הדפסה תלת-ממדית של מיקרוקארים הידרוג'ל במבחנה על ידי סילון כוח צמיג-אינרציאלי לסירוגין

Summary

מוצג כאן היא טכניקת הדפסה 3D מתון מונע על ידי כוחות צמיגים-אינרציאליים לסירוגין כדי לאפשר את הבנייה של מיקרוקארים הידרוג'ל. חרירים תוצרת בית מציעים גמישות, ומאפשרים החלפה קלה לחומרים וקטרים שונים. מיקרוקארים מחייבים תא בקוטר של 50-500 מיקרומטר ניתן להשיג ולאסוף עבור culturing נוסף.

Abstract

Microcarriers הם חרוזים עם קוטר של 60-250 מיקרומטר ושטח פנים ספציפי גדול, אשר משמשים בדרך כלל כנשאים עבור תרביות תאים בקנה מידה גדול. טכנולוגיית תרבות המיקרוקרייר הפכה לאחת הטכניקות העיקריות במחקר ציטולוגי והיא נפוצה בתחום התרחבות התאים בקנה מידה גדול. Microcarriers הוכחו גם לשחק תפקיד חשוב יותר ויותר בבניית הנדסת רקמות במבחנה והקרנת תרופות קליניות. השיטות הנוכחיות להכנת מיקרוקריירים כוללות שבבים מיקרופלואידיים והדפסת הזרקת דיו, המסתמכים לעתים קרובות על עיצוב ערוץ זרימה מורכב, ממשק דו-פאזי לא תואם וצורת זרבובית קבועה. שיטות אלה מתמודדות עם האתגרים של עיבוד זרבובית מורכב, שינויי זרבובית לא נוחים, וכוחות שחול מוגזמים כאשר מוחלים על bioink מרובים. במחקר זה, טכניקת הדפסה 3D, הנקראת סילון כוח צמיג-אינרציאלי לסירוגין, הוחלה כדי לאפשר בנייה של מיקרוקארים הידרוג'ל בקוטר של 100-300 מיקרומטר. תאים נזרעו לאחר מכן על מיקרו-מכוניות כדי ליצור מודולים להנדסת רקמות. בהשוואה לשיטות הקיימות, שיטה זו מציעה קוטר קצה זרבובית חינם, החלפת זרבובית גמישה, שליטה חופשית בפרמטרים של הדפסה ותנאי הדפסה קלים למגוון רחב של חומרים ביו-אקטיביים.

Introduction

Microcarriers הם חרוזים עם קוטר של 60-250 מיקרומטר ושטח פנים ספציפי גדול והם משמשים בדרך כלל עבור תרבות בקנה מידה גדול של ^תאים1,2. המשטח החיצוני שלהם מספק אתרי צמיחה בשפע לתאים, והפנים מספקים מבנה תמיכה להתפשטות מרחבית. המבנה הכדורי מספק גם נוחות בניטור ובקרה של פרמטרים, כולל pH, _O2, וריכוז של חומרים מזינים ומטבוליטים. כאשר נעשה שימוש בשילוב עם bioreactors טנק מעורבב, microcarriers יכול להשיג צפיפות תאים גבוהה יותר בנפח קטן יחסית לעומת תרבויות קונבנציונליות, ובכך לספק דרך חסכונית להשיג תרביות בקנה מידה ^גדול3. טכנולוגיית תרבות מיקרוקרייר הפכה לאחת הטכניקות העיקריות במחקר ציטולוגי, והתקדמות רבה נעשתה בתחום ההתרחבות בקנה מידה גדול של תאי גזע, הפטוציטים, כונדרוציטים, פיברובלסטים ומבנים ^אחרים4. הם גם נמצאו כלי רכב משלוח סמים אידיאליים ויחידות מלמטה למעלה, ולכן לוקח על עצמו תפקיד חשוב יותר ויותר בהקרנת תרופות קליניות ותיקון הנדסת רקמות במבחנה5.

כדי לענות על דרישות רכוש מכני בתרחישים שונים, סוגים רבים של חומרים הידרוג'ל פותחו לשימוש בבניית microcarriers6,7,8,9,10,11^. הידרוג'לים של חומצה אלגינטית וחומצה היאלורונית (HA) הם שניים מהחומרים המיקרו-קרוריים הנפוצים ביותר בשל תאימותם הביולוגית הטובה ויכולת ההצלבה ^{שלהם12,13}. Alginate יכול להיות מקושר בקלות על ידי סידן כלוריד, ואת המאפיינים המכניים שלה ניתן לאפנן על ידי שינוי הזמן חוצה קישור. HA מצומד טיירמין מקושר על ידי צימוד חמצוני של moieties טירמין מזורז על ידי מי חמצן ופרוקסידאז ^חזרת14. קולגן, בשל המבנה הספירלי הייחודי שלו ורשת סיבים מקושרת, משמש לעתים קרובות כאדג'ובנט להתערבב לתוך microcarriers כדי לקדם עוד יותר את הקובץ המצורף ^{לתאים15,16}.

