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Resumo

Este manuscrito descreve um protocolo detalhado para produzir matrizes de microtissues musculares esqueléticos humanos 3D e minimamente invasivos a jusante em ensaios de função situ, incluindo força contraítil e análises de manuseio de cálcio.

Resumo

Modelos tridimensionais (3D) in vitro de músculo esquelético são um avanço valioso na pesquisa biomédica, pois oferecem a oportunidade de estudar a reforma muscular esquelética e funcionar em um formato escalável que é favorável a manipulações experimentais. Os sistemas de cultura muscular 3D são desejáveis, pois permitem que os cientistas estudem ex vivo muscular esquelético no contexto das células humanas. Modelos in vitro 3D imitam de perto aspectos da estrutura tecidual nativa do músculo esquelético adulto. No entanto, sua aplicação universal é limitada pela disponibilidade de plataformas simples de fabricar, custos e fáceis de usar, e produzem quantidades relativamente altas de tecidos musculares esqueléticos humanos. Além disso, uma vez que o músculo esquelético desempenha um importante papel funcional que é prejudicado ao longo do tempo em muitos estados da doença, uma plataforma experimental para estudos de microtissue é mais prática quando medidas minimamente invasivas de cálcio transitório e força contratil podem ser conduzidas diretamente dentro da própria plataforma. Neste protocolo, descreve-se a fabricação de uma plataforma de 96 poços conhecida como "MioTACTIC", e a produção em massa de microtissues musculares esqueléticos 3D (hMMTs). Além disso, são relatados os métodos para uma aplicação minimamente invasiva de estimulação elétrica que permite medições repetidas da força muscular esquelética e do manuseio de cálcio de cada microtissue ao longo do tempo.

Introdução

O músculo esquelético é um dos tecidos mais abundantes no corpo humano e suporta funções fundamentais do corpo, como locomoção, homeostase de calor e metabolismo1. Historicamente, modelos animais e sistemas bidimensionais (2D) de cultura celular têm sido utilizados para estudar processos biológicos e patogênese de doenças, bem como para testar compostos farmacológicos no tratamento de doenças musculares esqueléticas2,3. Embora os modelos animais tenham melhorado muito nosso conhecimento sobre músculo esquelético em saúde e em doenças, seu impacto translacional tem sido dificultado por altos custos, considerações éticas e diferenças entre espécies2,4. Ao recorrer a sistemas baseados em células humanas para estudar músculo esquelético, os sistemas de cultura celular 2D são favoráveis devido à sua simplicidade. No entanto, há uma limitação. Esse formato muitas vezes não consegue recapitular as interações de células células e células-matriz extracelulares que ocorrem naturalmente dentro do corpo5,6. Ao longo dos últimos anos, modelos de músculos esqueléticos tridimensionais (3D) surgiram como uma alternativa poderosa aos modelos animais inteiros e sistemas convencionais de cultura 2D, permitindo a modelagem de processos fisiologicamente e patologicamente relevantes ex vivo7,8. De fato, uma infinidade de estudos têm relatado estratégias para modelar o músculo esquelético humano em um formato de cultura 3D bioartificial1. Uma limitação para muitos desses estudos é que a força ativa é quantificada após a remoção dos tecidos musculares das plataformas culturais e o apego a um transdutor de força, que é destrutivo e, portanto, limitado a servir como um ensaio de ponto final9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 ,19,20,21. Outros projetaram sistemas culturais que permitem métodos não invasivos de medição da força ativa, mas nem todos são favoráveis a aplicações de teste de moléculas de alto conteúdo7,8,9,10,14,18,22,23,24,25,26,27,28 ,29.

Este protocolo descreve um método detalhado para fabricar microtissues musculares humanas (hMMTs) na plataforma microTissue Array deviCe To Investigate forCe (MyoTACTIC) do músculo esquelético (MyoTACTIC); um dispositivo de placa de 96 poços que suporta a produção em massa de microtissues musculares esqueléticas3D 30. O método de fabricação de placas mioTACTIC permite a geração de uma placa de cultura de polidimimetilaxitano (PDMS) de 96 poços e todas as características do poço correspondentes em uma única etapa de fundição, em que cada poço requer um número relativamente pequeno de células para formação de microtissue. Microtissues formados dentro do MioTACTIC contêm miótubos alinhados, estriados e multinucleados que são reprodutíveis do bem ao bem do dispositivo, e após a maturação, podem responder a estímulos químicos e elétricos no situ30. Aqui, a técnica de fabricação de um dispositivo de placa de cultura MyoTACTIC PDMS a partir de uma réplica de poliuretano (PU), um método otimizado para implementar células progenitoras miogênicas imortais para fabricar hMMTs, e a avaliação funcional das propriedades de geração de força hMMT e manuseio de cálcio são delineadas e discutidas.

Protocolo

1. Fabricação de placas mioTACTIC PDMS

NOTA: A fabricação da placa myoTACTIC PDMS requer um molde negativo pu, que pode ser fabricado como descrito anteriormente30. O arquivo SolidWorks (Computer-aided Design, design aided design" para o design da placa MyoTACTIC foi disponibilizado no GitHub (https://github.com/gilbertlabcode/MyoTACTIC-SolidWork-CAD-file).

