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Resumen

Este manuscrito describe un protocolo detallado para producir matrices de microtejidos 3D del músculo esquelético humano y ensayos de función in situ mínimamente invasivos aguas abajo, incluidos análisis de fuerza contráctil y manejo de calcio.

Resumen

Los modelos tridimensionales (3D) in vitro del músculo esquelético son un avance valioso en la investigación biomédica, ya que brindan la oportunidad de estudiar la reforma y la función del músculo esquelético en un formato escalable que es susceptible de manipulaciones experimentales. Los sistemas de cultivo muscular 3D son deseables, ya que permiten a los científicos estudiar el músculo esquelético ex vivo en el contexto de las células humanas. Los modelos 3D in vitro imitan de cerca aspectos de la estructura del tejido nativo del músculo esquelético adulto. Sin embargo, su aplicación universal está limitada por la disponibilidad de plataformas que son fáciles de fabricar, costosas y fáciles de usar, y producen cantidades relativamente altas de tejidos musculares esqueléticos humanos. Además, dado que el músculo esquelético desempeña un papel funcional importante que se ve afectado con el tiempo en muchos estados de enfermedad, una plataforma experimental para estudios de microtejidos es más práctica cuando las mediciones mínimamente invasivas de la fuerza transitoria y contráctil del calcio se pueden realizar directamente dentro de la propia plataforma. En este protocolo, se describe la fabricación de una plataforma de 96 pocillos conocida como 'MyoTACTIC', y la producción en masa de microtisones musculares esqueléticos humanos (hMMTs) en 3D. Además, se informan los métodos para una aplicación mínimamente invasiva de estimulación eléctrica que permite mediciones repetidas de la fuerza del músculo esquelético y el manejo del calcio de cada microtejido a lo largo del tiempo.

Introducción

El músculo esquelético es uno de los tejidos más abundantes en el cuerpo humano y apoya funciones clave del cuerpo como la locomoción, la homeostasis por calor y el metabolismo1. Históricamente, los modelos animales y los sistemas de cultivo celular bidimensional (2D) se han utilizado para estudiar procesos biológicos y patogénesis de enfermedades, así como para probar compuestos farmacológicos en el tratamiento de enfermedades del músculo esquelético2,3. Si bien los modelos animales han mejorado en gran medida nuestro conocimiento del músculo esquelético en la salud y en la enfermedad, su impacto traslacional se ha visto obstaculizado por los altos costos, las consideraciones éticas y las diferencias entre especies2,4. Al recurrir a los sistemas basados en células humanas para estudiar el músculo esquelético, los sistemas de cultivo celular 2D son favorables debido a su simplicidad. Sin embargo, hay una limitación. Este formato a menudo no logra recapitular las interacciones célula-célula y célula-matriz extracelular que ocurren naturalmente dentro del cuerpo5,6. En los últimos años, los modelos tridimensionales (3D) del músculo esquelético han surgido como una poderosa alternativa a los modelos animales completos y los sistemas de cultivo 2D convencionales al permitir el modelado de procesos fisiológica y patológicamente relevantes ex vivo7,8. De hecho, una gran cantidad de estudios han reportado estrategias para modelar el músculo esquelético humano en un formato de cultivo 3D bioartificial1. Una limitación para muchos de estos estudios es que la fuerza activa se cuantifica después de la eliminación de los tejidos musculares de las plataformas de cultivo y la unión a un transductor de fuerza, que es destructivo y, por lo tanto, se limita a servir como un ensayo de punto final9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18 ,19,20,21. Otros han diseñado sistemas de cultivo que permiten métodos no invasivos de medición de la fuerza activa, pero no todos son susceptibles de aplicaciones de prueba de moléculas de alto contenido7,8,9,10,14,18,22,23,24,25,26,27,28 ,29.

Este protocolo describe un método detallado para fabricar microtejidos musculares humanos (hMMTs) en la plataforma microTissue Array deviCe To Investigate forCe (MyoTACTIC) del músculo esquelético (MyoTACTIC); un dispositivo de placa de 96 pocillos que soporta la producción a granel de microtisones musculares esqueléticos30. El método de fabricación de placas MyoTACTIC permite la generación de una placa de cultivo de polidimetilsiloxano (PDMS) de 96 pocillos y todas las características correspondientes del pozo en un solo paso de fundición, por lo que cada pozo requiere un número relativamente pequeño de células para la formación de microtejivas. Los microtejidos formados dentro de MyoTACTIC contienen miotubos alineados, estriados y multinucleados que son reproducibles de pozo a pozo del dispositivo, y al madurar, pueden responder a estímulos químicos y eléctricos in situ30. Aquí, se describe y discute la técnica para fabricar un dispositivo de placa de cultivo MIOTÁCTICO PDMS a partir de una réplica de poliuretano (PU), un método optimizado para implementar células progenitoras miogénicas humanas inmortalizadas para fabricar hMMT, y la evaluación funcional de la generación de fuerza hMMT diseñada y las propiedades de manejo de calcio.

Protocolo

1. Fabricación de placas MIOTÁCTICAS PDMS

NOTA: La fabricación de placas MIOTÁCTICAS PDMS requiere un molde negativo de PU, que se puede fabricar como se describió anteriormente30. El archivo solidWorks de diseño asistido por ordenador (CAD) para el diseño de placas MyoTACTIC se ha puesto a disposición en GitHub (https://github.com/gilbertlabcode/MyoTACTIC-SolidWork-CAD-file).

