Stampa 3D di microcarrier idrogel in vitro mediante getto alternato di forza viscosa-inerziale

Riepilogo

Qui viene presentata una lieve tecnica di stampa 3D guidata dall'alternanza di forze viscose-inerziali per consentire la costruzione di microcarrier in idrogel. Gli ugelli fatti in casa offrono flessibilità, consentendo una facile sostituzione di diversi materiali e diametri. I microcarrier leganti le cellule con un diametro di 50-500 μm possono essere ottenuti e raccolti per un'ulteriore coltivazione.

Abstract

I microcarrier sono perline con un diametro di 60-250 μm e una grande superficie specifica, che sono comunemente usati come vettori per colture cellulari su larga scala. La tecnologia di coltura del microcarrier è diventata una delle principali tecniche nella ricerca citologica ed è comunemente usata nel campo dell'espansione cellulare su larga scala. I microcarrier hanno anche dimostrato di svolgere un ruolo sempre più importante nella costruzione di ingegneria tissutale in vitro e nello screening clinico dei farmaci. I metodi attuali per la preparazione di microcarrier includono chip microfluidici e stampa a getto d'inchiostro, che spesso si basano su un complesso design del canale di flusso, un'interfaccia bifase incompatibile e una forma a ugello fisso. Questi metodi affrontano le sfide della complessa lavorazione degli ugelli, dei cambiamenti scomodi degli ugelli e delle forze di estrusione eccessive quando applicati a più bioink. In questo studio, è stata applicata una tecnica di stampa 3D, chiamata alternanza viscoso-inerziale a getto di forza, per consentire la costruzione di microcarrier idrogel con un diametro di 100-300 μm. Le cellule sono state successivamente seminate su microcarrier per formare moduli di ingegneria tissutale. Rispetto ai metodi esistenti, questo metodo offre un diametro libero della punta dell'ugello, commutazione flessibile dell'ugello, controllo libero dei parametri di stampa e condizioni di stampa miti per una vasta gamma di materiali bioattivi.

Introduzione

I microcarrier sono perline con un diametro di 60-250 μm e una grande superficie specifica e sono comunemente usati per la coltura su larga scala di ^cellule1,2. La loro superficie esterna fornisce abbondanti siti di crescita per le cellule e l'interno fornisce una struttura di supporto per la proliferazione spaziale. La struttura sferica offre anche praticità nel monitoraggio e nel controllo dei parametri, tra cui pH, _O2 e concentrazione di nutrienti e metaboliti. Se utilizzati in combinazione con bioreattori a serbatoio agitato, i microcarrier possono raggiungere densità cellulari più elevate in un volume relativamente piccolo rispetto alle colture convenzionali, fornendo così un modo economico per ottenere colture su larga ^scala3. La tecnologia di coltura di microcarrier è diventata una delle principali tecniche nella ricerca citologica e sono stati fatti molti progressi nel campo dell'espansione su larga scala di cellule staminali, epatociti, condrociti, fibroblasti e altre ^strutture4. Sono stati anche trovati come veicoli ideali per la somministrazione di farmaci e unità dal basso verso l'alto, assumendo quindi un ruolo sempre più importante nello screening clinico dei farmaci e nella riparazione in vitro dell'ingegneria tissutale5.

Per soddisfare i requisiti di proprietà meccanica in diversi scenari, sono stati sviluppati diversi tipi di materiali idrogel per l'uso nella costruzione di microcarrier6,7,8,9,10,11. Gli idrogel di alginato e acido ialuronico (HA) sono due dei materiali microvettori più utilizzati grazie alla loro buona biocompatibilità e ^{reticolabilità12,13}. L'alginato può essere facilmente reticolato dal cloruro di calcio e le sue proprietà meccaniche possono essere modulate modificando il tempo di reticolazione. L'HA coniugato con tiramina è reticolato dall'accoppiamento ossidativo di porzioni di tiramina catalizzate da perossido di idrogeno e perossidasi di ^rafano14. Il collagene, grazie alla sua struttura a spirale unica e alla rete di fibre reticolate, viene spesso utilizzato come coadiuvante da miscelare nei microcarrier per promuovere ulteriormente l'attaccamento ^{cellulare15,16}.