  1. Prepare ~ 110 g de solução de polímero PDMS em um copo de plástico descartável a uma proporção de 1:15 de monômero para agente de cura usando os componentes no kit de elastômero de silicone. Mexa a solução de polímero por 2-3 min usando uma pipeta sorológica descartável de 5 mL até misturar completamente e homogêneo.
    ATENÇÃO: Evite o contato da solução de polímero PDMS com a pele e os olhos; e evitar a inalação. Use sempre um jaleco e luvas descartáveis ao manusear a mistura de PDMS líquido e consulte a Folha de Dados de Segurança (SDS) para protocolos específicos de segurança.
    NOTA: Proteja as superfícies do equipamento (por exemplo, escala, bancada, etc.) com uma cobertura descartável em caso de derramamento de solução de polímero PDMS.
  2. Desgas a mistura à temperatura ambiente colocando o copo dentro de uma câmara de vácuo de bancada conectada a uma bomba de vácuo seco padrão por ~30 min, ou até que todas as bolhas sejam removidas. Quebre o vácuo a cada 5-10 minutos para ajudar na desgaseamento. Use um barril de seringa vazio de 50 mL para mergulhar ar e soprar quaisquer bolhas restantes na superfície da mistura de polímeros, conforme necessário.
    NOTA : Um pedaço de tubo de 6,35 mm de ID pode ser usado para conectar uma ponta de pipeta P1250 ao barril para melhorar a velocidade e precisão da corrente de ar.
  3. Enquanto a solução de polímero PDMS estiver desgaseando, remova quaisquer pedaços restantes de PDMS aderidos ao molde negativo pu, limpando suavemente as bordas e a superfície com uma toalha de papel seco. Use ar comprimido de instalação, definido em 70-100 kPag para remover partículas finas restantes.
    NOTA: Proteja o molde negativo da PU contra danos e do acúmulo de partículas colocando-o em um saco plástico vedável e armazenando-o dentro de uma gaveta que está protegida do tráfego de laboratório.
  4. Coloque o molde pu em uma capa química que foi protegida com uma cobertura descartável. Coloque o molde horizontalmente a ~75° e pulverize a superfície ativa com uma camada uniforme de agente de liberação. Pulverize o molde de cima para baixo, depois da esquerda para a direita, enquanto segura a lata de 15-20 cm do molde e usando um fluido para frente e para trás varrendo o movimento. Gire o molde 180° e repita os sprays, depois deixe o molde pu sentar-se na capa química por 10-15 minutos para secar.
    ATENÇÃO: Certifique-se de que o agente de liberação seja usado dentro de uma coifa química, evite contato com a pele e os olhos e consulte a Ficha técnica de segurança (SDS) para obter protocolos de segurança específicos
    NOTA: Uma película fina precisa cobrir totalmente a superfície ativa, mas o revestimento excessivo pode ser transferido para o PDMS na próxima etapa, o que pode, por sua vez, impactar negativamente a semeadura do HMMT. A superfície deve se sentir escorregadia ao toque, mas não molhada.
  5. Despeje 100 g de PDMS uniformemente no molde pu e coloque dentro de uma câmara de vácuo conectada a uma bomba de vácuo de palhetas rotativa. Degas o molde preenchido pdms por ~45 min, quebrando o selo de vácuo a cada 5-10 minutos para os primeiros 20 minutos para acelerar o processo. Deixe dentro da câmara de vácuo até que a mistura PDMS esteja completamente vazia de todas as bolhas.
    NOTA: Uma bomba de vácuo de palheta rotativa é usada para obter um vácuo mais baixo e reduzir o tempo necessário para esta etapa. A desgaseamento do molde preenchido com PDMS pode ser realizada usando a câmara de vácuo benchtop e a bomba de vácuo seco padrão, no entanto, o tempo para anular a mistura de todas as bolhas será maior. O essencial é a remoção de todas as bolhas da solução de polímero PDMS, especialmente nas regiões destinadas a se tornarem postes de ancoragem do HMMT. Bolhas nesta região resultarão em quebra pós-âncora, perda de poços culturais, e por sua vez resultarão em um pequeno pedaço de PDMS permanecendo preso no molde.
  6. Transfira o molde pu recheado com PDMS para um forno de 65 °C, incubando durante a noite para curar a borracha líquida.
  7. Retire a placa positiva do PDMS curado do forno e esfrie a placa em temperatura ambiente por pelo menos 30 minutos.
  8. Com um bisturi sem lâminas, desprender suavemente PDMS curado do molde PU, executando a parte de trás da alça entre o PDMS e as paredes do molde. Comece ao longo da borda superior e separe todos os 4 lados, antes de empurrar para baixo para a base do molde e desacoplar esta porção. Esta etapa é completa quando a parte de trás da alça funciona sem problemas entre o PDMS e todas as 4 paredes do molde PU.
    NOTA: Trabalhe devagar e com cuidado com o bisturi sem lâmina para evitar quebrar o molde de PU ou rasgar o PDMS. Este passo deve levar de 15 a 20 minutos.
  9. A partir de uma extremidade, use o bisturi sem lâmina para levantar a borda do PDMS e trabalhar os dedos entre a placa de cultura PDMS curada e o molde de PU. Em seguida, usando ambas as mãos, empurre os dedos mais para baixo da placa, lentamente descascando e saindo do molde pu.
    NOTA: Trabalhe lentamente e use as duas mãos para descascar uniformemente a placa. Minimize a dobra para reduzir a probabilidade de quebra pós-âncora. Este passo deve levar de 5 a 10 minutos.
  10. Use uma lâmina de barbear de borda única para cortar a placa em grupos de 6 ± 2 poços MyoTACTIC(Figura 1) para fins de semeadura tecidual. Coloque placas mioTACTIC completas, ou porções de placa, em um saco de esterilização de instrumentos e autoclave para um ciclo seco de 25 minutos (20 minutos de tempo de esterilização, e 5 minutos de tempo seco) a 120 °C e 100-140 kPag.

2. Cultura de células progenitoras mió-assóis imortadas humanas

NOTA: Os míbios imortalizados utilizados neste protocolo foram obtidos do Institut de Myologie (Paris, França)31.