  1. Prepare ~ 110 g de solución de polímero PDMS en un vaso de plástico desechable en una proporción de 1:15 de monómero a agente de curado utilizando los componentes del kit de elastómero de silicona. Revuelva la solución de polímero durante 2-3 min con una pipeta serológica desechable de 5 ml hasta que esté completamente mezclada y homogénea.
    PRECAUCIÓN: Evite el contacto de la solución de polímero PDMS con la piel y los ojos; y evitar la inhalación. Siempre use una bata de laboratorio y guantes desechables cuando manipule la mezcla líquida de PDMS y consulte la Hoja de datos de seguridad (SDS) para conocer los protocolos de seguridad específicos.
    NOTA: Proteja las superficies del equipo (por ejemplo, báscula, sobremesa, etc.) con una cubierta desechable en caso de derrame de solución de polímero PDMS.
  2. Desgasifica la mezcla a temperatura ambiente colocando la taza dentro de una cámara de vacío de sobremesa conectada a una bomba de vacío seca de servicio estándar durante ~ 30 minutos, o hasta que se eliminen todas las burbujas. Rompa el vacío cada 5-10 minutos para ayudar en la desgasificación. Use un barril de jeringa vacío de 50 ml para sumergir el aire y expulsar las burbujas restantes en la superficie de la mezcla de polímeros según sea necesario.
    NOTA: Se puede utilizar una pieza de tubo id de 6,35 mm para conectar una punta de pipeta P1250 al cañón para mejorar la velocidad y la precisión de la corriente de aire.
  3. Mientras la solución de polímero PDMS se está desgasificando, retire los trozos sobrantes de PDMS adheridos al molde negativo de PU limpiando suavemente los bordes y la superficie con una toalla de papel seca. Utilice aire comprimido de la instalación, ajustado a 70-100 kPag para eliminar las partículas finas restantes.
    NOTA: Proteja el molde negativo de PU del daño y de la acumulación de partículas colocándolo en una bolsa de plástico sellable y almacenándolo dentro de un cajón que esté protegido del tráfico del laboratorio.
  4. Coloque el molde de PU en una campana química que haya sido protegida con una cubierta desechable. Coloque el molde horizontalmente a ~ 75 ° y rocíe la superficie activa con una capa uniforme de agente desmoldante. Rocíe el molde de arriba a abajo, luego de izquierda a derecha, mientras mantiene la lata a 15-20 cm del molde y usa un movimiento de barrido fluido hacia adelante y hacia atrás. Gire el molde 180 ° y repita los aerosoles, luego deje que el molde de PU se asiente en la campana química durante 10-15 minutos para que se seque.
    PRECAUCIÓN: Asegúrese de que se use un agente desmoldante dentro de una campana de humos químicos, evite el contacto con la piel y los ojos, y consulte la Hoja de datos de seguridad (SDS) para conocer los protocolos de seguridad específicos
    NOTA: Una película delgada debe cubrir completamente la superficie activa, pero el recubrimiento excesivo se puede transferir al PDMS en el siguiente paso, lo que a su vez puede afectar negativamente la siembra de hMMT. La superficie debe sentirse resbaladiza al tacto pero no mojada.
  5. Vierta 100 g de PDMS uniformemente en el molde de PU y colóquelo dentro de una cámara de vacío conectada a una bomba de vacío de paletas rotativas. Desgasificar el molde lleno de PDMS durante ~ 45 minutos, rompiendo el sello de vacío cada 5-10 minutos durante los primeros 20 minutos para acelerar el proceso. Deje dentro de la cámara de vacío hasta que la mezcla de PDMS esté completamente vacía de todas las burbujas.
    NOTA: Se utiliza una bomba de vacío de paletas rotativas para lograr un vacío más bajo y reducir el tiempo requerido para este paso. La desgasificación del molde lleno de PDMS se puede realizar utilizando la cámara de vacío de sobremesa y la bomba de vacío seco de servicio estándar, sin embargo, el tiempo para vaciar la mezcla de todas las burbujas será más largo. Lo que es esencial es la eliminación de todas las burbujas de la solución de polímero PDMS, especialmente en aquellas regiones destinadas a convertirse en postes de anclaje hMMT. Las burbujas en esta región resultarán en la rotura del poste del ancla, la pérdida de pozos de cultivo y, a su vez, darán como resultado que una pequeña pieza de PDMS permanezca encajada en el molde.
  6. Transfiera el molde de PU lleno de PDMS desgasificado a un horno de 65 ° C, incubándolo durante la noche para curar el caucho líquido.
  7. Retire la placa positiva PDMS curada del horno y enfríe la placa a temperatura ambiente durante al menos 30 minutos.
  8. Con un bisturí sin cuchillas, separe suavemente los PDMS curados del molde de PU pasando la parte posterior del mango entre el PDMS y las paredes del molde. Comience a lo largo del borde superior y separe los 4 lados, antes de empujar hacia abajo hasta la base del molde y separar esta porción. Este paso se completa cuando la parte posterior del mango funciona sin problemas entre el PDMS y las 4 paredes del molde de PU.
    NOTA: Trabaje lenta y cuidadosamente con el bisturí sin cuchillas para evitar que se rompa el molde de PU o se rompa el PDMS. Este paso debería tomar 15-20 min.
  9. Comenzando desde un extremo, use el bisturí sin cuchillas para levantar el borde del PDMS y trabaje los dedos entre la placa de cultivo PDMS curada y el molde de PU. Luego, usando ambas manos, empuje los dedos más debajo de la placa, pelando lentamente hacia arriba y fuera del molde de PU.
    NOTA: Trabaje lentamente y use ambas manos para pelar uniformemente el plato. Minimice la flexión para reducir la probabilidad de rotura del poste del anclaje. Este paso debería tomar de 5 a 10 minutos.
  10. Use una cuchilla de afeitar de un solo filo para cortar la placa en grupos de 6 ± 2 pocillos Miotácticos (Figura 1) para fines de siembra de tejidos. Coloque las placas MyoTACTIC completas, o porciones de placa, en una bolsa de esterilización de instrumentos y en autoclave durante un ciclo seco de 25 minutos (20 minutos de tiempo de esterilización y 5 minutos de tiempo de secado) a 120 °C y 100-140 kPag.

