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Résumé

Ce manuscrit décrit un protocole détaillé pour produire des réseaux de microtissus musculaires squelettiques humains en 3D et des tests de fonction in situ en aval mini-invasifs, y compris des analyses de force contractile et de manipulation du calcium.

Résumé

Les modèles in vitro tridimensionnels (3D) du muscle squelettique constituent une avancée précieuse dans la recherche biomédicale, car ils offrent la possibilité d’étudier la réforme et le fonctionnement des muscles squelettiques dans un format évolutif qui se prête à des manipulations expérimentales. Les systèmes de culture musculaire 3D sont souhaitables car ils permettent aux scientifiques d’étudier le muscle squelettique ex vivo dans le contexte des cellules humaines. Les modèles 3D in vitro imitent étroitement certains aspects de la structure tissulaire native du muscle squelettique adulte. Cependant, leur application universelle est limitée par la disponibilité de plates-formes simples à fabriquer, coûteuses et conviviales, et produisant des quantités relativement élevées de tissus musculaires squelettiques humains. De plus, étant donné que le muscle squelettique joue un rôle fonctionnel important qui est altéré au fil du temps dans de nombreux états pathologiques, une plate-forme expérimentale pour les études de microtissu est plus pratique lorsque des mesures de force transitoire et contractile de calcium mini-invasives peuvent être effectuées directement dans la plate-forme elle-même. Dans ce protocole, la fabrication d’une plate-forme de 96 puits connue sous le nom de « MyoTACTIC » et la production en masse de microtissus musculaires squelettiques humains 3D (hMMT) sont décrites. En outre, les méthodes pour une application mini-invasive de la stimulation électrique qui permet des mesures répétées de la force musculaire squelettique et de la manipulation du calcium de chaque microtissu au fil du temps sont rapportées.

Introduction

Le muscle squelettique est l’un des tissus les plus abondants dans le corps humain et soutient les fonctions clés du corps telles que la locomotion, l’homéostasie thermique et le métabolisme1. Historiquement, des modèles animaux et des systèmes de culture cellulaire bidimensionnelle (2D) ont été utilisés pour étudier les processus biologiques et la pathogenèse des maladies, ainsi que pour tester des composés pharmacologiques dans le traitement des maladies musculaires squelettiques2,3. Alors que les modèles animaux ont grandement amélioré nos connaissances sur les muscles squelettiques en santé et en maladie, leur impact translationnel a été entravé par des coûts élevés, des considérations éthiques et des différences inter-espèces2,4. En se tournant vers les systèmes à base de cellules humaines pour étudier le muscle squelettique, les systèmes de culture cellulaire 2D sont favorables en raison de leur simplicité. Cependant, il y a une limite. Ce format échoue souvent à récapituler les interactions cellule-cellule et cellule-matrice extracellulaire qui se produisent naturellement dans le corps5,6. Au cours des dernières années, les modèles de muscles squelettiques tridimensionnels (3D) sont apparus comme une alternative puissante aux modèles animaux entiers et aux systèmes de culture 2D conventionnels en permettant la modélisation de processus physiologiquement et pathologiquement pertinents ex vivo7,8. En effet, une pléthore d’études ont rapporté des stratégies pour modéliser le muscle squelettique humain dans un format de culture 3D bioartificiel1. Une limite pour beaucoup de ces études est que la force active est quantifiée après le retrait des tissus musculaires des plates-formes de culture et la fixation à un transducteur de force, ce qui est destructeur et donc limité à servir de test final9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 ,19,20,21. D’autres ont conçu des systèmes de culture qui permettent des méthodes non invasives de mesure de la force active, mais tous ne se prêtent pas à des applications de test de molécules à haute teneur7,8,9,10,14 , 18,22,23, 24,25,26,27,28 ,29.

Ce protocole décrit une méthode détaillée pour fabriquer des microtissus musculaires humains (hMMT) dans la plate-forme de muscle squelettique (Myo) microTissue Array deviCe To Investigate forCe (MyoTACTIC); un dispositif à plaque de 96 puits qui prend en charge la production en vrac de microtissus musculaires squelettiques3D 30. La méthode de fabrication de plaques MyoTACTIC permet la génération d’une plaque de culture de polydiméthylsiloxane (PDMS) de 96 puits et de toutes les caractéristiques de puits correspondantes en une seule étape de coulée, chaque puits nécessitant un nombre relativement faible de cellules pour la formation de microtissu. Les microtissus formés dans MyoTACTIC contiennent des myotubes alignés, striés et multinucléés qui sont reproductibles de puits en puits de l’appareil et, à maturation, peuvent répondre à des stimuli chimiques et électriques in situ30. Ici, la technique de fabrication d’un dispositif de plaque de culture PDMS MyoTACTIC à partir d’une réplique en polyuréthane (PU), une méthode optimisée pour mettre en œuvre des cellules progénitrices myogéniques humaines immortalisées pour fabriquer des hMMT, et l’évaluation fonctionnelle de la génération de force hMMT et des propriétés de manipulation du calcium sont décrites et discutées.