  1. Obtenha um frasco de células congeladas a partir do dewar de nitrogênio líquido e descongele rapidamente o frasco em um banho de água de 37 °C (em menos de 1 min). As células são congeladas a uma densidade de 7,5 x 105 células por 1 mL de mídia congelante consistindo de 90% de soro bovino fetal (FBS) e 10% de sulfóxido de dimetil (DMSO).
  2. Transfira suavemente o conteúdo do frasco para um tubo cônico de 15 mL contendo 9 mL de meio de lavagem pré-aquecido, consistindo em 89% DMEM 1x, 10% FBS e 1% Caneta/Estreptococos para diluir o DMSO. Gire o tubo cônico de 15 mL a 400 x g por 10 min e, em seguida, aspire a mídia tomando cuidado para evitar a pelota celular.
  3. Resuspenque a pelota em 1 mL de mídia de crescimento consistindo de 84% de músculo esquelético basal médio com mistura de suplemento de crescimento de células musculares esqueléticas, 15% FBS e 1% Pen/Strep e, em seguida, transferir para um tubo cônico de 50 mL com 29 mL de mídia de crescimento.
  4. Transfira 10 mL de mídia contendo aproximadamente 2,5 x 105 células em um prato de cultura celular de 100 mm x 20 mm. Repita esta etapa com os 20 mL restantes da solução celular. Em seguida, transfira pratos de cultura celular para uma incubadora de cultura celular umidificada definida para 37 °C e 5% de CO2.
  5. Refrescar a mídia cultural dia não. Cultuem as células até atingirem ~ 70%-80% de confluência (tipicamente 4-5 dias), momento em que as células estão preparadas para semeadura. 1,5 x 105 células são necessárias para gerar cada hMMT. Portanto, passar as células conforme necessário para alcançar o número necessário de células.
    NOTA: As linhas celulares progenitoras mioblastizadas imortalizadas nunca devem exceder 80% de confluência antes de semear células em poços mioTACTIC, passar as células ou preparar estoques congeladores. hMMTs fabricados a partir de células que excederam 80% de confluência muitas vezes não conseguem atingir o vencimento contracttil. Os procedimentos de passagem são idênticos aos métodos descritos abaixo na etapa 3.