2. Cultivo de células progenitoras de mioblastos humanos inmortalizados

NOTA: Los mioblastos inmortalizados utilizados en este protocolo fueron obtenidos del Institut de Myologie (París, Francia)31.

  1. Obtenga un vial de células congeladas del dewar de nitrógeno líquido y descongele rápidamente el vial en un baño de agua a 37 °C (en menos de 1 min). Las células se congelan a una densidad de 7,5 x 105 células por 1 ml de medio de congelación que consiste en un 90% de suero bovino fetal (FBS) y un 10% de dimetilsulfóxido (DMSO).
  2. Transfiera suavemente el contenido del vial a un tubo cónico de 15 ml que contenga 9 ml de medio de lavado precalentado que consiste en 89% dmEM 1x, 10% FBS y 1% Pen/Strep para diluir el DMSO. Gire el tubo cónico de 15 ml a 400 x g durante 10 minutos y luego aspire los medios teniendo cuidado de evitar la bolita celular.
  3. Resuspender el pellet en 1 mL de medios de crecimiento que consisten en 84% de Medio Basal de Células Musculares Esqueléticas con Mezcla de Suplemento de Medio de Crecimiento de Células Musculares Esqueléticas, 15% fbS y 1% de Pluma / Estreptococo y luego transferir a un tubo cónico de 50 ml con 29 ml de medios de crecimiento.
  4. Transfiera 10 ml de medios que contengan aproximadamente 2,5 x 105 células a una placa de cultivo celular de 100 mm x 20 mm. Repita este paso con los 20 ml restantes de la solución celular. A continuación, transfiera las placas de cultivo celular a una incubadora de cultivo celular humidificada a 37 °C y 5% de CO2.
  5. Refresque los medios culturales cada dos días. Cultive las células hasta que logren ~ 70% -80% de confluencia (típicamente 4-5 días), momento en el cual las células se preparan para la siembra. 1.5 x 10 Se requieren5 celdas para generar cada hMMT. Por lo tanto, pase las células según sea necesario para lograr el número requerido de células.
    NOTA: Las líneas celulares progenitoras de mioblastos inmortalizadas nunca deben exceder el 80% de confluencia antes de sembrar células en pozos miotácticos, pasar las células o preparar existencias de congeladores. Las hMMT fabricadas a partir de células que han superado el 80% de confluencia a menudo no alcanzan la madurez contráctil. Los procedimientos de paso son idénticos a los métodos que se describen a continuación en el paso 3.

