷射（AVIFJ）的3D打印技术来构建水凝胶微载体。该技术利用垂直振动过程中产生的向下驱动力和静压来克服喷嘴尖端的表面张力，从而形成液滴。在打印过程中，小的快速位移不是强烈的力和热条件，而是直接作用于喷嘴，对生物墨水的物理化学性质产生轻微影响，并对生物活性材料表现出极大的吸引力。利用AVIFJ方法，成功形成了直径为100-300 μm的多种生物材料的微载体。此外，微载体进一步证明可以很好地结合细胞，并为粘附的细胞提供合适的生长环境。

研究方案

1. 细胞培养

1. 用10%胎牛血清（FBS），1%非必需氨基酸溶液（NEAA），1%青霉素G和链霉素以及1%谷氨酰胺补充剂作为A549细胞的培养基补充高葡萄糖Dulbecco的改良最低必需培养基。
2. 在37°C和5_{%CO 2的CO2}培养箱中培养A549细胞
3. 解离细胞，使用胰蛋白酶以约80%汇合度进行传代培养。
   1. 使用3mL胰蛋白酶在37°C下处理T75培养瓶中的细胞3分钟，然后加入6mL培养基以停止胰蛋白酶消化。
   2. 移液培养基以收获松散粘附的细胞。
   3. 以72.5× g 离心3分钟。除去上清液，用3 mL新鲜培养基重悬。
   4. 将1mL细胞悬浮液转移到含有10mL新鲜培养基的新T75培养瓶中。每2天更换培养基。

2. 喷嘴的准备

1. 按照制造商的说明将玻璃微量移液器装载到拉拔器上。微射流管的外径、内径和长度分别为1.5 mm、1.1 mm和100 mm。
2. 设置拉拔器的拉取参数。具体而言，默认情况下，"热量"、"拉力"、"速度"、"时间"和"压力"的值分别设置为 560、255、255、150 和 500。在这些参数下拉出喷嘴。
   注意:拉开后获得的喷嘴非常锋利，不小心操作可能会造成伤害。
3. 按照制造商的说明，通过微锻造设备在指定直径处切断生成的喷嘴（步骤2.2），以获得特定的尖端直径。具体而言，将喷嘴的指定直径定位到加热的铂丝上。将电线加热至60°C约5秒，然后将喷嘴拉开。
4. 将喷嘴的打印头浸入疏水剂中30分钟，然后用灭菌水冲洗三个循环。
5. 印刷前，将喷嘴在酒精中灭菌5分钟，并用灭菌水冲洗三次，以除去残留的酒精。

3. 水凝胶生物墨水的制备

1. 将NaCl（0.45g）溶解到50mL无菌水中，以获得0.9%（w / v）NaCl溶液。振动溶液以促进溶解。完全溶解后，通过0.45μm聚对苯二甲酸乙二醇酯过滤膜过滤溶液。
2. 称取低粘度海藻酸钠粉末（1g），并将其溶解在25mL NaCl溶液（步骤3.1）中，在60-80°C的高温下过夜，以获得4%（w / v）海藻酸钠储备溶液。储备溶液可以在4°C下储存1个月。
3. 通过将海藻酸钠储备溶液（步骤3.2）在烤箱（70°C）中加热三次30分钟来灭菌。
4. 在0.9%NaCl溶液（步骤3.1）中以2%，1.5%和0.5%（w / v）的浓度稀释适当体积的海藻酸钠储备溶液（步骤3.3）。
   注意:除了在烘箱中加热外，海藻酸钠溶液的其他制备过程应在通风橱中进行。
5. 将1g明胶粉在25mL NaCl溶液（步骤3.1）中溶解，在60-80°C的高温下过夜，以获得4%（w / v）明胶储备溶液。储备溶液可以在4°C下储存1个月。
6. 通过在烤箱（70°C）中加热三次30分钟来灭菌明胶储备溶液（步骤3.5）。
7. 在0.9%NaCl溶液（步骤3.1）中以1.5%（w / v）的浓度稀释适当体积的明胶储备溶液（步骤3.6）。
   注意:除了在烘箱中加热外，明胶溶液的其他制备过程应在烟罩中进行。
8. 为了促进细胞在微载体上的结合，通过将2%（w / v）海藻酸钠溶液和来自大鼠尾巴的I型胶原溶液（4mg / mL）以3:1的比例混合来制备海藻酸盐 - 胶原溶液。用0.1 M NaOH溶液将溶液调节至pH 7.2，并在制备后立即使用。
9. 将酪氨酸修饰的HA絮状固体溶解在60-80°C的磷酸盐水缓冲盐水（PBS）溶液中过夜，得到0.8%w/w酪氨酸修饰的透明质酸PBS溶液。储备溶液可以在4°C下储存1个月。
10. 通过在烤箱（70°C）中加热三次30分钟来灭菌酪氨酸修饰的HA PBS溶液。
11. 将辣根过氧化物酶粉（500酶活性单位/mg）溶解在PBS溶液中，得到8个酶活性单位/mg辣根过氧化物酶PBS溶液。
12. 用去离子水稀释过氧化氢溶液（30%，w / w）至4mM。
13. 通过将酪氨酸修饰的透明质酸PBS溶液和辣根过氧化物酶PBS溶液以1:1的比例混合，制备修饰的HA-辣根过氧化物酶溶液。
    注意:除了在烤箱中加热外，HA-辣根过氧化物酶溶液的其他制备过程应在烟罩中进行。