3. HMMTs projetados de sementes com MyoTACTIC

  1. Preparação de poços de cultura mioTACTIC e reagentes para semeadura hMMT.
    NOTA: Este protocolo fornece detalhes específicos para produzir 6 hMMTs.
    1. 2-3 h antes da semeadura celular, coloque uma porção de placa myoTACTIC de 6 poços em um prato de cultura celular de 10 cm. Prepare bem cada cultura myoTACTIC individual adicionando 100 μL de uma solução F-127 Plurônica de 5% em cada poço. Coloque a tampa no prato de cultura de 10 cm, aplique parafina para selar o espaço entre o prato de 10 cm e a tampa e, em seguida, coloque a placa de 10 cm contendo a porção MyoTACTIC em uma centrífuga equipada com um adaptador de rotador de placas.
      NOTA: Se um adaptador rotador de placa centrífuga não estiver disponível, uma ponta de pipeta p20 pode ser usada para remover cuidadosamente bolhas de trás dos postes, garantindo assim que toda a superfície da cultura seja revestida uniformemente.
    2. Centrifugar a 1.550 x g por 1 min para remover todas as bolhas dentro de poços de cultura, especialmente atrás dos postes. Armazene o prato de cultura celular de 10 cm contendo a porção da placa MyoTACTIC contendo solução Pluronic F-127 a 4 °C até que as células estejam preparadas para semeadura.
      NOTA: O revestimento Pluronic F-127 pode ser aplicado por apenas 2 h a até 24 h. Por exemplo, os poços podem ser preenchidos com solução Pluronic F-127 no final do dia para uso no dia seguinte. Não exceda 24 horas, pois isso afetará negativamente a remodelação do HMMT e não formará tecidos saudáveis que atinjam a maturidade contraída.
    3. Descongele lentamente uma alíquota de extrato de membrana de porão de 50 μL e uma alíquota de 10 μL de trombina (solução de estoque de 100 U/mL) no gelo dentro da capa de cultura.
      NOTA: Não congele novamente as alíquotas do extrato da membrana do porão. Eles são de uso único. As alíquotas de trombina são reutilizáveis, portanto, congelam até 5 vezes após o uso.
    4. Pese ~7 mg de fibrinogênio em pó em um tubo de microcentrifuuge de 1,5 mL e depois transfira para a capa de cultura celular. Adicione 700 μL de 0,9% (wt/vol) solução NaCl em água (ou solução salina) para chegar a uma solução de concentração final de 10 mg/mL. Não faça fibrinogena de vórtice para dissolver, em vez disso coloque o tubo em uma incubadora de cultura celular de 37 °C por 3-5 min.
    5. Remova e gire o tubo suavemente, em seguida, gire a solução dissolvida em uma mini centrífuga de bancada (microfuge) e retorne ao capô da cultura. Filtre a solução de fibrinogênio usando uma seringa de 1 mL equipada com um filtro de seringa de 0,22 μm. Transfira a solução de fibrinogênio dissolvida para gelo ao lado do extrato de membrana do porão e alíquotas de trombina.
    6. Por fim, prepare a mídia de semeadura hMMT que será introduzida nos poços de cultura após a semeadura dos tecidos. Esta mídia contém o meio basal de células musculares esqueléticas complementado com 20% de FBS, 1% P/S e 3% ácido 6-aminocaproic (ACA; 1,5 mg/mL de concentração final é obtido pela diluição de uma solução de estoque de 50 mg/mL; % é expressa como v/v). Pré-aqueça a mídia a 37 °C antes de usar.
  2. Preparação de células para semeadura hMMT.
    1. Recolhe as placas de cultura celular da incubadora de cultura. Aspire a mídia de cada placa e, em seguida, lave as células uma vez com D-PBS adicionando 5 mL de D-PBS em cada placa de cultura. Em seguida, aspire o D-PBS e desprende as células adicionando 1 mL de 0,25% Trypsin-EDTA em cada prato de cultura. Coloque na incubadora de cultura celular por 3 minutos.
    2. Pare a trippsina adicionando 3 mL de meio de lavagem (89% de 1x DMEM + 10% FBS + 1% Caneta/Estreptococos) ao prato de cultura. Transfira a solução celular para um tubo cônico de tamanho apropriado e, em seguida, pelota as células por centrifugação a 400 x g por 10 min. Aspire a mídia tomando cuidado para evitar a pelota celular. Em seguida, resuspense a pelota celular em 1 mL do meio de lavagem.
    3. Conte as células usando um hemócito e um corante azul trypan sob microscopia de campo brilhante.
      Se usar várias placas de células, esta suspensão celular será muito concentrada. Diluir suspensões celulares antes da contagem conforme necessário.
    4. Uma vez que cada tecido requer 150.000 células resuspended em 15 μL da mistura de matriz extracelular (ECM), 900.000 células em 90 μL de mistura de ECM é necessária para 6 tecidos. Para explicar a perda da solução cell-ECM que ocorre durante o processo de preparação devido à formação de bolhas ou perda de pipeta, prepare a mistura celular-ECM extra (ou seja, 8 tecidos, ou 1.200.000 células em 120 μL de ECM). Transfira o volume de suspensão celular contendo 1.200.000 células para um novo tubo cônico. Aumente o volume para 10 mL com meio de lavagem e gire a 400 x g por 10 min.
    5. Enquanto as células estão girando para baixo, prepare a mistura de 150 μL ECM em um tubo de microcentrifuuge de 1,5 mL usando a seguinte receita. Primeiro adicione 60 μL de DMEM (volume de 40%), depois adicione 60 μL de solução Fibrinogen 10 mg/mL (40% de volume) e, por último, adicione 30 μL de extrato de membrana de porão (20% de volume). Armazene a mistura de ECM no gelo até usar.
      NOTA: Use sempre as pontas pré-refrigeradas a -20 °C ao trabalhar com soluções que contenham extrato de membrana do porão. A mistura ECM contém 4 mg/mL de fibrinogênio.
  3. HMMTs de semeadura
    1. Colete o tubo cônico contendo as células giradas e aspire a mídia tomando cuidado para evitar a pelota celular. Flicke vigorosamente a extremidade do tubo com um dedo enluvado para desalojar a pelota e continue piscando até que a pelota apareça como um chorume celular.
      NOTA: É importante aspirar o máximo de mídia de lavagem possível para garantir que a suspensão celular-ECM esteja na diluição desejada. Use uma pipeta para remover a mídia restante, se necessário.
    2. Transfira 120 μL da solução ECM para o tubo que contém a pelota celular. Pipeta para cima e para baixo para resususpensar completamente as células dentro do ECM para gerar uma única suspensão celular. Pipeta lentamente e cuidadosamente para evitar a introdução de bolhas, o que reduziria o volume de trabalho. Em seguida, coloque a solução cell-ECM no gelo até usar.
    3. Recupere porções de placas mioTACTIC contendo poços MioTACTIC revestidos plurônicos F-127 da geladeira de 4 °C e coloque o prato de 10 cm contendo os poços MyoTACTIC em cima de uma bolsa de gelo dentro do capô da cultura celular.
    4. Aspire a solução Pluronic F-127 de cada poço. O PDMS é poroso e absorverá a solução Pluronic F-127, especialmente se as placas forem giradas com uma centrífuga. Permita que a solução plurônica residual F-127 seja liberada e se acomode até o fundo do poço, deixando os poços sentarem por 5 minutos e, em seguida, aspirar novamente.
      NOTA: Use uma pipeta Pasteur com uma ponta p1250 anexada no final, e uma ponta p200 sobre a ponta p1250 ao aspirar a solução Pluronic F-127. Isso melhorará a precisão para evitar a aspiração acidental das estruturas postais. Evite raspar a área de semeadura de células em forma de piscina oval na parte inferior do poço com a pipeta, pois isso interrompe o revestimento Pluronic F-127 e interfere no processo de auto-organização do HMMT. A técnica adequada é pairar a ponta da pipeta logo acima da piscina oval enquanto aspira a solução Pluronic F-127.
    5. Pipete a suspensão cell-ECM cuidadosamente para resuspensar quaisquer células que possam ter afundado na parte inferior do tubo. Em seguida, transfira 105 μL de suspensão cell-ECM para um tubo fresco e pré-refrigerado de 1,5 mL. Tome cuidado para agarrar o tubo perto da parte superior para evitar que a solução aqueça.
    6. Adicione 0,84 μL da solução de estoque de trombina U/mL de 100 U/mL à suspensão de 105 μL de célula-ECM para chegar a uma concentração final de 0,2 U/mg de fibrinogênio. Pipeta rapidamente, cuidadosamente e cuidadosamente para misturar, evitando a introdução de bolhas.
      NOTA: A trombina inicia a rápida conversão de fibrinogênio em um coágulo de fibrina. Como tal, há pouco tempo para semear os tecidos após a adição de trombina. Para evitar a coagulação prematura antes que a mistura célula-ECM seja transferida para os poços de cultura, defina uma pipeta p20 para 15 μL antes de adicionar a trombina. Use pontas pré-refrigeradas ou mergulhe a ponta da pipeta em DMEM gelado por alguns segundos antes de coletar e transferir 15 μL da mistura celular-ECM em cada poço. É uma prática recomendada para preparar alíquotas de mistura celular-ECM, de modo que não mais do que 6 hMMTs são semeados por vez.
    7. Para semear os tecidos, adicione 15 μL de mistura celular-ECM (ou seja, 150.000 células) a cada bem individual. Adicione cuidadosamente a mistura cell-ECM ao centro da piscina oval e evite pressionar a ponta da pipeta na parte inferior do poço. Em seguida, com dois movimentos leves, espalhe a suspensão da célula atrás de cada poste no poço. Uma vez que a superfície esteja uniformemente revestida na suspensão célula-ECM, passe para o próximo poço.
      NOTA: Trabalhe eficientemente para evitar a gelação prematura da mistura célula-ECM no tubo antes que todos os tecidos sejam semeados. Ao semear os poços, é extremamente importante evitar a transferência de bolhas, pois a bolha interferirá na remodelação do hMMT, tornando o hMMT inutilizável.
    8. Coloque a tampa na placa de cultura de 10 cm contendo os poços semeados e transfira para uma incubadora de cultura tecidual de 37 °C por aproximadamente 5 minutos.
      NOTA: Coloque o tubo de microcentrifutura com mistura de células residuais ECM na incubadora como confirmação do processo de polimerização do gel.
    9. Depois que a mistura célula-ECM tiver polimerizado, adicione 200 μL de mídia de semeadura hMMT pré-armada a cada poço MyoTACTIC. Substitua a tampa do prato de 10 cm e devolva as porções da placa MyoTACTIC dentro da placa de 10 cm para a incubadora. Este ponto de tempo é referido como Dia -2. Não perturbe os tecidos até o próximo passo.
  4. Diferenciando hMMTs
    1. Após 2 dias de incubação, remova a mídia de semeadura hMMT cuidadosamente usando uma pipeta e substitua por 200 μL de mídia de diferenciação pré-armada contendo 2% de soro de cavalo, 1% Caneta/Estreptococos, 4% ACA (ou seja, concentração final de 2 mg/mL a partir de uma concentração de estoque de 50 mg/mL; % é expressa como v/v) e 10 μg/mL insulina recombinante humana em DMEM. Este ponto de tempo é referido como dia 0 de diferenciação.
    2. A cada dois dias depois, troque metade da mídia com novos meios de diferenciação até o dia 12 de diferenciação, o último dia de cultura (Figura 2a).
      NOTA: Detalhes do protocolo para fabricar hMMTs usando myoblasts humanos primários foram publicados em outros lugares30. Se houver preocupações com a viabilidade celular pós-semeadura, incubar hMMTs com calceína e iodeto de propídio para quantificar a viabilidade.