השיטות הנוכחיות להכנת מיקרוקריירים כוללות שבבים מיקרופלואידיים, הדפסת הזרקת דיו ו electrospray17,18,19,20,20,21,22,23. שבבים מיקרופלואידיים הוכחו כמהירים ויעילים בייצור מיקרו-קרניים בגודל ^אחיד24. עם זאת, טכנולוגיה זו מסתמכת על תכנון וייצור ערוץ זרימה ^מורכב25. טמפרטורה גבוהה או כוחות שחול מוגזמים במהלך הדפסת הזרקת דיו, כמו גם שדות חשמליים אינטנסיביים בגישת electrospray, עלול להשפיע לרעה על המאפיינים של החומר, במיוחד את הפעילות הביולוגית ^שלה19. חוץ מזה, כאשר מוחל על ביו-חומרים וקטרים שונים, חרירים מותאמים אישית המשמשים בשיטות אלה לגרום למורכבות עיבוד מוגבלת, עלות גבוהה, וגמישות נמוכה.

כדי לספק שיטה נוחה להכנת מיקרוקרייר, טכניקת הדפסה תלת-ממדית הנקראת סילון כוחות צמיגים-אינרציאליים לסירוגין (AVIFJ) יושמה לבניית מיקרו-מכוניות הידרוג'ל. הטכניקה משתמשת בכוחות הנעה כלפי מטה ובלחץ סטטי שנוצר במהלך רטט אנכי כדי להתגבר על מתח פני השטח של קצה הזרבובית ובכך ליצור טיפות. במקום כוחות חמורים ותנאים תרמיים, עקירות מהירות קטנות פועלות ישירות על הזרבובית במהלך ההדפסה, וגורמות להשפעה מינורית על התכונות הפיזיקוכימיות של הביוינק ומציגות משיכה גדולה לחומרים ביו-אקטיביים. תוך שימוש בשיטת AVIFJ, מיקרוקארים של ביו-חומרים מרובים עם קטרים של 100-300 מיקרומטר נוצרו בהצלחה. חוץ מזה, המיקרו-מכוניות הוכחו עוד יותר כקושרות תאים היטב ומספקות סביבת גדילה מתאימה לתאים דבוקים.

Protocol

1. תרבות התא

1. יש להשלים את המדיום החיוני המינימלי (H-DMEM) המותאם לגלוקוז גבוה של Dulbecco עם 10% סרום בקר עוברי (FBS), 1% פתרון חומצות אמינו לא חיוניות (NEAA), 1% פניצילין G וסטרפטומיצין, ותוסף גלוטמין 1% כמדיה תרבית לתאי A549.
2. תרבית A549 תאים בחממת _CO2 ב 37 °C (5° C) עם 5% _CO2
3. לנתק תאים עבור תת תרבות באמצעות טריפסין ב כ 80% מפגש.
   1. השתמש 3 מ"ל של טריפסין כדי לטפל בתאים בבקבוק תרבית T75 ב 37 °C (3 °F) במשך 3 דקות, ולאחר מכן להוסיף 6 מ"ל של מדיום תרבות כדי לעצור את הטריפסיניזציה.
   2. פיפטה המדיום התרבותי לקצור תאים דבוקים באופן רופף.
   3. צנטריפוגה ב 72.5 x g במשך 3 דקות. הסר את supernatant ו resuspend עם 3 מ"ל של בינוני טרי.
   4. מעבירים 1 מ"ל של השעיית תאים לבקבוקון תרבות T75 חדש המכיל 10 מ"ל של מדיום טרי. שנה את מדיום התרבות כל יומיים.