I metodi attuali per la preparazione di microcarrier includono chip microfluidici, stampa a getto d'inchiostro ed elettrospray17,18,19,20,21,22,23. I chip microfluidici hanno dimostrato di essere veloci ed efficienti nella produzione di microcarrier di dimensioni ^uniformi24. Tuttavia, questa tecnologia si basa su un complesso processo di progettazione e fabbricazione del canale di ^flusso25. Le alte temperature o le eccessive forze di estrusione durante la stampa a getto d'inchiostro, così come i campi elettrici intensi nell'approccio elettrospray, possono influire negativamente sulle proprietà del materiale, in particolare sulla sua attività ^biologica19. Inoltre, se applicati a vari biomateriali e diametri, gli ugelli personalizzati utilizzati in questi metodi si traducono in una complessità di lavorazione limitata, costi elevati e bassa flessibilità.

Per fornire un metodo conveniente per la preparazione del microcarrier, è stata applicata una tecnica di stampa 3D chiamata alternanza di forze viscose-inerziali (AVIFJ) per costruire microcarrier idrogel. La tecnica utilizza le forze motrici verso il basso e la pressione statica generata durante la vibrazione verticale per superare la tensione superficiale della punta dell'ugello e quindi formare goccioline. Invece di forze severe e condizioni termiche, piccoli spostamenti rapidi agiscono direttamente sull'ugello durante la stampa, causando un effetto minore sulle proprietà fisico-chimiche del bioink e presentando una grande attrazione per i materiali bioattivi. Utilizzando il metodo AVIFJ, sono stati formati con successo microcarrier di più biomateriali con diametri di 100-300 μm. Inoltre, i microcarrier hanno ulteriormente dimostrato di legare bene le cellule e fornire un ambiente di crescita adatto per le cellule aderenti.

Protocollo

1. Coltura cellulare

1. Integrare il mezzo essenziale minimo modificato (H-DMEM) di Dulbecco ad alto contenuto di glucosio con il 10% di siero bovino fetale (FBS), l'1% di soluzione di aminoacidi non essenziali (NEAA), l'1% di penicillina G e streptomicina e l'1% di integratore di glutammina come terreno di coltura per le cellule A549.
2. Coltura di cellule A549 in un incubatore a _CO2 a 37 °C e con _co2 al 5%
3. Dissociare le cellule per la sottocoltura usando la tripsina a circa l'80% di confluenza.
   1. Utilizzare 3 mL di tripsina per trattare le cellule nel matraccio di coltura T75 a 37 °C per 3 minuti, quindi aggiungere 6 mL di terreno di coltura per interrompere la tripsinizzazione.
   2. Pipettare il terreno di coltura per raccogliere le cellule liberamente aderenti.
   3. Centrifuga a 72,5 x g per 3 min. Rimuovere il surnatante e risospese con 3 mL di mezzo fresco.
   4. Trasferire 1 mL di sospensione cellulare in un nuovo matraccio di coltura T75 contenente 10 mL di terreno fresco. Cambia il mezzo culturale ogni 2 giorni.