3. Siembra de hMMTs diseñados con MyoTACTIC

  1. Preparación de pocillos de cultivo MyoTACTIC y reactivos para la siembra de hMMT.
    NOTA: Este protocolo proporciona detalles específicos para producir 6 hMMTs.
    1. 2-3 h antes de la siembra celular, coloque una porción de placa MyoTACTIC de 6 pocillos en una placa de cultivo celular de 10 cm. Prepare cada pozo de cultivo Miotáctico individual agregando 100 μL de una solución Plurónica F-127 al 5% en cada pozo. Coloque la tapa en el plato de cultivo de 10 cm, aplique parafina para sellar el espacio entre el plato de 10 cm y la tapa, y luego coloque la placa de 10 cm que contiene la porción MyoTACTIC en una centrífuga equipada con un adaptador de hilandera de placa.
      NOTA: Si no se dispone de un adaptador giratorio de placa centrífuga, se puede utilizar una punta de pipeta p20 para eliminar cuidadosamente las burbujas de detrás de los postes, asegurando así que toda la superficie de cultivo esté recubierta uniformemente.
    2. Centrifugar a 1.550 x g durante 1 min para eliminar todas las burbujas dentro de los pozos de cultivo, especialmente detrás de los postes. Guarde la placa de cultivo celular de 10 cm que contiene la porción de la placa MyoTACTIC que contiene la solución Pluronic F-127 a 4 °C hasta que las células estén preparadas para la siembra.
      NOTA: El recubrimiento Pluronic F-127 se puede aplicar durante tan solo 2 h a 24 h. Por ejemplo, los pozos se pueden llenar con la solución Pluronic F-127 al final del día para su uso al día siguiente. No exceda las 24 h ya que esto impactará negativamente en la remodelación de hMMT y no podrá formar tejidos sanos que alcancen la madurez contráctil.
    3. Descongele lentamente una alícuota de extracto de membrana basal de 50 μL y una alícuota de trombina de 10 μL (solución madre de 100 U/ml) en hielo dentro de la campana de cultivo.
      NOTA: No vuelva a congelar las alícuotas de extracto de membrana basal. Son de un solo uso. Las alícuotas de trombina son reutilizables, por lo tanto, vuelvan a congelarse hasta 5 veces después de su uso.
    4. Pesar ~ 7 mg de fibrinógeno en polvo en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y luego transferir a la campana de cultivo celular. Añadir 700 μL de solución de NaCl al 0,9% (en peso/vol) en agua (o solución salina) para llegar a una solución de concentración final de 10 mg/ml. No vórtice el fibrinógeno para disolverse, en su lugar coloque el tubo en una incubadora de cultivo celular de 37 ° C durante 3-5 min.
    5. Retire y mueva el tubo suavemente, luego haga girar por pulso la solución disuelta en una mini centrífuga de sobremesa (microfuge) y vuelva a la campana de cultivo. Filtre la solución de fibrinógeno con una jeringa de 1 ml equipada con un filtro de jeringa de 0,22 μm. Transfiera la solución de fibrinógeno disuelto al hielo junto con el extracto de la membrana basal y las alícuotas de trombina.
    6. Por último, prepare los medios de siembra hMMT que se introducirán en los pozos de cultivo después de la siembra de los tejidos. Este medio contiene Medio Basal de Células Musculares Esqueléticas suplementado con 20% de FBS, 1% de P/S y 3% de ácido 6-aminocaproico (ACA; la concentración final de 1,5 mg/mL se alcanza diluyendo a partir de una solución madre de 50 mg/mL; % se expresa como v/v). Precaliente el medio a 37 °C antes de su uso.
  2. Preparación de células para la siembra de hMMT.
    1. Recoger las placas de cultivo celular de la incubadora de cultivo. Aspire los medios de cada placa, luego lave las células una vez con D-PBS agregando 5 ml de D-PBS en cada placa de cultivo. A continuación, aspire el D-PBS y separe las células agregando 1 ml de tripsina-EDTA al 0,25% en cada plato de cultivo. Colocar en la incubadora de cultivo celular durante 3 min.
    2. Detenga la tripsina agregando 3 ml de medio de lavado (89% de 1x DMEM + 10% FBS + 1% Pen / Strep) al plato de cultivo. Transfiera la solución celular a un tubo cónico de tamaño adecuado y luego gholeing de las células centrifugando a 400 x g durante 10 min. Aspirar el medio teniendo cuidado de evitar el pellet celular. Luego vuelva a suspender el pellet celular en 1 ml del medio de lavado.
    3. Cuente las células usando un hemocitómetro y un tinte azul tripano bajo microscopía de campo brillante.
      Si se utilizan múltiples placas de células, esta suspensión celular estará muy concentrada. Diluya las suspensiones celulares antes de contar según sea necesario.
    4. Dado que cada tejido requiere 150,000 células resuspendidas en 15 μL de la mezcla de matriz extracelular (ECM), se requieren 900,000 células en 90 μL de mezcla de ECM para 6 tejidos. Para tener en cuenta la pérdida de solución célula-ECM que ocurre durante el proceso de preparación debido a la formación de burbujas o la pérdida de pipeta, prepare una mezcla adicional de células-ECM (es decir, 8 tejidos o 1,200,000 células en 120 μL de ECM). Transfiera el volumen de suspensión celular que contiene 1.200.000 células a un nuevo tubo cónico. Aumente el volumen a 10 ml con medio de lavado y gire a 400 x g durante 10 min.
    5. Mientras las células están girando, prepare una mezcla de ECM de 150 μL en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml utilizando la siguiente receta. Primero agregue 60 μL de DMEM (40% de volumen), luego agregue 60 μL de solución de Fibrinógeno 10 mg / ml (40% de volumen) y finalmente agregue 30 μL de extracto de membrana basal (20% de volumen). Guarde la mezcla de ECM en hielo hasta su uso.
      NOTA: Utilice siempre puntas preenfriadas a -20 °C cuando trabaje con soluciones que contengan extracto de membrana basal. La mezcla de ECM contiene 4 mg/ml de fibrinógeno.
  3. Siembra de hMMTs