4. 基于AVIFJ的微滴形成

1. 使用先前报告的家庭建立的电池打印系统（图1A）²⁶。波形发生器输出的电信号首先被放大，然后驱动压电陶瓷产生可控的变形。因此，固定在压电陶瓷上的喷嘴会产生可控的振动。
2. 通过用75%（v / v）酒精和紫外线（UV）暴露过夜来消毒印刷系统。
3. 将5毫升生物墨水（步骤3.1）装入一次性无菌注射器中。将注射器安装在注射器泵上。
4. 将注射器（步骤4.3）和喷嘴（步骤2.5）与内径为1 mm的硅胶软管连接。
5. 通过调整夹紧螺钉的密封度来固定用于打印的喷嘴（步骤4.4）。在安装过程中，保持喷嘴尖端远离基板，以避免损坏和污染。
   注意:如果喷嘴在安装过程中破裂，请戴上较厚的手套，并仔细清理玻璃碎片和残留物。
6. 快速推动注射泵并将生物墨水（步骤4.3）加载到喷嘴（步骤4.5）。将流速设置为30 μL/min。擦去尖端处多余的材料。
7. 设置信号发生器参数。导入包含500，000个采样点的自行设计的波形。将采样率和峰峰值电压（Vpp）分别设置为500万采样/秒和10 V。
8. 用去离子水清洁载玻片或培养皿。将它们放在喷嘴下作为印刷基材。
9. 将振动的运动路径和触发模式预设为按需下降。
10. 按照预先设计的图案打印液滴。

5. 基于AVIFJ的微载体形成

1. 重复步骤4.1-4.4，除了将生物墨水更换为2%（w / v）海藻酸盐溶液（步骤3.4），海藻酸盐胶原蛋白溶液（步骤3.8）或改良的HA-辣根过氧化物酶溶液（步骤3.13）。
2. 将3克氯化钙溶解到100毫升无菌水中，得到3%（w / v）氯化钙溶液。完全溶解后，通过0.45μm聚对苯二甲酸乙二醇酯过滤膜过滤溶液。
3. 将5mL交联溶液（氯化钙溶液或过氧化氢溶液）加入培养皿中。将培养皿放在喷嘴下方，作为基材工作。
4. 打印后，交联微载体3分钟。
5. 在离心管中收集微载体悬浮液，并通过以29× g 离心3分钟来富集微载体。将微载体重悬于培养基中约600微载体/mL。

6.在微载体表面接种细胞

1. 用细胞追踪器绿色CMFDA染色A549细胞，以促进细胞观察。具体而言，除去培养基，加入5mL含有10μM细胞追踪器染料的无血清培养基，并在培养箱中孵育细胞30分钟。然后，用新鲜培养基替换染料溶液。
2. 以1.6×^{10 6} 个细胞/mL的密度重悬A549细胞悬浮液。
3. 将1 mL海藻酸盐胶原蛋白微载体悬浮液（步骤5.3）和1 mL A549细胞悬浮液（步骤6.1）加入低粘附的6孔培养板中。
4. 将板以30rpm的速度放入37°C和5%CO ₂的培养箱中的振荡器上。
5. 将盘子从摇摇杯上取下，等待30分钟，让微型载体稳定下来。一半每2天更换一半培养基。

7. 微滴/微载体形成分析

1. 在明场显微镜或共聚焦显微镜下观察和测量喷嘴（步骤2.2），培养皿（步骤4.10和步骤5.4）和具有微载体的细胞（步骤6.5）。具体而言，物镜放大倍率为4倍、10倍或20倍，目镜放大倍率为10倍。
2. 通过ImageJ软件测量微载体的直径。根据图片中拍摄时显微镜随附的比例尺，在ImageJ中设置比例尺的实际尺寸，绘制微载体半径或半长轴的10条线。ImageJ可以得到这些线段的平均大小和标准偏差。

结果

制造了不同收敛速率和直径的打印头，以实现多种类型的材料的打印。随着拉力的增加而获得的喷嘴如图 1B所示。喷嘴分为三个区域:储液槽（III），收缩（II）和打印头（I）。储液罐是喷嘴的未加工部分，其中液体提供静压和生物墨水输入以进行打印。收缩区域是产生向下驱动力的主要部分。拉力对打印头有显著影响，显示出较低的收敛率和扩展的拉力。较窄和较长的打印...

讨论

这里描述的方案为制备多种类型的水凝胶微载体和随后的细胞接种提供了说明。与微流控芯片和喷墨打印方法相比，AVIFJ构建微载体的方法具有更大的灵活性和生物相容性。独立的喷嘴使各种轻质喷嘴（包括玻璃微量移液器）可用于这些印刷系统。高度可控的加工使储液器体积、内径和打印头形状等参数可以自由调整。此外，一次性喷嘴便于在多种材料之间切换进行灭菌，从而避免了重复使用的?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
A549 cells	ATCC	CCL-185	Human non-small cell lung cancer cell line
Bright field microscope	Olympus	DP70
Confocal microscope	Nikon	TI-FL
Fetal bovine serum, FBS	BI	04-001-1ACS
Gelatin	SIGMA	G1890
Glass micropipettes	sutter instrument	b150-110-10
GlutaMAX	GIBCO	35050-061
H-DMEM	GIBCO	11960-044	Dulbecco's modified eagle medium
Horseradish peroxidase powder	SIGMA	P6782
Hydrophobic agent	3M	PN7026	Follow the manufacturer's instructions and use after dilution
Micro-forge device	narishige	MF-900
Non-essential amino acids, NEAA	GIBCO	11140-050	non-essential amino acids
Penicillin G and streptomycin	GIBCO	15140-122
Petri dish	SIGMA	P5731-500EA
Puller	sutter instrument	P-1000
Sodium alginate	SIGMA	A0682
Trypsin	GIBCO	25200-056
Type I collagen solution from rat tail	SIGMA	C3867