2. Preparazione degli ugelli

1. Caricare micropipette di vetro sull'estrattore seguendo le istruzioni del produttore. Il diametro esterno, il diametro interno e la lunghezza del tubo micro-jet sono rispettivamente di 1,5 mm, 1,1 mm e 100 mm.
2. Impostate i parametri di trazione per l'estrattore. In particolare, i valori di CALORE, TRAZIONE, VELOCITÀ, TEMPO e PRESSIONE sono impostati rispettivamente su 560, 255, 255, 150 e 500 per impostazione predefinita. Estrarre l'ugello in base a questi parametri.
   ATTENZIONE: L'ugello ottenuto dopo la staccatura è molto affilato e un'operazione incurante può causare lesioni.
3. Tagliare l'ugello risultante (punto 2.2) al diametro designato da un dispositivo di microforgia seguendo le istruzioni del produttore per ottenere un diametro specifico della punta. In particolare, individuare il diametro specificato dell'ugello sul filo di platino riscaldato. Riscaldare il filo fino a 60 °C per circa 5 s e separare l'ugello.
4. Immergere la testina di stampa dell'ugello in un agente idrofobo per 30 minuti, seguito da tre cicli di risciacquo con acqua sterilizzata.
5. Prima della stampa, sterilizzare l'ugello in alcool per 5 minuti e risciacquarlo con acqua sterilizzata tre volte per rimuovere l'alcol residuo.

3. Preparazione di idrogel bioink

1. Sciogliere NaCl (0,45 g) in 50 ml di acqua sterile per ottenere una soluzione di NaCl allo 0,9% (p/v). Vibrare la soluzione per favorire la dissoluzione. Dopo essere stato completamente sciolto, filtrare la soluzione attraverso una membrana filtrante in polietilene tereftalato da 0,45 μm.
2. Pesare polvere di alginato di sodio a bassa viscosità (1 g) e scioglierla in 25 mL di soluzione di NaCl (fase 3.1) ad una temperatura elevata di 60-80 °C durante la notte per ottenere una soluzione madre di alginato di sodio al 4% (p/v). La soluzione madre può essere conservata a 4 °C per 1 mese.
3. Sterilizzare la soluzione madre di alginato di sodio (fase 3.2) riscaldandola tre volte in forno (70 °C) per 30 min.
4. Diluire il giusto volume di soluzione madre di alginato di sodio (fase 3.3) in soluzione di NaCl allo 0,9% (fase 3.1) a concentrazioni del 2%, 1,5% e 0,5% (p/v).
   NOTA: Oltre al riscaldamento nel forno, altri processi di preparazione della soluzione di alginato di sodio devono essere eseguiti nella cappa.
5. Sciogliere 1 g di gelatina in polvere in 25 mL di soluzione di NaCl (fase 3.1) ad una temperatura elevata di 60-80 °C durante la notte per ottenere una soluzione madre di gelatina al 4% (p/v). La soluzione madre può essere conservata a 4 °C per 1 mese.
6. Sterilizzare la soluzione madre di gelatina (fase 3.5) riscaldandola tre volte in forno (70 °C) per 30 minuti.
7. Diluire il giusto volume di soluzione madre di gelatina (fase 3.6) in soluzione di NaCl allo 0,9% (fase 3.1) ad una concentrazione dell'1,5% (p/v).
   NOTA: Oltre al riscaldamento in forno, altri processi di preparazione della soluzione di gelatina devono essere eseguiti nella cappa.
8. Per promuovere il legame cellulare sui microcarrier, preparare la soluzione di alginato-collagene mescolando la soluzione di alginato di sodio al 2% (p/v) e la soluzione di collagene di tipo I dalla coda di ratto (4 mg/ml) in un rapporto di 3:1. Regolare la soluzione a pH 7,2 con soluzione naOH da 0,1 M e utilizzare immediatamente dopo la preparazione.
9. Sciogliere il solido flocculante HA modificato con tirosina in soluzione salina tampone fosfato (PBS) a 60-80 °C durante la notte per ottenere una soluzione PBS di acido ialuronico modificata con tirosina allo 0,8%. La soluzione madre può essere conservata a 4 °C per 1 mese.
10. Sterilizzare la soluzione di HA PBS modificata con tirosina riscaldandola tre volte in forno (70 °C) per 30 min.
11. Sciogliere la perossidasi di rafano in polvere (500 unità di attività enzimatica/mg) in soluzione di PBS per ottenere 8 unità di attività enzimatica/mg di soluzione PBS di perossidasi di rafano.
12. Soluzione diluita di perossido di idrogeno (30%, p/p) mediante acqua DI a 4 mM.
13. Preparare la soluzione modificata di HA-rafano perossidasi mescolando la soluzione PBS di acido ialuronico modificato con tirosina e la soluzione PBS di perossidasi di rafano in un rapporto di 1:1.
    NOTA: Oltre al riscaldamento in forno, altri processi di preparazione della soluzione di perossidasi di RAFANO HA devono essere eseguiti nella cappa.