Protocole

1. Fabrication de plaques MYOCTACTIQUES PDMS

REMARQUE: La fabrication de plaques myotactices PDMS nécessite un moule négatif PU, qui peut être fabriqué comme décrit précédemment30. Le fichier SolidWorks de conception assistée par ordinateur (CAO) pour la conception de plaques MyoTACTIC a été mis à disposition sur GitHub (https://github.com/gilbertlabcode/MyoTACTIC-SolidWork-CAD-file).

  1. Préparer ~ 110 g de solution de polymère PDMS dans un gobelet en plastique jetable à un rapport de 1:15 de monomère à agent de durcissement en utilisant les composants du kit d’élastomère de silicone. Remuer la solution de polymère pendant 2-3 min à l’aide d’une pipette sérologique jetable de 5 mL jusqu’à ce qu’elle soit complètement mélangée et homogène.
    ATTENTION: Évitez le contact de la solution de polymère PDMS avec la peau et les yeux; et éviter l’inhalation. Portez toujours une blouse de laboratoire et des gants jetables lorsque vous manipulez le mélange pdMS liquide et reportez-vous à la fiche de données de sécurité (FDS) pour connaître les protocoles de sécurité spécifiques.
    REMARQUE : Protégez les surfaces de l’équipement (p. ex., balance, paillasse, etc.) avec un revêtement jetable en cas de déversement de solution de polymère PDMS.
  2. Dégazez le mélange à température ambiante en plaçant la tasse dans une chambre à vide de paillasse reliée à une pompe à vide sèche de service standard pendant environ 30 minutes, ou jusqu’à ce que toutes les bulles soient éliminées. Cassez le vide toutes les 5-10 minutes pour faciliter le dégazage. Utilisez un barillet de seringue vide de 50 mL pour plonger l’air et souffler les bulles restantes à la surface du mélange de polymères au besoin.
    REMARQUE : Un tube ID de 6,35 mm peut être utilisé pour connecter une pointe de pipette P1250 au canon afin d’améliorer la vitesse et la précision du flux d’air.
  3. Pendant que la solution de polymère PDMS est en cours de dégazage, retirez tous les morceaux restants de PDMS collés au moule négatif PU en essuyant doucement les bords et la surface avec une serviette en papier sec. Utilisez de l’air comprimé de l’installation, réglé sur 70-100 kPag pour éliminer les particules fines restantes.
    REMARQUE: Protégez le moule négatif pu contre les dommages et l’accumulation de particules en le plaçant dans un sac en plastique scellable et en le rangeant dans un tiroir protégé de la circulation en laboratoire.
  4. Placez le moule en PU dans une hotte chimique qui a été protégée par un revêtement jetable. Placez le moule horizontalement à ~75° et vaporisez la surface active avec une couche uniforme d’agent de démoulage. Vaporisez le moule de haut en bas, puis de gauche à droite, tout en tenant la boîte à 15-20 cm du moule et en utilisant un mouvement de balayage fluide d’avant en arrière. Faites pivoter le moule de 180 ° et répétez les pulvérisations, puis laissez le moule PU reposer dans la hotte chimique pendant 10 à 15 minutes pour sécher.
    ATTENTION : Assurez-vous que l’agent de démoulage est utilisé dans une hotte chimique, évitez tout contact avec la peau et les yeux et reportez-vous à la fiche de données de sécurité (FDS) pour connaître les protocoles de sécurité spécifiques.
    REMARQUE: Un film mince doit recouvrir complètement la surface active, mais un revêtement excessif peut être transféré au PDMS à l’étape suivante, ce qui peut à son tour avoir un impact négatif sur l’ensemencement hMMT. La surface doit être lisse au toucher, mais pas humide.
  5. Versez 100 g de PDMS uniformément dans le moule PU et placez-le dans une chambre à vide reliée à une pompe à vide à palettes rotatives. Dégazez le moule rempli de PDMS pendant environ 45 minutes, en brisant le joint sous vide toutes les 5 à 10 minutes pendant les 20 premières minutes pour accélérer le processus. Laisser dans la chambre à vide jusqu’à ce que le mélange PDMS soit complètement vide de toutes les bulles.
    REMARQUE: Une pompe à vide à palettes rotatives est utilisée pour obtenir un vide plus faible et réduire le temps nécessaire à cette étape. Le dégazage du moule rempli de PDMS peut être effectué à l’aide de la chambre à vide de paillasse et de la pompe à vide sèche de service standard, mais le temps nécessaire pour vider le mélange de toutes les bulles sera plus long. Ce qui est essentiel, c’est l’élimination de toutes les bulles de la solution de polymère PDMS, en particulier dans les régions destinées à devenir des poteaux d’ancrage hMMT. Les bulles dans cette région entraîneront une rupture après l’ancrage, la perte de puits de culture et, à son tour, un petit morceau de PDMS restera coincé dans le moule.
  6. Transférer le moule en PU dégazé rempli de PDMS dans un four à 65 °C, en couplant pendant la nuit pour durcir le caoutchouc liquide.
  7. Retirez la plaque positive PDMS durcie du four et refroidissez la plaque à température ambiante pendant au moins 30 min.
  8. Avec un scalpel sans lame, détachez doucement le PDMS durci du moule PU en passant l’arrière de la poignée entre le PDMS et les parois du moule. Commencez par le bord supérieur et séparez les 4 côtés, avant de pousser jusqu’à la base du moule et de détacher cette partie. Cette étape est terminée lorsque l’arrière de la poignée fonctionne en douceur entre le PDMS et les 4 parois du moule PU.
    REMARQUE: Travaillez lentement et soigneusement avec le scalpel sans lame pour éviter de fissurer le moule PU ou de déchirer le PDMS. Cette étape devrait prendre 15-20 min.
  9. À partir d’une extrémité, utilisez le scalpel sans lame pour soulever le bord du PDMS et travailler les doigts entre la plaque de culture PDMS durcie et le moule PU. Ensuite, à l’aide des deux mains, poussez les doigts plus loin sous la plaque, en vous décollant lentement et en sortant du moule en PU.
    REMARQUE: Travaillez lentement et utilisez les deux mains pour peler uniformément l’assiette. Minimisez la flexion pour réduire la probabilité de rupture après l’ancrage. Cette étape devrait prendre 5-10 min.
  10. Utilisez une lame de rasoir à un seul tranchant pour couper la plaque en groupes de 6 ± 2 puits myoTACTIQUES(Figure 1)à des fins d’ensemencement des tissus. Placez des plaques MyoTACTIC complètes, ou des portions de plaque, dans un sac de stérilisation d’instrument et un autoclave pour un cycle sec de 25 min (20 min de temps de stérilisation et 5 min de temps de séchage) à 120 °C et 100-140 kPag.