4. Estimulação elétrica e análise da deflexão pós-induzida pelo HMMT

  1. Configure um vidro de fundo claro ou um suporte de palco plástico em um microscópio invertido e conecte uma câmera de smartphone à ocular do microscópio usando um suporte de câmera de microscópio. Serão utilizadas microscopia de contraste de fase a 10x de ampliação(Figura 3a).
    NOTA: Qualquer microscópio de contraste de fase invertido equipado com um objetivo de ampliação de 10x será apropriado. Os bem-construtos do PDMS serão removidos do prato de 10 cm e colocados diretamente sobre a montagem do palco inferior claro e, portanto, aberto ao ar. Esterilize todas as superfícies e equipamentos com 70% de etanol e minimize o tráfego na área durante a experimentação.
  2. Para preparar os eletrodos de estimulação elétrica, corte ~30 cm de fio de cobre revestido de estanho. Em seguida, começando no cubo de uma agulha de bivel de 25 G regular, enrole ~10 cm do fio firmemente ao redor da metade superior, deixando ~20 cm de excesso de fio. Repita por uma segunda agulha e, em seguida, corte o cubo de cada agulha.
    NOTA: O fio deve estar apertado ao redor da agulha para garantir que ele não se mova e a porção envolta em arame do eletrodo não deve tocar no PDMS, pois isso pode impedir a geração de campo elétrico.
  3. Conecte o BNC ao cabo conector do clipe de jacaré a um canal de saída no gerador de forma de onda e defina o canal para pulsos quadrados com ciclo de 20% de responsabilidade, amplitude de 5 V (força elétrica do campo de 10 V/cm). A frequência será alterada entre 0,5 Hz e 20 Hz para contrações de contração de tétano e tétano, respectivamente.
    NOTA: As configurações do gerador de forma de onda podem exigir otimização específica do experimento
  4. Coloque uma porção de placa MioTACTIC contendo hMMTs no estágio do microscópio e insira suavemente cada extremidade de velo de eletrodo no PDMS diretamente atrás de cada poste na piscina oval. Corte cuidadosamente as seções de 20 cm de excesso de fio até o estágio do microscópio para que as agulhas permaneçam verticais e ~10 cm de cada fio permaneça livre para conexão(Figura 3a).
    ATENÇÃO: Nunca coloque um dedo nu sobre qualquer extremidade do eletrodo. Certifique-se de que um dedal é usado no dedo indicador para aplicar pressão leve ao eletrodo na inserção no PDMS.
  5. Concentre o campo de visão do microscópio em um dos dois postes, de modo que o foco seja afiado na borda do poste mais próxima do eletrodo. Em seguida, bloqueie o foco da câmera do smartphone para a área mais clara do poste. Isso é importante para a análise a jusante como uma mudança de foco enquanto a gravação interferirá na análise.
  6. Conecte as extremidades livres dos fios colados ao gerador de forma de onda através de grampos de jacaré(Figura 3a).
  7. Inicie a gravação de vídeo na câmera do smartphone e, em seguida, ligue a saída do canal para iniciar a estimulação. Induzir o hMMT a sofrer 3 contrações de contração de tétano e 3 tétanos, com 2 minutos de descanso entre a série de estimulação do contração e tétano.
  8. Desligue a saída do canal, retire os clipes de jacaré dos fios de cobre revestidos de lata, remova a fita dos fios e limpe cada eletrodo com 70% de etanol antes de inserir em poços hMMT subsequentes. Repetir o procedimento da etapa 4.5 para todos os hMMTs.
    NOTA: Limite o tempo que os HMMTs passam fora da incubadora estimulando não mais do que 3 tecidos por vez. Se ainda houver hMMTs adicionais dentro da porção da placa MyoTACTIC, devolva a placa à incubadora por 10 minutos para permitir que os HMMTs retornem a 37 °C.
  9. Para analisar a deflexão pós-desflexão de modo a calcular a geração de força hMMT, use o script personalizado, que foi disponibilizado no GitHub (https://github.com/gilbertlabcode/myoTACTIC). Siga as instruções em README.md para configurar e iniciar o script e, em seguida, abra cada vídeo de rastreamento de postagem para realizar a análise da força.
  10. Selecione uma região de interesse (ROI) ao longo da borda do post para ser rastreada para deslocamento pós-deslocamento. Pressione Enter para confirmar o ROI e pressione Enter novamente para executar o script (Vídeo Suplementar 1).
    NOTA: Grandes desvios fazem com que o rastreador falhe. Se o rastreador falhar durante a contração, o tamanho do ROI pode ser aumentado para tornar o rastreamento menos sensível, mas permitir o rastreamento de grandes deflexões. Três tamanhos são fornecidos no código e podem ser ajustados ajustando os comentários do script.
  11. O script termina com dois requisitos de entrada. Primeiro, digite y para confirmar que o vídeo continha múltiplas contrações. Em segundo lugar, digite y (sim) ou n (não) para exportar resultados para um . Arquivo CSV (Vídeo Suplementar 1).
  12. Certifique-se de que os resultados pós-deflexão sejam relatados como deslocamento em pixels para cada contração. Converta pixels em valores de μm para a configuração de ampliação do microscópio 10x. Em seguida, converta os números pós-deslocamento em forças contratuais absolutas (μN) multiplicando valores (μm) pelo fator de conversão de deslocamento de força de 2,36 μN / μm, o que corresponde ao agente de cura de 1:15 para a razão monômero do PDMS utilizado na fabricação mioTACTIC30.