2. הכנת חרירים

1. טען מיקרופיפטים מזכוכית על המושך בהתאם להוראות היצרן. הקוטר החיצוני, הקוטר הפנימי והאורך של צינור המיקרו-סילון הם 1.5 מ"מ, 1.1 מ"מ ו-100 מ"מ, בהתאמה.
2. הגדר את פרמטרי המשיכה עבור המושך. באופן ספציפי, הערכים של חום, משיכה, מהירות, זמן ולחץ מוגדרים ל- 560, 255, 255, 150 ו- 500 כברירת מחדל, בהתאמה. משוך את הזרבובית תחת הפרמטרים האלה.
   אזהרה: הזרבובית המתקבלת לאחר ביצוע ההזמנה חדה מאוד, וניתוח רשלני עלול לגרום לפציעות.
3. חתוך את הזרבובית המתקבלת (שלב 2.2) בקוטר המיועד על ידי התקן מיקרו-זיוף בהתאם להוראות היצרן כדי לקבל קוטר קצה ספציפי. באופן ספציפי, אתר את הקוטר שצוין של הזרבובית על חוט הפלטינה המחומם. מחממים את החוט עד 60 °C (60 °F) עבור כ 5 s ולמשוך את הזרבובית לגזרים.
4. לטבול את ראש ההדפסה של הזרבובית בסוכן הידרופובי במשך 30 דקות, ואחריו שלושה מחזורים של שטיפה עם מים מעוקרים.
5. לפני ההדפסה, לחטא את הזרבובית באלכוהול במשך 5 דקות ולשטוף אותו עם מים מעוקרים שלוש פעמים כדי להסיר את האלכוהול שיורית.

3. הכנת ביונק הידרוג'ל

1. להמיס NaCl (0.45 גרם) לתוך 50 מ"ל של מים סטריליים כדי לקבל 0.9% (w / v) פתרון NaCl. לרטוט את הפתרון כדי לקדם פירוק. לאחר שהומס לחלוטין, לסנן את הפתרון באמצעות 0.45 מיקרומטר פוליאתילן טרפטלט מסנן קרום.
2. לשקול אבקת נתרן אלגינט צמיגות נמוכה (1 גרם) ולהמיס אותו ב 25 מ"ל של פתרון NaCl (שלב 3.1) בטמפרטורה גבוהה של 60-80 °C (60°C) לילה כדי לקבל 4% (w / v) פתרון מלאי נתרן אלגינט. פתרון המניה ניתן לאחסן ב 4 °C (65 °F) במשך חודש אחד.
3. לחטא את פתרון מלאי נתרן אלגינט (שלב 3.2) על ידי חימום אותו שלוש פעמים בתנור (70 °C (70 °F) במשך 30 דקות.
4. לדלל נפח תקין של פתרון מניית נתרן אלגינט (שלב 3.3) ב 0.9% פתרון NaCl (שלב 3.1) בריכוזים של 2%, 1.5%, ו 0.5% (w /v).
   הערה: בנוסף לחימום בתנור, תהליכי הכנה אחרים של פתרון נתרן אלגינט צריך להתבצע במכסה המנוע.
5. להמיס 1 גרם אבקת ג'לטין ב 25 מ"ל של פתרון NaCl (שלב 3.1) בטמפרטורה גבוהה של 60-80 °C (60 °F) לילה כדי לקבל 4% (w / v) פתרון מלאי ג'לטין. פתרון המניה ניתן לאחסן ב 4 °C (65 °F) במשך חודש אחד.
6. לחטא את פתרון מלאי הג'לטין (שלב 3.5) על ידי חימום אותו שלוש פעמים בתנור (70 מעלות צלזיוס) במשך 30 דקות.
7. לדלל את הנפח הנכון של פתרון מניית ג'לטין (שלב 3.6) בפתרון NaCl של 0.9% (שלב 3.1) בריכוז של 1.5% (w/v).
   הערה: בנוסף לחימום בתנור, תהליכי הכנה אחרים של תמיסת ג'לטין צריכים להתבצע במכסה המנוע.
8. כדי לקדם את כריכת התאים במיקרו-קרויירים, הכינו את תמיסת הקולגן אלגינט אלגינט על ידי ערבוב תמיסת 2% (w/v) נתרן אלגינט ופתרון קולגן מסוג I מזנב החולדה (4 מ"ג/מ"ל) ביחס של 3:1. התאימו את הפתרון ל-pH 7.2 עם פתרון NaOH של 0.1 M והשתמשו בו מיד לאחר ההכנה.
9. ממיסים את מוצק HA שעבר שינוי טירוזין בתמיסת תמיסת מלח חוצץ פוספט (PBS) ב 60-80 °C (60 °F) לילה כדי לקבל 0.8% w / w טירוזין שונה חומצה היאלורונית PBS פתרון. פתרון המניה ניתן לאחסן ב 4 °C (65 °F) במשך חודש אחד.
10. לחטא את פתרון HA PBS שונה טירוזין על ידי חימום אותו שלוש פעמים בתנור (70 °C (70 °F) במשך 30 דקות.
11. המיס אבקת פרוקסידאז חזרת (500 יחידת פעילות אנזימים/מ"ג) בתמיסת PBS להשגת 8 יחידות פעילות אנזימים/מ"ג תמיסת PBS של חזרת מ"ג.
12. לדלל תמיסת מי חמצן (30%, w / w) על ידי מים DI ל 4 מ"מ.
13. הכן את פתרון ה-HA-חזרת peroxidase שונה על ידי ערבוב פתרון PBS חומצה היאלורונית שונה טירוזין ופתרון PBS פרוקסידאז חזרת ביחס של 1:1.
    הערה: בנוסף לחימום בתנור, תהליכי הכנה אחרים של פתרון peroxidase חזרת HA צריך להתבצע במכסה המנוע.