2. Culture de cellules progénitrices de myoblastes humains immortalisées

NOTE: Les myoblastes immortalisés utilisés dans ce protocole ont été obtenus auprès de l’Institut de Myologie (Paris, France)31.

  1. Obtenez un flacon de cellules congelées à partir de l’azote liquide dewar et décongelez rapidement le flacon dans un bain-marie à 37 °C (en moins de 1 min). Les cellules sont congelées à une densité de 7,5 x 105 cellules pour 1 mL de milieu de congélation composé de 90 % de sérum fœtal bovin (FBS) et de 10 % de diméthylsulfoxyde (DMSO).
  2. Transférer doucement le contenu du flacon dans un tube conique de 15 mL contenant 9 mL de milieu de lavage préchauffé composé de 89 % de DMEM 1x, 10 % de FBS et 1 % de stylo/streptocoque pour diluer le DMSO. Faire tourner le tube conique de 15 mL à 400 x g pendant 10 min, puis aspirer le milieu en prenant soin d’éviter la pastille cellulaire.
  3. Resuspendez la pastille dans 1 mL de milieu de croissance composé de 84 % de milieu basal de cellules musculaires squelettiques avec un mélange de supplément de milieu de croissance de cellules musculaires squelettiques, 15 % de FBS et 1 % de stylo/streptocoque, puis transférez-la dans un tube conique de 50 mL avec 29 mL de milieu de croissance.
  4. Transférer 10 mL de milieu contenant environ 2,5 x 105 cellules dans une boîte de culture cellulaire de 100 mm x 20 mm. Répétez cette étape avec les 20 mL restants de la solution cellulaire. Transférez ensuite les boîtes de culture cellulaire dans un incubateur de culture cellulaire humidifié réglé à 37 °C et 5 % de CO2.
  5. Rafraîchissez les médias culturels tous les deux jours. Cultivez les cellules jusqu’à ce qu’elles atteignent ~ 70% à 80% de confluence (généralement 4-5 jours), moment auquel les cellules sont préparées pour l’ensemencement. 1,5 x 105 cellules sont nécessaires pour générer chaque hMMT. Par conséquent, passez les cellules au besoin pour atteindre le nombre requis de cellules.
    REMARQUE: Les lignées cellulaires progénitrices de myoblastes immortalisées ne doivent jamais dépasser 80% de confluence avant d’ensemencer les cellules dans des puits myotactiques, de passer les cellules ou de préparer des stocks de congélation. Les hMMT fabriqués à partir de cellules qui ont dépassé 80 % de confluence n’atteignent souvent pas la maturité contractile. Les procédures de passage sont identiques aux méthodes décrites ci-dessous à l’étape 3.