4. Formazione di microgoccioline basate su AVIFJ

1. Utilizzare un sistema di stampa cellulare stabilito in casa come precedentemente riportato (Figura 1A)²⁶. L'uscita del segnale elettrico da parte del generatore di forme d'onda viene prima amplificata e quindi aziona la ceramica piezoelettrica per generare una deformazione controllabile. L'ugello fissato sulla ceramica piezoelettrica produce quindi vibrazioni controllabili.
2. Sterilizzare il sistema di stampa pulendo con il 75% (v/v) di alcol e l'esposizione ai raggi ultravioletti (UV) durante la notte.
3. Caricare 5 mL di bioink (fase 3.1) in una siringa sterile monouso. Installare la siringa sulla pompa della siringa.
4. Collegare la siringa (punto 4.3) e l'ugello (punto 2.5) con un tubo in silicone di 1 mm di diametro interno.
5. Fissare l'ugello (passaggio 4.4) da utilizzare per la stampa regolando la tenuta della vite di serraggio. Tenere la punta dell'ugello lontano dal substrato durante l'installazione per evitare danni e contaminazioni.
   ATTENZIONE: Se l'ugello è rotto durante l'installazione, indossare guanti più spessi e pulire accuratamente frammenti e residui di vetro.
6. Spingere rapidamente la pompa della siringa e caricare il bioink (punto 4.3) sull'ugello (passaggio 4.5). Impostare la portata a 30 μL/min. Pulire il materiale in eccesso sulla punta.
7. Impostare i parametri del generatore di segnale. Importa una forma d'onda auto-progettata contenente 500.000 punti di campionamento. Impostare la frequenza di campionamento e la tensione da picco a picco (Vpp) rispettivamente su 5 milioni di campioni/s e 10 V.
8. Pulire scivoli o piastre di Petri con acqua deionizzata. Posizionali sotto l'ugello come substrato di stampa.
9. Preimpostare il percorso di movimento e attivare la modalità di vibrazione come drop-on-demand.
10. Stampare le goccioline seguendo i modelli pre-progettati.

5. Formazione di microcarrier basati su AVIFJ

1. Ripetere i passaggi 4.1-4.4, tranne cambiare il bioink in soluzione di alginato al 2% (p/v) (fase 3.4), soluzione di alginato-collagene (fase 3.8) o soluzione modificata di perossidasi di HA-rafano (fase 3.13).
2. Sciogliere 3 g di cloruro di calcio in 100 ml di acqua sterile per ottenere una soluzione di cloruro di calcio al 3% (p/v). Dopo essere stato completamente sciolto, filtrare la soluzione attraverso una membrana filtrante in polietilene tereftalato da 0,45 μm.
3. Aggiungere 5 mL di soluzione reticolante (soluzione di cloruro di calcio o soluzione di perossido di idrogeno) in una capsula di Petri. Posizionare la capsula di Petri sotto l'ugello per lavorare come substrato.
4. Dopo la stampa, collegare i microcarrier per 3 min.
5. Raccogliere la sospensione di microcarrier in un tubo di centrifuga e arricchire i microcarrier mediante centrifugazione a 29 x g per 3 min. Sospendere i microcarrier in terreni di coltura a circa 600 microcarrier/mL.