5. Análise transitória de cálcio utilizando estimulação elétrica

NOTA: Para experimentos de manuseio de cálcio, os míbios imortalizados foram transduzidos com o repórter MHCK7-GCAMP6, como descrito anteriormente11,12. As células transduzidas foram facs classificadas para GFP para obter a população positiva e, em seguida, utilizadas para fabricar hMMTs. Métodos alternativos para imagens de cálcio, como o uso de corantes razão-métricas como Fura-2 AM e Indo-1 ou imagens de fluorescência ao longo da vida de indicadores de cálcio (por exemplo, Fluo-4 ou Oregon Green BAPTA1) podem ser favoráveis ao nosso sistema.

  1. Configure o estágio do microscópio e o equipamento de estimulação (eletrodos, gerador de forma de onda, etc.) como descrito anteriormente na etapa 4. Para este experimento, use uma ampliação 4x.
    NOTA: Será necessário um quarto escuro e um microscópio de epifluorescência equipado com uma câmera CCD.
  2. Inicie o software de imagem de microscópio, selecione o canal do filtro FITC (luz azul) e selecione a função de gravação de filme. Fixado em uma exposição de 500 ms e uma resolução de 680 x 510 (Binning 2x2).
    NOTA: O software de imagem pode variar e a exposição é definida manualmente pelo usuário. Tome cuidado para evitar a exposição hMMT antes da estimulação. Em repouso, um contorno/sombra de tecido escuro com fluorescência espontânea é normal enquanto uma imagem de tecido claro é sobre-exposição(Vídeo Suplementar 2). Certifique-se de que a exposição é consistente para todos os HMMTs dentro de um experimento.
  3. Feche o obturador do microscópio e mantenha o canal FITC desligado até que esteja pronto para registrar o manuseio do cálcio.
  4. Quando todos os equipamentos e softwares estiver configurados, recupere a porção da placa MyoTACTIC contendo os hMMTs a serem analisados e coloque-o diretamente no estágio do microscópio. Em seguida, insira e conecte eletrodos como descrito anteriormente na etapa 4.
  5. Use o brightfield para concentrar o campo de visão no centro do hMMT selecionado. Em seguida, desligue a lâmpada.
  6. Abra o obturador do canal FITC do microscópio, confirme que a luz azul está acesa e selecione Registro de filme no software.
  7. Ligue a saída do gerador de forma de onda para iniciar a estimulação elétrica. Induzir o hMMT a sofrer 8 contrações de contração de tétano e 8 tétanos. Deixe por 2 minutos de descanso entre a série de estimulação do contração e tétano, durante o qual o obturador FITC está na posição fechada.
    NOTA: Permitir que 10 s de atividade espontânea antes e depois da estimulação elétrica regissuça mínima para fins de cálculo e análise de dados.
  8. Desligue a saída do canal, desprende os clipes de jacaré dos fios de cobre revestidos de lata, remova a fita dos fios e limpe cada eletrodo com 70% de etanol antes de inserir em poços hMMT subsequentes. Repita o procedimento de estimulação e gravação para todos os hMMTs.
  9. Salve filmes em formato de arquivo TIFF para análise no ImageJ ou software de imagem alternativa.
    NOTA: Limite o tempo que os HMMTs passam fora da incubadora estimulando não mais do que 3 tecidos por vez. Se ainda houver uma análise adicional da hMMT dentro da porção da placa MyoTACTIC, devolva o dispositivo à incubadora por 10 minutos para permitir que os HMMTs retornem a 37 °C.
  10. Para analisar dados transitórios de cálcio, primeiro abra ImageJ. Selecione Analisar, em seguida, definir medidas, em seguida, selecione o Valor Cinza Médio e desmarque todas as outras opções. Quando concluído, abra um vídeo de cálcio (.tiff)(Vídeo Suplementar 2).
  11. Delineie a borda do microtissue usando uma ferramenta de seleção de polígonos e salve esta área como o ROI (Vídeo Suplementar 2). Em Mais na janela ROI Manager, selecione Multi Measure e meça a intensidade fluorescente para todas as fatias de arquivo em uma linha por fatia(Vídeo Suplementar 2).
  12. Copie todas as medidas, incluindo o número de fatia (quadro), a uma planilha e compare a intensidade fluorescente de cada fatia com a intensidade fluorescente espontânea mínima do arquivo usando ΔF/F0 = (Fimediatamente - Fmínimo)/Fmínimo (Vídeo Suplementar 2).
  13. Calcule o tempo para cada quadro multiplicando a velocidade do quadro de gravação do filme por número de fatia (quadro) e plote ΔF/F0 contra o tempo para a resposta transitória de cálcio hMMT à estimulação(Vídeo Suplementar 2).
  14. Selecione o sinal transitório de cálcio de pico para cada uma das 6 contrações consecutivas e valores médios para calcular a variação média média de intensidade fluorescente de pico relativo de cada hMMT(Vídeo Suplementar 2).
    NOTA: Exclua sempre os dados decorrentes da primeira contração do contração da análise geral. Uma planilha intitulada "Calcium Handling Template.xlsx" foi fornecida no GitHub (https://github.com/gilbertlabcode/Calcium-Handling-Template-) para facilitar a análise transitória de cálcio hMMT. As células preenchíveis onde os valores e entradas devem ser inseridos são destacados em cinza. Certifique-se de ajustar os números de seleção de pico, pois este é apenas um guia para ajudar na seleção de pico(Vídeo Suplementar 2).