3. Ensemencement de hMMTs d’ingénierie avec MyoTACTIC

  1. Préparation de puits de culture myotactique et de réactifs pour l’ensemencement hMMT.
    REMARQUE: Ce protocole fournit des détails spécifiques pour produire 6 hMMT.
    1. 2-3 h avant l’ensemencement cellulaire, placer une portion de plaque myotactique de 6 puits dans un plat de culture cellulaire de 10 cm. Préparez bien chaque culture MyoTACTIC individuelle en ajoutant 100 μL d’une solution pluronique F-127 à 5% dans chaque puits. Placez le couvercle sur le plat de culture de 10 cm, appliquez de la paraffine pour sceller l’espace entre le plat de 10 cm et le couvercle, puis placez la plaque de 10 cm contenant la partie MyoTACTIC dans une centrifugeuse équipée d’un adaptateur de spinner à plaque.
      REMARQUE: Si un adaptateur de spinner de plaque de centrifugeuse n’est pas disponible, une pointe de pipette p20 peut être utilisée pour éliminer soigneusement les bulles derrière les poteaux, garantissant ainsi que toute la surface de culture est uniformément revêtue.
    2. Centrifuger à 1 550 x g pendant 1 min pour éliminer toutes les bulles dans les puits de culture, en particulier derrière les poteaux. Conserver la boîte de culture cellulaire de 10 cm contenant la portion de plaque MyoTACTIC contenant la solution de Pluronic F-127 à 4 °C jusqu’à ce que les cellules soient préparées pour l’ensemencement.
      REMARQUE: Le revêtement Pluronic F-127 peut être appliqué pendant aussi peu que 2 h à aussi longtemps que 24 h. Par exemple, les puits peuvent être remplis avec de la solution pluronique F-127 à la fin de la journée pour une utilisation le lendemain. Ne dépassez pas 24 h car cela aura un impact négatif sur le remodelage de la hMMT et ne parviendra pas à former des tissus sains qui atteignent la maturité contractile.
    3. Décongeler lentement une aliquote d’extrait de membrane basale de 50 μL et une aliquote de thrombine de 10 μL (solution mère de 100 U/mL) sur de la glace à l’intérieur de la hotte de culture.
      REMARQUE: Ne pas recongeler les aliquotes d’extrait de membrane basale. Ils sont à usage unique. Les aliquotes de thrombine sont réutilisables, par conséquent, recongelées jusqu’à 5 fois après utilisation.
    4. Peser environ 7 mg de fibrinogène en poudre dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL, puis transférer dans la hotte de culture cellulaire. Ajouter 700 μL de solution de NaCl à 0,9 % (p/vol) dans de l’eau (ou une solution saline) pour obtenir une solution de concentration finale de 10 mg/mL. Ne pas vortexer le fibrinogène pour se dissoudre, placez plutôt le tube dans un incubateur de culture cellulaire à 37 °C pendant 3 à 5 min.
    5. Retirez et faites glisser doucement le tube, puis faites tourner la solution dissoute dans une mini centrifugeuse de paillasse (microfuge) et retournez à la hotte de culture. Filtrer la solution de fibrinogène à l’aide d’une seringue de 1 mL équipée d’un filtre à seringue de 0,22 μm. Transférer la solution de fibrinogène dissoute dans la glace à côté de l’extrait de membrane basale et des aliquotes de thrombine.
    6. Enfin, préparez le milieu d’ensemencement hMMT qui sera introduit dans les puits de culture après l’ensemencement des tissus. Ce milieu contient du milieu basal des cellules musculaires squelettiques complété par 20 % de FBS, 1 % de P/S et 3 % d’acide 6-aminocaproïque (ACA ; la concentration finale de 1,5 mg/mL est obtenue par dilution à partir d’une solution mère de 50 mg/mL ; la % est exprimée en v/v). Préchauffer le média à 37 °C avant utilisation.
  2. Préparation des cellules pour l’ensemencement hMMT.
    1. Recueillir les plaques de culture cellulaire de l’incubateur de culture. Aspirer le milieu de chaque plaque, puis laver les cellules une fois avec du D-PBS en ajoutant 5 mL de D-PBS dans chaque plaque de culture. Ensuite, aspirez le D-PBS et détachez les cellules en ajoutant 1 mL de 0,25% de trypsine-EDTA dans chaque boîte de culture. Placer dans l’incubateur de culture cellulaire pendant 3 min.