6. Cellule inoculanti sulla superficie dei microcarrier

1. Stain A549 celle con Cell Tracker Green CMFDA per facilitare l'osservazione delle cellule. In particolare, rimuovere i terreni di coltura, aggiungere 5 ml di terreno privo di siero contenente colorante Cell Tracker da 10 μM e incubare le cellule per 30 minuti in un'incubatrice. Quindi, sostituire la soluzione colorante con un mezzo fresco.
2. Sospendere nuovamente la sospensione cellulare A549 alla densità di 1,6 x ¹⁰⁶ celle/ml.
3. Aggiungere 1 mL di sospensione di microcarrier alginato-collagene (fase 5.3) e 1 mL di sospensione cellulare A549 (fase 6.1) in una piastra di coltura a 6 pozzetti a bassa aderenza.
4. Posizionare la piastra su uno shaker a 30 giri/min in un incubatore a 37 °C e al 5% di _CO2.
5. Togliere la piastra dallo shaker e attendere 30 minuti per lasciare che i microcarrier si depositino. La metà cambia il mezzo di coltura ogni 2 giorni.

7. Analisi della formazione di microgoccioline/microcarrier

1. Osservare e misurare l'ugello (passo 2.2), le piastre di Petri (passo 4.10 e passo 5.4) e le cellule con microcarrier (passo 6.5) al microscopio a campo luminoso o al microscopio confocale. In particolare, l'ingrandimento dell'obiettivo è 4x, 10x o 20x e l'ingrandimento dell'oculare è 10x.
2. Misurare il diametro dei microcarrier con il software ImageJ. Secondo la barra della scala fornita con il microscopio durante le riprese nell'immagine, impostare la dimensione effettiva della scala in ImageJ e disegnare 10 linee del raggio o del semiasse maggiore dei microcarrier. ImageJ può ottenere la dimensione media e la deviazione standard di questi segmenti di linea.

Risultati

Testine di stampa di vari tassi di convergenza e diametri sono state fabbricate per ottenere la stampa di più tipi di materiali. Gli ugelli ottenuti con una forza di trazione crescente sono mostrati nella Figura 1B. Gli ugelli sono stati divisi in tre aree: serbatoio (III), contrazione (II) e testina di stampa (I). Il serbatoio era la parte non elaborata dell'ugello, in cui il liquido forniva pressione statica e input bioink per la stampa. L'area di contrazione era la parte principale per g...

Discussione

Il protocollo qui descritto fornisce istruzioni per la preparazione di multi-tipi di microcarrier idrogel e la successiva semina cellulare. Rispetto ai metodi di stampa a chip microfluidico e a getto d'inchiostro, l'approccio AVIFJ alla costruzione di microcarrier offre maggiore flessibilità e biocompatibilità. Un ugello indipendente consente di utilizzare in questi sistemi di stampa un'ampia gamma di ugelli leggeri, tra cui micropipette di vetro. L'elaborazione altamente controllabile consente di regolare liberamente ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
A549 cells	ATCC	CCL-185	Human non-small cell lung cancer cell line
Bright field microscope	Olympus	DP70
Confocal microscope	Nikon	TI-FL
Fetal bovine serum, FBS	BI	04-001-1ACS
Gelatin	SIGMA	G1890
Glass micropipettes	sutter instrument	b150-110-10
GlutaMAX	GIBCO	35050-061
H-DMEM	GIBCO	11960-044	Dulbecco's modified eagle medium
Horseradish peroxidase powder	SIGMA	P6782
Hydrophobic agent	3M	PN7026	Follow the manufacturer's instructions and use after dilution
Micro-forge device	narishige	MF-900
Non-essential amino acids, NEAA	GIBCO	11140-050	non-essential amino acids
Penicillin G and streptomycin	GIBCO	15140-122
Petri dish	SIGMA	P5731-500EA
Puller	sutter instrument	P-1000
Sodium alginate	SIGMA	A0682
Trypsin	GIBCO	25200-056
Type I collagen solution from rat tail	SIGMA	C3867