    1. Recoge el tubo cónico que contiene las células hiladas y aspira los medios teniendo cuidado de evitar el pellet celular. Mueva vigorosamente el extremo del tubo con un dedo enguantado para desalojar el gránulo y continúe moviendo hasta que el gránulo aparezca como una suspensión celular.
      NOTA: Es importante aspirar la mayor cantidad posible de medios de lavado para garantizar que la suspensión de ECM celular esté en la dilución deseada. Use una pipeta para quitar el medio de lavado restante si es necesario.
    2. Transfiera 120 μL de la solución de ECM al tubo que contiene el gránulo celular. Pipete hacia arriba y hacia abajo para resuspendir completamente las células dentro del ECM para generar una suspensión de una sola célula. Pipetear lenta y cuidadosamente para evitar la introducción de burbujas, lo que reduciría el volumen de trabajo. Luego, coloque la solución de ECM celular en hielo hasta su uso.
    3. Recupere las porciones de la placa MyoTACTIC que contienen los pocillos MyoTACTIC recubiertos con Pluronic F-127 del refrigerador de 4 ° C y coloque el plato de 10 cm que contiene los pocillos MyoTACTIC encima de una bolsa de hielo dentro de la campana de cultivo celular.
    4. Aspire la solución Pluronic F-127 de cada pozo. El PDMS es poroso y absorberá la solución Pluronic F-127, especialmente si las placas se hicieron girar con una centrífuga. Permita que la solución residual de Pluronic F-127 se libere y se asiente en el fondo del pozo dejando que los pozos se asienten durante 5 minutos, luego aspire nuevamente.
      NOTA: Use una pipeta Pasteur con una punta p1250 unida en el extremo y una punta p200 sobre la punta p1250 al aspirar la solución Pluronic F-127. Esto mejorará la precisión para evitar la aspiración accidental de las estructuras de postes. Evite raspar el área de siembra de células ovaladas en forma de piscina en el fondo del pozo con la pipeta, ya que esto interrumpe el recubrimiento Pluronic F-127 e interfiere con el proceso de autoorganización hMMT. La técnica adecuada es colocar la punta de la pipeta justo sobre la piscina ovalada mientras se aspira la solución Pluronic F-127.
    5. Pipetee la suspensión de la célula-ECM con cuidado para resuspendir cualquier célula que pueda haberse hundido en la parte inferior del tubo. Luego transfiera 105 μL de suspensión de ECM celular a un tubo fresco de 1,5 ml preenfriado. Tenga cuidado de agarrar el tubo cerca de la parte superior para evitar que la solución se caliente.
    6. Añadir 0,84 μL de la solución madre de trombina de 100 U/ml a la suspensión de ECM de células de 105 μL para llegar a una concentración final de 0,2 U/mg de fibrinógeno. Pipetear rápidamente, con cuidado y a fondo para mezclar, evitando la introducción de burbujas.
      NOTA: La trombina inicia la conversión rápida de fibrinógeno en un coágulo de fibrina. Como tal, hay un tiempo limitado para sembrar los tejidos tras la adición de trombina. Para evitar la coagulación prematura antes de que la mezcla célula-ECM se transfiera a los pozos de cultivo, ajuste una pipeta p20 a 15 μL antes de agregar la trombina. Use puntas preenfriadas o sumerja la punta de la pipeta en DMEM helado durante unos segundos antes de recolectar y transferir 15 μL de la mezcla de célula-ECM a cada pozo. Es una buena práctica preparar alícuotas de mezcla de células y ECM de tal manera que no se seplanten más de 6 hMMT a la vez.
    7. Para sembrar los tejidos, agregue 15 μL de mezcla célula-ECM (es decir, 150,000 células) a cada pozo individual. Agregue cuidadosamente la mezcla de celda-ECM al centro de la piscina ovalada y evite presionar la punta de la pipeta en el fondo del pozo. Luego, con dos movimientos ligeros, extienda la suspensión celular detrás de cada poste en el pozo. Una vez que la superficie esté recubierta uniformemente con la suspensión de ECM celular, pase al siguiente pozo.
      NOTA: Trabaje de manera eficiente para evitar la gelificación prematura de la mezcla célula-ECM en el tubo antes de que se siembren todos los tejidos. Al sembrar los pozos, es extremadamente importante evitar la transferencia de burbujas, ya que la burbuja interferirá con la remodelación del hMMT, haciendo que el hMMT sea inutilizable.
    8. Coloque la tapa en la placa de cultivo de 10 cm que contiene los pocillos sembrados y transfiérala a una incubadora de cultivo de tejidos a 37 °C durante aproximadamente 5 min.
      NOTA: Coloque el tubo de microcentrífuga con mezcla residual de células y ECM en la incubadora como confirmación del proceso de polimerización en gel.
    9. Después de que la mezcla célula-ECM se haya polimerizado, agregue 200 μL de medios de siembra hMMT precalentados a cada pozo MyoTACTIC. Reemplace la tapa del plato de 10 cm y devuelva las porciones del plato MyoTACTIC dentro del plato de 10 cm a la incubadora. Este punto de tiempo se conoce como Día -2. No perturbe los tejidos hasta el siguiente paso.
  4. Diferenciación de hMMTs
    1. Después de 2 días de incubación, retire el medio de siembra hMMT cuidadosamente usando una pipeta y reemplace con 200 μL de medios de diferenciación precalentados que contengan 2% de suero de caballo, 1% de Pen/Strep, 4% de ACA (es decir, 2 mg/ml de concentración final de una concentración de stock de 50 mg/mL; % se expresa como v/v) y 10 μg/mL de insulina recombinante humana en DMEM. Este punto de tiempo se conoce como Día 0 de diferenciación.
    2. Cada dos días a partir de entonces, intercambie la mitad de los medios con medios de diferenciación frescos hasta el día 12 de diferenciación, el último día de la cultura(Figura 2a).
      NOTA: Los detalles del protocolo para fabricar hMMT utilizando mioblastos humanos primarios se han publicado en otra parte30. Si hay preocupaciones sobre la viabilidad celular después de la siembra, incube hMMT con calceína y yoduro de propidio para cuantificar la viabilidad.