Resultados

Descritos aqui são métodos para lançar uma plataforma de cultura mioTACTIC baseada em PDMS de 96 poços a partir de um molde pu, para fabricar matrizes de tecidos de réplica hMMT, e para analisar dois aspectos da função hMMT dentro da geração de força de dispositivo de cultura e manuseio de cálcio. A Figura 1 oferece uma visão geral esquemática da preparação dos poços de cultura MioTACTIC antes da semeadura do HMMT. PDMS é um polímero à base de silicone amplamente utilizado...

Discussão

Este manuscrito descreve métodos para fabricar e analisar um modelo de cultura 3D hMMT que pode ser aplicado a estudos de biologia muscular básica, modelagem de doenças ou para testes de moléculas de candidatos. A plataforma MyoTACTIC é amigável ao custo, fácil de fabricar, e requer um número relativamente pequeno de células para produzir microtissues musculares esqueléticas. os hMMTs formados dentro da plataforma de cultura MioTACTIC são compostos por miótubos alinhados, multinucleados e estriados, e respond...

Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse para declarar.

Agradecimentos

Gostaríamos de agradecer a Mohammad Afshar, Haben Abraha, Mohsen Afshar-Bakooshli e Sadegh Davoudi por contribuir para a invenção da plataforma de cultura MioTACTIC e estabelecer os métodos de fabricação e análise aqui descritos. A HL recebeu financiamento de um Programa de Treinamento do Conselho de Pesquisa em Ciências Naturais e Engenharia (NSERC) em Bolsa de Engenharia e Empreendedorismo de Órgãos e Empreendedorismo e de bolsas de pós-graduação da Universidade de Toronto Wildcat. PmG é a Cadeira de Pesquisa do Canadá em Reparação Endógena e recebeu apoio para este estudo do Instituto de Medicina Regenerativa de Ontário, da Rede de Células-Tronco e da Medicina por Design, um Programa de Excelência em Primeira Pesquisa do Canadá. Diagramas esquemáticos foram criados com BioRender.com.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
0.9% Saline Solution, SterileHouse Brand101010 mL aliquots of the solution are made and stored at 4°C
25G NeedleBD, Medstore, University of Toronto2548-CABD305127
6-Aminocaproic Acid, ≥99% (titration), PowderSigma - AldrichA2504-100GA 50 mg / mL stock solution is generated by dissolving 5 mg of 6-aminocaproic acid powder in 100 mL of autoclaved, distilled water. The solution is vaccum filtered and 10 mL aliquots are stored at 4°C
6.35 mm ID TubingVWR60985-528
AB1167 Myoblast Cell LineInstitut de Myologie (Paris, France)
Arbitrary Waveform GeneratorRigolDG1022Z
Basement Membrane Extract (Geltrex)Thermo Fisher ScientificA14132-02Stored as aliquots of 50 µL or 100 µL at -80°C
Benchtop Vacuum ChamberSigma - AldrichD2672
BNC to Aligator Clip CableOrdered from Amazon
Culture PlasticsSarstedtIncludes culture plates, serological pipettes, etc
Dimethyl SulfoxideSigma - AldrichD8418-250ML
DPBS, Powder, No Calcium, No MagnesiumThermo Fisher Scientific21600069
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1X)Gibco11995-065This is a high glucose DMEM with L-glutamine and sodium pyruvate
Fetal Bovine SerumFisher Scientific10437028
Fibrinogen from Bovine PlasmaSigma - AldrichF8630-5GAliquots ranging from 7 - 10 mg of fibrinogen powder are made and stored at -20°C
Filtropur Syringe Filter, 0.22um Pore SizeSarstedt83.1826.001
Horse SerumGibco16050-122
Human Recombinant InsulinSigma - Aldrich91077CStock solution is 100X and made by dissolving 1 mg of human recombinant insulin in 1 mL of DMEM and 1 µL of NaOH 10N. Solution is filtered and stored as 1 mL aliquots at 4°C
Image Acquisition SoftwareOlympuscellSens Dimension
Image Processing SoftwareNational Institutes of HealthImageJ
Isotemp OvenThermo Fisher Scientific201
MicroscopeOlympusIX83
Microscope - Camera MountLabcamLabcam for iPhoneOrdered from Amazon
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)Gibco15140-122
Plastic Disposable Syringes, 1ccBD2606-309659
Plastic Disposable Syringes, 50ccBD2612-309653
Pluronic F-127, Powder, BioReagentSigma - AldrichP2443-250GA 5% stock solution of pluronic acid is made by dissolving 5 g of pluronic acid powder in 100 mL of chilled, autoclaved, distilled water. The solution is vaccum filtered and 10 mL aliquots are stored at 4°C
Polydimethylsiloxane (Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit)Dow4019862Kits are also available at Thermo Fisher Scientific, Sigma - Aldrich, etc.
Polyurethane Negative MoldIn House
Release AgentMann Release Technologies200
Rotary Vane Vacuum PumpEdwardsA65401906
ScalpelAlmedic, Medstore, University of Toronto2586-M36-0100
Single Edge Razor BladeVWR55411-050
Skeletal Muscle Cell Basal MediumPromocellC-2326030 mL aliquotes are generated and at stored at 4°C.
Skeletal Muscle Cell Growth Medium (Ready-to-use)PromocellC-2306042 mL aliquots are generated and stored at 4°C.
Smartphone (iPhone)AppleSE
Standard Duty Dry Vacuum PumpWelch2546B-01
Sterilization BagAlliance211-SCM2
ThimbleIgegeOrdered from Amazon
Thrombin from human plasmaSigma - AldrichT6884-250UN100 units of thrombin is dissolved in 1 mL of a 0.1% BSA solution. 10 µL aliquots are prepared and stored at - 20°C.
Tin coated copper wireArcoB8871K48Ordered from Amazon
Trypan Blue Solution, 0.4%Thermo Scientific15250061
Trypsin-EDTA, 0.25%Thermo FIsher Scientific25200072
Vacuum Chamber 2SP Bel-ArtF42027-0000