    2. Arrêtez la trypsine en ajoutant 3 mL de milieu de lavage (89% de 1x DMEM + 10% FBS + 1% Pen/Strep) au plat de culture. Transférer la solution cellulaire dans un tube conique de taille appropriée, puis granuler les cellules en centrifugant à 400 x g pendant 10 min. Aspirer le milieu en prenant soin d’éviter la pastille cellulaire. Ensuite, remettez en suspension la pastille de cellule dans 1 mL du milieu de lavage.
    3. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et d’un colorant bleu trypan sous microscopie à fond clair.
      Si vous utilisez plusieurs plaques de cellules, cette suspension cellulaire sera très concentrée. Diluez les suspensions cellulaires avant de compter au besoin.
    4. Étant donné que chaque tissu nécessite 150 000 cellules remises en suspension dans 15 μL du mélange de matrice extracellulaire (ECM), 900 000 cellules dans 90 μL de mélange ECM sont nécessaires pour 6 tissus. Pour tenir compte de la perte de solution cellule-ECM qui se produit pendant le processus de préparation en raison de la formation de bulles ou de la perte de pipette, préparez un mélange cellulaire-ECM supplémentaire (c.-à-d. 8 tissus ou 1 200 000 cellules dans 120 μL d’ECM). Transférer le volume de suspension cellulaire contenant 1 200 000 cellules dans un nouveau tube conique. Augmenter le volume à 10 mL avec le milieu de lavage et tourner à 400 x g pendant 10 min.
    5. Pendant que les cellules tournent, préparez un mélange ECM de 150 μL dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL en utilisant la recette suivante. Ajouter d’abord 60 μL de DMEM (40% de volume), puis ajouter 60 μL de solution de fibrinogène 10 mg/mL (40% de volume) et enfin ajouter 30 μL d’extrait de membrane basale (20% de volume). Conserver le mélange ECM sur de la glace jusqu’à utilisation.
      REMARQUE: Utilisez toujours des embouts pré-réfrigérés à -20 ° C lorsque vous travaillez avec des solutions contenant de l’extrait de membrane basale. Le mélange ECM contient 4 mg/mL de fibrinogène.
  3. Ensemencement des hMMT
    1. Prélever le tube conique contenant les cellules filées et aspirer le milieu en prenant soin d’éviter la pastille cellulaire. Agitez vigoureusement l’extrémité du tube avec un doigt ganté pour déloger la pastille et continuez à la faire glisser jusqu’à ce que la pastille apparaisse comme une boue cellulaire.
      REMARQUE: Il est important d’aspirer autant de produits de lavage que possible pour s’assurer que la suspension cell-ECM est à la dilution souhaitée. Utilisez une pipette pour retirer le support de lavage restant si nécessaire.
    2. Transférer 120 μL de la solution ECM dans le tube contenant la pastille cellulaire. Pipette de haut en bas pour remettre en suspension les cellules dans l’ECM afin de générer une suspension à cellule unique. Pipettez lentement et soigneusement pour éviter d’introduire des bulles, ce qui réduirait le volume de travail. Ensuite, placez la solution cell-ECM sur de la glace jusqu’à utilisation.
    3. Récupérez les portions de plaque MyoTACTIC contenant des puits MyoTACTIC enduits de Pluronic F-127 dans le réfrigérateur à 4 °C et placez le plat de 10 cm contenant les puits MyoTACTIC sur un sac de glace à l’intérieur de la hotte de culture cellulaire.
    4. Aspirer la solution Pluronic F-127 de chaque puits. Le PDMS est poreux et absorbera la solution Pluronic F-127, surtout si les plaques ont été filées avec une centrifugeuse. Laissez la solution résiduelle de Pluronic F-127 se libérer et se déposer au fond du puits en laissant les puits reposer pendant 5 min, puis aspirer à nouveau.
      REMARQUE: Utilisez une pipette Pasteur avec une pointe p1250 attachée à l’extrémité et une pointe p200 sur la pointe p1250 lorsque vous aspirez la solution Pluronic F-127. Cela améliorera la précision pour éviter l’aspiration accidentelle des structures de poteau. Évitez de gratter la zone d’ensemencement cellulaire ovale en forme de piscine au fond du puits avec la pipette, car cela perturbe le revêtement Pluronic F-127 et interfère avec le processus d’auto-organisation hMMT. La bonne technique consiste à survoler la pointe de la pipette juste au-dessus de la piscine ovale tout en aspirant la solution Pluronic F-127.