4. היווצרות מיקרו-טיפות המבוססת על AVIFJ

1. השתמש במערכת הדפסת תאים ביתית כפי שדווח בעבר (איור 1A)²⁶. תפוקת האות החשמלי על ידי גנרטור צורת הגל מוגברת תחילה ולאחר מכן מניעה קרמיקה פיזואלקטרית כדי ליצור עיוות לשליטה. הזרבובית הקבועה על הקרמיקה הפיזואלקטרית מייצרת ובכך מייצרת תנודות לשליטה.
2. חטא את מערכת ההדפסה על-ידי ניגוב עם 75% (v/v) אלכוהול וחשיפה אולטרה סגולה (UV) במהלך הלילה.
3. יש לטעון 5 מ"ל של ביוינק (שלב 3.1) למזרק סטרילי חד פעמי. התקן את המזרק על משאבת המזרק.
4. חבר את המזרק (שלב 4.3) ואת הזרבובית (שלב 2.5) עם צינור סיליקון בקוטר פנימי של 1 מ"מ.
5. תקן את הזרבובית (שלב 4.4) שתשמש להדפסה על-ידי התאמת ההידוק של בורג ההידוק. יש להרחיק את קצה הזרבובית מהמצע במהלך ההתקנה כדי למנוע נזק וזיהום.
   אזהרה: אם הזרבובית שבורה במהלך ההתקנה, אנא לבש כפפות עבות יותר ונקה בקפידה שברי זכוכית ושאריות.
6. דחוף במהירות את משאבת המזרק וטען את הביוינק (שלב 4.3) לזרבובית (שלב 4.5). הגדר את קצב הזרימה ב- 30 μL / min. נגב את החומר העודף בקצה.
7. הגדר פרמטרים של מחולל אותות. יבא צורת גל בעיצוב עצמי המכילה 500,000 נקודות דגימה. הגדר את קצב הדגימה ואת מתח השיא לשיא (Vpp) כ- 5 מיליון דגימות/s ו- 10 V, בהתאמה.
8. שקופיות נקיות או מנות פטרי עם מים deionized. הנח אותם מתחת לזרבובית כמצע ההדפסה.
9. קבעו מראש את נתיב התנועה ואת מצב ההפעלה של הרטט כירידה לפי דרישה.
10. הדפס את הטיפות בהתאם לתבניות שעוצבו מראש.

5. היווצרות מיקרוקארים המבוססת על AVIFJ

1. חזור על שלבים 4.1-4.4, למעט לשנות את הביו-ink ל-2% (w/v) פתרון אלגינט (שלב 3.4), תמיסת קולגן אלגינט (שלב 3.8) או פתרון פרוקסידאז HA-חזרת שונה (שלב 3.13).
2. ממיסים 3 גרם של סידן כלורי לתוך 100 מ"ל של מים סטריליים כדי לקבל 3% (w / v) פתרון סידן כלוריד. לאחר שהומס לחלוטין, לסנן את הפתרון באמצעות 0.45 מיקרומטר פוליאתילן טרפטלט מסנן קרום.
3. הוסיפו 5 מ"ל של תמיסת קישור צולבת (תמיסת סידן כלוריד או תמיסת מי חמצן) לצלחת פטרי. מניחים את צלחת פטרי מתחת לזרבובית לעבוד כמצע.
4. לאחר ההדפסה, להצליב את microcarriers במשך 3 דקות.
5. לאסוף השעיה microcarrier בצינור צנטריפוגה, ולהעשיר מיקרוקארים על ידי צנטריפוגה ב 29 x גרם במשך 3 דקות. הקדישו מחדש את המיקרו-מכוניות במדיה התרבותית בכ-600 מיקרו-מכוניות/מ"ל.