Referências

  1. Frontera, W. R., Ochala, J. Skeletal Muscle: A brief review of structure and function. Calcified Tissue International. 96 (3), 183-195 (2015).
  2. McGreevy, J. W., Hakim, C. H., McIntosh, M. A., Duan, D. Animal models of Duchenne muscular dystrophy: From basic mechanisms to gene therapy. DMM Disease Models and Mechanisms. 8 (3), 195-213 (2015).
  3. Young, J., et al. MyoScreen, a high-throughput phenotypic screening platform enabling muscle drug discovery. SLAS Discovery. 23 (8), 790-806 (2018).
  4. DiMasi, J. A., Hansen, R. W., Grabowski, H. G. The price of innovation: New estimates of drug development costs. Journal of Health Economics. 22 (2), 151-185 (2003).
  5. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
  6. Duval, K., et al. Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture. Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).
  7. Vandenburgh, H., et al. Drug-screening platform based on the contractility of tissue-engineered muscle. Muscle and Nerve. 37 (4), 438-447 (2008).
  8. Vandenburgh, H., et al. Automated drug screening with contractile muscle tissue engineered from dystrophic myoblasts. The FASEB Journal. 23 (10), 3325-3334 (2009).
  9. Kim, J. H., et al. 3D bioprinted human skeletal muscle constructs for muscle function restoration. Scientific Reports. 8 (1), 12307 (2018).
  10. Takahashi, H., Shimizu, T., Okano, T. Engineered human contractile myofiber sheets as a platform for studies of skeletal muscle physiology. Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).
  11. Afshar Bakooshli, M., et al. A 3D culture model of innervated human skeletal muscle enables studies of the adult neuromuscular junction. eLife. 8, 1-29 (2019).
  12. Madden, L., Juhas, M., Kraus, W. E., Truskey, G. A., Bursac, N. Bioengineered human myobundles mimic clinical responses of skeletal muscle to drugs. eLife. 2015 (4), 3-5 (2015).
  13. Urciuolo, A., et al. Engineering a 3D in vitro model of human skeletal muscle at the single fiber scale. PLoS One. 15 (5), 0232081 (2020).
  14. Cvetkovic, C., Rich, M. H., Raman, R., Kong, H., Bashir, R. A 3D-printed platform for modular neuromuscular motor units. Microsystems & Nanoengineering. 3 (1), 1-9 (2017).
  15. Shima, A., Morimoto, Y., Sweeney, H. L., Takeuchi, S. Three-dimensional contractile muscle tissue consisting of human skeletal myocyte cell line. Experimental Cell Research. 370 (1), 168-173 (2018).
  16. Capel, A. J., et al. Scalable 3D printed molds for human tissue engineered skeletal muscle. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 20 (2019).
  17. Gholobova, D., et al. Human tissue-engineered skeletal muscle: a novel 3D in vitro model for drug disposition and toxicity after intramuscular injection. Scientific Reports. 8 (1), 1-14 (2018).
  18. Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. Microphysiological 3D model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) from human iPS-derived muscle cells and optogenetic motor neurons. Science Advances. 4 (10), 5847 (2018).
  19. Rao, L., Qian, Y., Khodabukus, A., Ribar, T., Bursac, N. Engineering human pluripotent stem cells into a functional skeletal muscle tissue. Nature Communications. 9 (1), (2018).
  20. Maffioletti, S. M., et al. Three-dimensional human iPSC-derived artificial skeletal muscles model muscular dystrophies and enable multilineage tissue engineering. Cell Reports. 23 (3), 899-908 (2018).
  21. Chal, J., et al. Generation of human muscle fibers and satellite-like cells from human pluripotent stem cells in vitro. Nature Protocols. 11 (10), 1833-1850 (2016).
  22. Khodabukus, A., et al. Electrical stimulation increases hypertrophy and metabolic flux in tissue-engineered human skeletal muscle. Biomaterials. 198, 259-269 (2019).
  23. Nagashima, T., et al. In vitro model of human skeletal muscle tissues with contractility fabricated by immortalized human myogenic cells. Advanced Biosystems. , 2000121 (2020).
  24. Mills, R. J., et al. Development of a human skeletal micro muscle platform with pacing capabilities. Biomaterials. 198, 217-227 (2019).
  25. Legant, W. R., et al. Microfabricated tissue gauges to measure and manipulate forces from 3D microtissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (25), 10097-10102 (2009).
  26. Prüller, J., Mannhardt, I., Eschenhagen, T., Zammit, P. S., Figeac, N. Satellite cells delivered in their niche efficiently generate functional myotubes in three-dimensional cell culture. PLOS One. 13 (9), 0202574 (2018).
  27. Sakar, M. S., et al. Formation and optogenetic control of engineered 3D skeletal muscle bioactuators. Lab on a Chip. 12 (23), 4976-4985 (2012).
  28. Zhang, X., et al. A system to monitor statin-induced myopathy in individual engineered skeletal muscle myobundles. Lab on a Chip. 18 (18), 2787-2796 (2018).
  29. Rajabian, N., et al. Bioengineered skeletal muscle as a model of muscle aging and regeneration. Tissue Engineering Part A. 27 (1-2), 74-86 (2020).
  30. Afshar, M. E., et al. A 96-well culture platform enables longitudinal analyses of engineered human skeletal muscle microtissue strength. Scientific Reports. 10 (1), 6918 (2020).
  31. Mamchaoui, K., et al. Immortalized pathological human myoblasts: Towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders. Skeletal Muscle. 1 (1), 34 (2011).
  32. Halldorsson, S., Lucumi, E., Gómez-Sjöberg, R., Fleming, R. M. T. Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices. Biosensors and Bioelectronics. 63, 218-231 (2015).
  33. Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  34. Bakooshli, M. A., et al. A 3D model of human skeletal muscle innervated with stem cell-derived motor neurons enables epsilon-subunit targeted myasthenic syndrome studies. BioRxiv. , 275545 (2018).
  35. Vandenburgh, H. H., Karlisch, P., Farr, L. Maintenance of highly contractile tissue-cultured avian skeletal myotubes in collagen gel. Vitro Cellular & Developmental Biology. 24 (3), 166-174 (1988).
  36. Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (3), 1274-1278 (1979).
  37. Hinds, S., Bian, W., Dennis, R. G., Bursac, N. The role of extracellular matrix composition in structure and function of bioengineered skeletal muscle. Biomaterials. 32 (14), 3575-3583 (2011).

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