4. Estimulación eléctrica y análisis de la postdespinción inducida por hMMT

  1. Configure un soporte de escenario de vidrio o plástico de fondo transparente en un microscopio invertido y conecte una cámara de teléfono inteligente al ocular del microscopio utilizando un soporte de cámara de microscopio. Se utilizará microscopía de contraste de fase con un aumento de 10x (Figura 3a).
    NOTA: Cualquier microscopio de contraste de fase invertida equipado con un objetivo de aumento de 10x será apropiado. Las construcciones del pozo PDMS se retirarán del plato de 10 cm y se colocarán directamente sobre el soporte de la etapa inferior transparente y, por lo tanto, se abrirán al aire. Esterilizar todas las superficies y equipos con etanol al 70% y minimizar el tráfico en el área durante la experimentación.
  2. Para preparar los electrodos de estimulación eléctrica, corte ~ 30 cm de alambre de cobre recubierto de estaño. Luego, comenzando en el cubo de una aguja biselada regular de 25 G, envuelva ~ 10 cm del cable firmemente alrededor de la mitad superior, dejando ~ 20 cm de exceso de alambre. Repita durante una segunda aguja y luego corte el cubo de cada aguja.
    NOTA: El cable debe estar apretado alrededor de la aguja para garantizar que no se mueva y la parte envuelta en alambre del electrodo no debe tocar el PDMS, ya que esto puede impedir la generación de campo eléctrico.
  3. Conecte BNC al cable conector del clip del cocodrilo a un canal de salida en el generador de forma de onda y configure el canal para pulsos cuadrados con un ciclo de trabajo del 20%, amplitud de 5 V (intensidad del campo eléctrico de 10 V / cm). La frecuencia se alterará entre 0,5 Hz y 20 Hz para las contracciones de contracción y tétanos, respectivamente.
    NOTA: La configuración del generador de forma de onda puede requerir una optimización específica del experimento
  4. Coloque una porción de placa Miotáctica que contenga hMMT en el escenario del microscopio e inserte suavemente cada extremo de bisel de electrodo en el PDMS directamente detrás de cada poste en la piscina ovalada. Pegue con cuidado las secciones de 20 cm de exceso de alambre hasta la etapa del microscopio para que las agujas permanezcan verticales y ~ 10 cm de cada cable permanezcan libres para la conexión(Figura 3a).
    PRECAUCIÓN: Nunca coloque un dedo desnudo sobre cualquiera de los extremos del electrodo. Asegúrese de que se use un dedal en el dedo índice para aplicar una ligera presión al electrodo al insertarlo en el PDMS.
  5. Enfoque el campo de visión del microscopio en uno de los dos postes, de modo que el enfoque sea nítido en el borde del poste más cercano al electrodo. Luego, bloquee el enfoque de la cámara del teléfono inteligente en el área más clara de la publicación. Esto es importante para el análisis posterior, ya que un cambio en el enfoque, mientras que la grabación interferirá con el análisis.
  6. Conecte los extremos libres de los cables con cinta adhesiva al generador de forma de onda a través de abrazaderas de cocodrilo (Figura 3a).
  7. Inicie la grabación de video en la cámara del teléfono inteligente y luego encienda la salida del canal para iniciar la estimulación. Inducir a la hMMT a someterse a 3 contracciones de contracción y 3 contracciones de tétanos, con 2 min de descanso entre la contracción y la serie de estimulación del tétanos.
  8. Apague la salida del canal, separe los clips de cocodrilo de los cables de cobre recubiertos de estaño, retire la cinta de los cables y limpie cada electrodo con etanol al 70% antes de insertarlo en los pozos hMMT posteriores. Repita el procedimiento del paso 4.5 para todos los hMMT.
    NOTA: Limite el tiempo que los hMMT pasan fuera de la incubadora estimulando no más de 3 tejidos a la vez. Si quedan por analizar hMMT adicionales dentro de la porción de la placa MyoTACTIC, devuelva la placa a la incubadora durante 10 minutos para permitir que las hMMT vuelvan a 37 °C.
  9. Para analizar la deflexión posterior para calcular la generación de fuerza hMMT, use el script personalizado, que se ha puesto a disposición en GitHub (https://github.com/gilbertlabcode/myoTACTIC). Siga las instrucciones de README.md para configurar e iniciar el script, luego abra cada video de seguimiento de publicaciones para realizar el análisis de fuerza.
  10. Seleccione una región de interés (ROI) a lo largo del borde de la publicación para realizar un seguimiento del desplazamiento de la publicación. Pulse Intro para confirmar el ROI y pulse Intro de nuevo para ejecutar el script ( Vídeocomplementario 1).
    NOTA: Las grandes deflexiones hacen que el rastreador falle. Si el rastreador falla durante la contracción, el tamaño del ROI se puede aumentar para que el seguimiento sea menos sensible, pero permite el seguimiento de grandes desviaciones. En el código se proporcionan tres tamaños y se pueden ajustar ajustando los comentarios del script.
  11. El script termina con dos requisitos de entrada. Primero, ingrese y para confirmar que el video contenía múltiples contracciones. En segundo lugar, escriba y (sí) o n (no) para exportar los resultados a un archivo . Archivo CSV (Video Suplementario 1).
  12. Asegúrese de que los resultados posteriores a la deflexión se informen como desplazamiento en píxeles para cada contracción. Convierta píxeles a valores de μm para la configuración de aumento de 10x del microscopio. Luego, convierta los números de desplazamiento posterior a fuerzas contráctiles absolutas (μN) multiplicando los valores (μm) por el factor de conversión fuerza-desplazamiento de 2.36 μN / μm, que corresponde a la relación agente de curado a monómero 1:15 del PDMS utilizado en la fabricación Miotáctica30.

5. Análisis transitorio de calcio mediante estimulación eléctrica

NOTA: Para los experimentos de manejo de calcio, los mioblastos inmortalizados se transdujeron de manera estable con el reportero MHCK7-GCAMP6 como se describió anteriormente11,12. Las células transducidas se clasificaron FACS para GFP para obtener la población positiva, y luego se utilizaron para fabricar hMMT. Los métodos alternativos para la obtención de imágenes de calcio, como el uso de colorantes métricos de proporción como Fura-2 AM e Indo-1 o imágenes de fluorescencia de por vida de indicadores de calcio (por ejemplo, Fluo-4 o Oregon Green BAPTA1) pueden ser susceptibles de nuestro sistema.