    5. Pipettez soigneusement la suspension cell-ECM pour remettre en suspension les cellules qui pourraient avoir coulé au fond du tube. Transférer ensuite 105 μL de suspension d’ECM cellulaire dans un tube frais de 1,5 mL pré-réfrigéré. Prenez soin de saisir le tube près du haut pour éviter que la solution ne se réchauffe.
    6. Ajouter 0,84 μL de la solution mère de thrombine de 100 U/mL à la suspension d’ECM cellulaire de 105 μL pour obtenir une concentration finale de 0,2 U/mg de fibrinogène. Pipettez rapidement, soigneusement et soigneusement pour mélanger, tout en évitant l’introduction de bulles.
      REMARQUE: La thrombine initie la conversion rapide du fibrinogène en un caillot de fibrine. En tant que tel, il y a peu de temps pour ensemencer les tissus lors de l’ajout de thrombine. Pour éviter une coagulation prématurée avant que le mélange cellule-ECM ne soit transféré dans les puits de culture, réglez une pipette p20 à 15 μL avant d’ajouter la thrombine. Utilisez des embouts pré-réfrigérés ou trempez l’embout de la pipette dans du DMEM glacé pendant quelques secondes avant de recueillir et de transférer 15 μL du mélange cellule-ECM dans chaque puits. Il est recommandé de préparer des aliquotes de mélange cellule-ECM de manière à ce que pas plus de 6 hMMT soient ensemencés à la fois.
    7. Pour ensemencer les tissus, ajoutez 15 μL de mélange cellule-ECM (c.-à-d. 150 000 cellules) à chaque puits individuel. Ajoutez soigneusement le mélange cellule-ECM au centre de la piscine ovale et évitez d’enfoncer la pointe de la pipette dans le fond du puits. Ensuite, avec deux mouvements légers, étalez la suspension cellulaire derrière chaque poteau dans le puits. Une fois que la surface est uniformément recouverte de la suspension cell-ECM, passez au puits suivant.
      REMARQUE: Travailler efficacement pour éviter la gélification prématurée du mélange cellule-ECM dans le tube avant que tous les tissus ne soient ensemencés. Lors de l’ensemencement des puits, il est extrêmement important d’éviter de transférer des bulles car la bulle interférera avec le remodelage du hMMT, rendant le hMMT inutilisable.
    8. Placez le couvercle sur la plaque de culture de 10 cm contenant les puits ensemencés et transférez-le dans un incubateur de culture tissulaire à 37 °C pendant environ 5 min.
      REMARQUE: Placez le tube de microcentrifugation avec le mélange cellulaire-ECM résiduel dans l’incubateur comme confirmation du processus de polymérisation en gel.
    9. Une fois le mélange cellule-ECM polymérisé, ajouter 200 μL de milieu d’ensemencement hMMT préavertissé à chaque puits MyoTACTIC. Remplacez le couvercle du plat de 10 cm et retournez les portions de la plaque MyoTACTIC dans le plat de 10 cm à l’incubateur. Ce point de temps est appelé Jour -2. Ne dérangez pas les tissus jusqu’à l’étape suivante.
  4. Différencier les hMMT
    1. Après 2 jours d’incubation, prélever soigneusement le milieu d’ensemencement hMMT à l’aide d’une pipette et le remplacer par 200 μL de milieux de différenciation préavertis contenant 2 % de sérum de cheval, 1 % de stylo/streptocoque, 4 % d’ACA (c.-à-d. 2 mg/mL de concentration finale à partir d’une concentration sur le stock de 50 mg/mL; % est exprimé en v/v) et 10 μg/mL d’insuline recombinante humaine dans le DMEM. Ce point temporel est appelé Jour 0 de la différenciation.
    2. Tous les deux jours par la suite, échangez la moitié des médias avec de nouveaux médias de différenciation jusqu’au jour 12 de différenciation, le dernier jour de la culture (Figure 2a).
      REMARQUE: Les détails du protocole pour fabriquer des hMMT à l’aide de myoblastes humains primaires ont été publiésailleurs 30. S’il y a des préoccupations quant à la viabilité cellulaire après l’ensemencement, incuber les hMMT avec de la calcéine et de l’iodure de propidium pour quantifier la viabilité.