6. חיסון תאים על פני השטח של מיקרוקארים

1. כתם A549 תאים עם מעקב תא ירוק CMFDA כדי להקל על התצפית של תאים. באופן ספציפי, להסיר מדיה תרבית, להוסיף 5 מ"ל של מדיום ללא סרום המכיל 10 μM צבע מעקב תא, ודגור תאים במשך 30 דקות באינקובטור. לאחר מכן, החלף את תמיסת הצבע במדיום טרי.
2. resuspend השעיית התא A549 בצפיפות של 1.6 x ¹⁰⁶ תאים / מ"ל.
3. הוסיפו 1 מ"ל של השעיית מיקרוקרייר אלגינט קולגן (שלב 5.3) ו-1 מ"ל של השעיית תאים A549 (שלב 6.1) לצלחת תרבית נמוכה של 6 בארות.
4. מניחים את הצלחת על שייקר ב 30 סל"ד באינקובטור ב 37 °C (5° פרנהייט) ו 5% _CO2.
5. תוריד את הצלחת מהשייקר ותחכה 30 דקות כדי לתת למיקרו-קארים להתיישב. חצי משנים את מדיום התרבות כל יומיים.

7. ניתוח של היווצרות מיקרו-טיפות/מיקרו-מכוניות

1. שימו לב ומדדו את הזרבובית (שלב 2.2), את צלחות הפטרי (שלב 4.10 ואת שלב 5.4) ואת התאים עם מיקרוקריות (שלב 6.5) תחת מיקרוסקופ שדה בהיר או מיקרוסקופ קונפוקלי. באופן ספציפי, ההגדלה האובייקטיבית היא 4x, 10x או 20x והגדלת העיניים היא 10x.
2. מדוד את הקוטר של המיקרו-מכוניות על ידי תוכנת ImageJ. על פי סרגל קנה המידה שמגיע עם המיקרוסקופ בעת הצילום בתמונה, הגדר את הגודל הממשי של קנה המידה ב- ImageJ, וצייר 10 שורות של הרדיוס או הציר הראשי למחצה של המיקרוקארים. ImageJ יכול לקבל את הגודל הממוצע ואת סטיית התקן של מקטעי קו אלה.

תוצאות

ראשי הדפסה של שיעורי התכנסות וקטרים מגוונים היו מפוברקים כדי להשיג את ההדפסה של סוגים מרובים של חומרים. החרירים המתקבלים עם כוח המשיכה הגובר מוצגים באיור 1B. החרירים חולקו לשלושה תחומים: מאגר (III), התכווצות (II) וראש הדפסה (I). המאגר היה החלק הלא מעובד של הזרבובית, שבו הנוזל סיפק ...

Discussion

הפרוטוקול המתואר כאן מספק הוראות להכנת סוגים רבים של מיקרוקארים הידרוג'ל וזריעת תאים לאחר מכן. בהשוואה לשיטות הדפסת שבבים מיקרופלואידיים והזרקת דיו, גישת AVIFJ לבניית מיקרו-מכוניות מציעה גמישות רבה יותר והתאמה ביולוגית. זרבובית עצמאית מאפשרת שימוש במגוון רחב של חרירים קלים, כולל מיקרופיפט?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
A549 cells	ATCC	CCL-185	Human non-small cell lung cancer cell line
Bright field microscope	Olympus	DP70
Confocal microscope	Nikon	TI-FL
Fetal bovine serum, FBS	BI	04-001-1ACS
Gelatin	SIGMA	G1890
Glass micropipettes	sutter instrument	b150-110-10
GlutaMAX	GIBCO	35050-061
H-DMEM	GIBCO	11960-044	Dulbecco's modified eagle medium
Horseradish peroxidase powder	SIGMA	P6782
Hydrophobic agent	3M	PN7026	Follow the manufacturer's instructions and use after dilution
Micro-forge device	narishige	MF-900
Non-essential amino acids, NEAA	GIBCO	11140-050	non-essential amino acids
Penicillin G and streptomycin	GIBCO	15140-122
Petri dish	SIGMA	P5731-500EA
Puller	sutter instrument	P-1000
Sodium alginate	SIGMA	A0682
Trypsin	GIBCO	25200-056
Type I collagen solution from rat tail	SIGMA	C3867