  1. Configure la etapa del microscopio y el equipo de estimulación (electrodos, generador de forma de onda, etc.) como se describió anteriormente en el paso 4. Para este experimento, utilice un aumento de 4x.
    NOTA: Se necesitará una habitación oscura y un microscopio de epifluorescencia equipado con una cámara CCD.
  2. Inicie el software de imágenes de microscopio, seleccione el canal de filtro FITC (luz azul) y seleccione la función de grabación de películas. Ajuste a una exposición de 500 ms y una resolución de 680 x 510 (Binning 2x2).
    NOTA: El software de imágenes puede variar y la exposición es configurada manualmente por el usuario. Tenga cuidado de evitar la hMMT sobre la exposición antes de la estimulación. En reposo, un contorno / sombra de tejido oscuro con fluorescencia espontánea es normal, mientras que una imagen de tejido claro está sobreexposición(Video suplementario 2). Asegúrese de que la exposición sea consistente para todos los hMMT dentro de un experimento.
  3. Cierre el obturador del microscopio y mantenga el canal FITC apagado hasta que esté listo para registrar el manejo del calcio.
  4. Cuando todo el equipo y el software estén configurados, recupere la porción de la placa MyoTACTIC que contiene los hMMT que se van a analizar y colóquela directamente en el escenario del microscopio. Luego, inserte y conecte los electrodos como se describió anteriormente en el paso 4.
  5. Utilice campo brillante para enfocar el campo de visión en el centro de la hMMT seleccionada. Luego, apague la lámpara.
  6. Abra el obturador de canal FITC del microscopio, confirme que la luz azul está encendida y, a continuación, seleccione Grabación de película en el software.
  7. Encienda la salida en el generador de forma de onda para iniciar la estimulación eléctrica. Inducir a la hMMT a sufrir 8 contracciones de contracción y 8 contracciones del tétanos. Permita 2 minutos de descanso entre la contracción y la serie de estimulación del tétanos, tiempo durante el cual el obturador FITC está en la posición cerrada.
    NOTA: Permita 10 s de actividad espontánea antes y después de la estimulación eléctrica para registrar la fluorescencia mínima para fines de cálculo y análisis de datos.
  8. Apague la salida del canal, separe los clips de cocodrilo de los cables de cobre recubiertos de estaño, retire la cinta de los cables y limpie cada electrodo con etanol al 70% antes de insertarlo en los pozos hMMT posteriores. Repetir el procedimiento de estimulación y registro para todos los hMMTs.
  9. Guarde películas en formato de archivo TIFF para su análisis en ImageJ o en un software de imágenes alternativo.
    NOTA: Limite el tiempo que los hMMT pasan fuera de la incubadora estimulando no más de 3 tejidos a la vez. Si queda por analizar hMMT adicional dentro de la porción de la placa MyoTACTIC, devuelva el dispositivo a la incubadora durante 10 minutos para permitir que los hMMT vuelvan a 37 °C.
  10. Para analizar los datos transitorios de calcio, primero abra ImageJ. Seleccione Analizar, luego Establecer medidas, luego seleccione el valor gris medio y anule la selección de todas las demás opciones. Cuando haya terminado, abra un video de calcio (.tiff) (Video suplementario 2).
  11. Describa el borde de la microtejida utilizando una herramienta de selección de polígonos y guarde esta área como el ROI (Video suplementario 2). En Más en la ventana administrador de ROI, seleccione Multimedición y mida la intensidad fluorescente para todos los segmentos de archivo en una fila por segmento (Vídeo suplementario 2).
  12. Copie todas las mediciones, incluido el número de rebanada (fotograma), en una hoja de cálculo y compare la intensidad fluorescente de cada rebanada con la intensidad fluorescente espontánea mínima del archivo utilizando ΔF / F0 = (Finmediato - Fmínimo) / Fmínimo ( Videosuplementario 2).
  13. Calcule el tiempo para cada fotograma multiplicando la velocidad del fotograma de grabación de vídeo por el número de segmento (fotograma), y trace ΔF/F0 contra el tiempo para la respuesta transitoria de calcio hMMT a la estimulación (Video suplementario 2).
  14. Seleccione la señal transitoria de calcio máximo para cada una de las 6 contracciones consecutivas y los valores promedio para calcular el cambio de intensidad fluorescente pico medio relativo de cada hMMT(Video suplementario 2).
    NOTA: Siempre excluya los datos que surjan de la primera contracción de contracción del análisis general. Se ha proporcionado una hoja de cálculo titulada "Plantilla de manejo de calcio.xlsx" en GitHub (https://github.com/gilbertlabcode/Calcium-Handling-Template-) para facilitar el análisis transitorio de calcio hMMT. Las celdas rellenables donde se van a introducir los valores y las entradas se resaltan en gris. Asegúrese de ajustar los números de selección de picos, ya que esta es solo una guía para ayudar en la selección de picos (Video suplementario 2).

Resultados

Aquí se describen métodos para fundir una plataforma de cultivo MyoTACTIC basada en PDMS de 96 pocillos desde un molde de PU, fabricar matrices de tejidos de réplica de hMMT y analizar dos aspectos de la función de hMMT dentro de la generación de fuerza del dispositivo de cultivo y el manejo de calcio. La Figura 1 ofrece una visión general esquemática de la preparación de los pocillos de cultivo MyoTACTIC antes de la siembra de hMMT. PDMS es un polímero a base de silicona ampliament...