4. Stimulation électrique et analyse de la post-déviation induite par hMMT

  1. Installez un support de scène en verre ou en plastique transparent sur un microscope inversé et fixez une caméra de smartphone à l’oculaire du microscope à l’aide d’un support de caméra de microscope. La microscopie à contraste de phase à grossissement de 10x sera utilisée (Figure 3a).
    REMARQUE: Tout microscope à contraste de phase inversé équipé d’un objectif de grossissement 10x sera approprié. Les constructions de puits PDMS seront retirées du plat de 10 cm et placées directement sur le support de l’étage inférieur transparent, et donc ouvertes à l’air. Stériliser toutes les surfaces et l’équipement avec de l’éthanol à 70% et minimiser la circulation dans la zone pendant l’expérimentation.
  2. Pour préparer les électrodes de stimulation électrique, coupez environ 30 cm de fil de cuivre enduit d’étain. Ensuite, en commençant par le moyeu d’une aiguille biseautée régulière de 25 G, enroulez étroitement ~ 10 cm du fil autour de la moitié supérieure, laissant ~ 20 cm de fil en excès. Répétez l’opération pour une deuxième aiguille, puis coupez le moyeu de chaque aiguille.
    REMARQUE: Le fil doit être serré autour de l’aiguille pour s’assurer qu’il ne bouge pas et la partie enroulée du fil de l’électrode ne doit pas toucher le PDMS car cela peut entraver la génération de champ électrique.
  3. Connectez le câble du connecteur BNC à clip alligator à un canal de sortie du générateur de forme d’onde et réglez le canal pour des impulsions carrées avec un rapport cyclique de 20%, amplitude de 5 V (intensité du champ électrique de 10 V / cm). La fréquence changera entre 0,5 Hz et 20 Hz pour les contractions des contractions du tétanos, respectivement.
    REMARQUE: Les paramètres du générateur de forme d’onde peuvent nécessiter une optimisation spécifique à l’expérience
  4. Placez une partie de plaque myotactique contenant des hMMT sur l’étage du microscope et insérez doucement chaque extrémité de biseau d’électrode dans le PDMS directement derrière chaque poteau dans le bassin ovale. Collez soigneusement les sections de 20 cm de fil excédentaire à l’étage du microscope afin que les aiguilles restent verticales et que ~ 10 cm de chaque fil restent libres pour la connexion (Figure 3a).
    ATTENTION : Ne placez jamais un doigt nu sur l’une ou l’autre extrémité de l’électrode. Assurez-vous qu’un dé à coudre est porté sur l’index pour appliquer une légère pression sur l’électrode lors de l’insertion dans le PDMS.
  5. Focalisez le champ de vision du microscope sur l’un des deux poteaux, de sorte que la mise au point soit nette sur le bord du poteau le plus proche de l’électrode. Ensuite, verrouillez la mise au point de l’appareil photo du smartphone sur la zone la plus claire de la publication. Ceci est important pour l’analyse en aval car un changement d’orientation tandis que l’enregistrement interférera avec l’analyse.
  6. Connectez les extrémités libres des fils collés au générateur de forme d’onde à l’aide de pinces alligator (Figure 3a).
  7. Démarrez l’enregistrement vidéo sur l’appareil photo du smartphone, puis activez la sortie du canal pour lancer la stimulation. Induire le hMMT à subir 3 contractions de contractions et 3 contractions du tétanos, avec 2 min de repos entre la série de stimulation de la contraction et du tétanos.
  8. Éteignez la sortie du canal, détachez les clips d’alligator des fils de cuivre enduits d’étain, retirez le ruban adhésif des fils et essuyez chaque électrode avec de l’éthanol à 70% avant de l’insérer dans les puits hMMT suivants. Répétez la procédure de l’étape 4.5 pour tous les hMMT.
    REMARQUE: Limitez le temps que les hMMT passent en dehors de l’incubateur en ne stimulant pas plus de 3 tissus à la fois. S’il reste des hMMT supplémentaires dans la partie de la plaque myotactique à analyser, renvoyer la plaque à l’incubateur pendant 10 minutes pour permettre aux hMMT de revenir à 37 °C.
  9. Pour analyser la post-déviation afin de calculer la génération de force hMMT, utilisez le script personnalisé, qui a été mis à disposition sur GitHub (https://github.com/gilbertlabcode/myoTACTIC). Suivez les instructions de README.md pour configurer et lancer le script, puis ouvrez chaque vidéo de suivi de publication pour effectuer l’analyse de la force.
  10. Sélectionnez une région d’intérêt (ROI) le long du bord de la publication à suivre pour le déplacement de la publication. Appuyez sur Entrée pour confirmer le retour sur investissement et appuyez à nouveau sur Entrée pour exécuter le script (Vidéo supplémentaire 1).
    REMARQUE: De grandes déviations entraînent l’échec du tracker. Si le tracker échoue pendant la contraction, la taille du retour sur investissement peut être augmentée pour rendre le suivi moins sensible, mais permettre le suivi des grandes déviations. Trois tailles sont fournies dans le code et peuvent être réglées en ajustant les commentaires du script.
  11. Le script se termine par deux exigences d’entrée. Tout d’abord, entrez y pour confirmer que la vidéo contenait plusieurs contractions. Deuxièmement, entrez y (oui) ou n (non) pour exporter les résultats vers un fichier . Fichier CSV (Vidéo supplémentaire 1).
  12. Assurez-vous que les résultats post-déviation sont signalés sous forme de déplacement en pixels pour chaque contraction. Convertissez les pixels en valeurs μm pour le réglage du grossissement 10x du microscope. Ensuite, convertissez les nombres post-déplacement en forces contractiles absolues (μN) en multipliant les valeurs (μm) par le facteur de conversion force-déplacement de 2,36 μN / μm, ce qui correspond au rapport agent de durcissement / monomère 1:15 du PDMS utilisé dans la fabrication MyoTACTIC30.