Discusión

Este manuscrito describe métodos para fabricar y analizar un modelo de cultivo 3D hMMT que se puede aplicar a estudios de biología muscular básica, modelado de enfermedades o para pruebas de moléculas candidatas. La plataforma MyoTACTIC es rentable, fácil de fabricar y requiere un número relativamente pequeño de células para producir microtejidos musculares esqueléticos. Los hMMT formados dentro de la plataforma de cultivo MyoTACTIC están compuestos por miotubos alineados, multinucleados y estriados, y responde...

Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

Agradecimientos

Nos gustaría agradecer a Mohammad Afshar, Haben Abraha, Mohsen Afshar-Bakooshli y Sadegh Davoudi por contribuir a la invención de la plataforma de cultivo MyoTACTIC y establecer los métodos de fabricación y análisis descritos en este documento. HL recibió fondos de un Programa de Capacitación del Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería (NSERC) en Una Beca de Ingeniería y Emprendimiento Organ-on-a-Chip y una beca de posgrado Wildcat de la Universidad de Toronto. PMG es la Cátedra de Investigación de Canadá en Reparación Endógena y recibió apoyo para este estudio del Instituto de Medicina Regenerativa de Ontario, la Red de Células Madre y de Medicine by Design, un Programa de Excelencia en Investigación de Canadá First. Los diagramas esquemáticos se crearon con BioRender.com.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
0.9% Saline Solution, SterileHouse Brand101010 mL aliquots of the solution are made and stored at 4°C
25G NeedleBD, Medstore, University of Toronto2548-CABD305127
6-Aminocaproic Acid, ≥99% (titration), PowderSigma - AldrichA2504-100GA 50 mg / mL stock solution is generated by dissolving 5 mg of 6-aminocaproic acid powder in 100 mL of autoclaved, distilled water. The solution is vaccum filtered and 10 mL aliquots are stored at 4°C
6.35 mm ID TubingVWR60985-528
AB1167 Myoblast Cell LineInstitut de Myologie (Paris, France)
Arbitrary Waveform GeneratorRigolDG1022Z
Basement Membrane Extract (Geltrex)Thermo Fisher ScientificA14132-02Stored as aliquots of 50 µL or 100 µL at -80°C
Benchtop Vacuum ChamberSigma - AldrichD2672
BNC to Aligator Clip CableOrdered from Amazon
Culture PlasticsSarstedtIncludes culture plates, serological pipettes, etc
Dimethyl SulfoxideSigma - AldrichD8418-250ML
DPBS, Powder, No Calcium, No MagnesiumThermo Fisher Scientific21600069
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1X)Gibco11995-065This is a high glucose DMEM with L-glutamine and sodium pyruvate
Fetal Bovine SerumFisher Scientific10437028
Fibrinogen from Bovine PlasmaSigma - AldrichF8630-5GAliquots ranging from 7 - 10 mg of fibrinogen powder are made and stored at -20°C
Filtropur Syringe Filter, 0.22um Pore SizeSarstedt83.1826.001
Horse SerumGibco16050-122
Human Recombinant InsulinSigma - Aldrich91077CStock solution is 100X and made by dissolving 1 mg of human recombinant insulin in 1 mL of DMEM and 1 µL of NaOH 10N. Solution is filtered and stored as 1 mL aliquots at 4°C
Image Acquisition SoftwareOlympuscellSens Dimension
Image Processing SoftwareNational Institutes of HealthImageJ
Isotemp OvenThermo Fisher Scientific201
MicroscopeOlympusIX83
Microscope - Camera MountLabcamLabcam for iPhoneOrdered from Amazon
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)Gibco15140-122
Plastic Disposable Syringes, 1ccBD2606-309659
Plastic Disposable Syringes, 50ccBD2612-309653
Pluronic F-127, Powder, BioReagentSigma - AldrichP2443-250GA 5% stock solution of pluronic acid is made by dissolving 5 g of pluronic acid powder in 100 mL of chilled, autoclaved, distilled water. The solution is vaccum filtered and 10 mL aliquots are stored at 4°C
Polydimethylsiloxane (Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit)Dow4019862Kits are also available at Thermo Fisher Scientific, Sigma - Aldrich, etc.
Polyurethane Negative MoldIn House
Release AgentMann Release Technologies200
Rotary Vane Vacuum PumpEdwardsA65401906
ScalpelAlmedic, Medstore, University of Toronto2586-M36-0100
Single Edge Razor BladeVWR55411-050
Skeletal Muscle Cell Basal MediumPromocellC-2326030 mL aliquotes are generated and at stored at 4°C.
Skeletal Muscle Cell Growth Medium (Ready-to-use)PromocellC-2306042 mL aliquots are generated and stored at 4°C.
Smartphone (iPhone)AppleSE
Standard Duty Dry Vacuum PumpWelch2546B-01
Sterilization BagAlliance211-SCM2
ThimbleIgegeOrdered from Amazon
Thrombin from human plasmaSigma - AldrichT6884-250UN100 units of thrombin is dissolved in 1 mL of a 0.1% BSA solution. 10 µL aliquots are prepared and stored at - 20°C.
Tin coated copper wireArcoB8871K48Ordered from Amazon
Trypan Blue Solution, 0.4%Thermo Scientific15250061
Trypsin-EDTA, 0.25%Thermo FIsher Scientific25200072
Vacuum Chamber 2SP Bel-ArtF42027-0000

Referencias

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