5. Analyse des transitoires calciques par stimulation électrique

REMARQUE: Pour les expériences de manipulation du calcium, les myoblastes immortalisés ont été transduis de manière stable avec le rapporteur MHCK7-GCAMP6 comme décrit précédemment11,12. Les cellules transduites ont été triées par FACS pour la GFP afin d’obtenir la population positive, puis utilisées pour fabriquer des hMMT. D’autres méthodes d’imagerie calcique telles que l’utilisation de colorants ratiométriques comme Fura-2 AM et Indo-1 ou l’imagerie par fluorescence de la durée de vie des indicateurs de calcium (par exemple, Fluo-4 ou Oregon Green BAPTA1) peuvent convenir à notre système.

  1. Configurez l’étage du microscope et l’équipement de stimulation (électrodes, générateur de forme d’onde, etc.) comme décrit précédemment à l’étape 4. Pour cette expérience, utilisez un grossissement 4x.
    REMARQUE: Une pièce sombre et un microscope à épifluorescence équipé d’une caméra CCD seront nécessaires.
  2. Lancez le logiciel d’imagerie de microscope, sélectionnez le canal de filtre FITC (lumière bleue) et sélectionnez la fonction d’enregistrement vidéo. Réglé à une exposition de 500 ms et une résolution de 680 x 510 (Binning 2x2).
    REMARQUE: Le logiciel d’imagerie peut varier et l’exposition est définie manuellement par l’utilisateur. Prenez soin d’éviter la surexposition hMMT avant la stimulation. Au repos, un contour / ombre de tissu sombre avec fluorescence spontanée est normal tandis qu’une image de tissu claire est surexposée (Vidéo supplémentaire 2). Assurez-vous que l’exposition est cohérente pour tous les hMMT d’une expérience.
  3. Fermez l’obturateur du microscope et gardez le canal FITC éteint jusqu’à ce qu’il soit prêt à enregistrer la manipulation du calcium.
  4. Lorsque tout l’équipement et les logiciels sont configurés, récupérez la partie de la plaque MyoTACTIC contenant les hMMT à analyser et placez-la directement sur la scène du microscope. Ensuite, insérez et connectez les électrodes comme décrit précédemment à l’étape 4.
  5. Utilisez le champ lumineux pour focaliser le champ de vision sur le centre de l’hMMT sélectionné. Ensuite, éteignez la lampe.
  6. Ouvrez l’obturateur de canal FITC du microscope, vérifiez que la lumière bleue est allumée, puis sélectionnez Enregistrement vidéo dans le logiciel.
  7. Allumez la sortie sur le générateur de forme d’onde pour lancer la stimulation électrique. Induire la hMMT à subir 8 contractions du tétanos et 8 contractions du tétanos. Prévoyez 2 minutes de repos entre les séries de stimulation des contractions et du tétanos, pendant lesquelles l’obturateur FITC est en position fermée.
    REMARQUE: Prévoir 10 s d’activité spontanée avant et après la stimulation électrique pour enregistrer la fluorescence minimale à des fins de calcul et d’analyse des données.
  8. Éteignez la sortie du canal, détachez les clips d’alligator des fils de cuivre enduits d’étain, retirez le ruban adhésif des fils et essuyez chaque électrode avec 70% d’éthanol avant de l’insérer dans les puits hMMT suivants. Répétez la procédure de stimulation et d’enregistrement pour tous les hMMT.
  9. Enregistrez des films au format de fichier TIFF pour analyse dans ImageJ ou un autre logiciel d’imagerie.
    REMARQUE: Limitez le temps que les hMMT passent en dehors de l’incubateur en ne stimulant pas plus de 3 tissus à la fois. S’il reste à analyser des hMMT supplémentaires dans la partie de la plaque myoTACTIQUE, remettre l’appareil à l’incubateur pendant 10 minutes pour permettre aux hMMT de revenir à 37 °C.
  10. Pour analyser les données transitoires de calcium, ouvrez d’abord ImageJ. Sélectionnez Analyser, puis Définir les mesures, puis sélectionnez la valeur grise moyenne et désélectionnez toutes les autres options. Lorsque vous avez terminé, ouvrez une vidéo sur le calcium (.tiff) (Vidéo supplémentaire 2).
  11. Tracez la bordure de la microtissue à l’aide d’un outil de sélection de polygones et enregistrez cette zone en tant que retour sur investissement(Vidéo supplémentaire 2). Sous Plus dans la fenêtre Gestionnaire de retour sur investissement, sélectionnez Multi Measure et mesurez l’intensité fluorescente pour toutes les tranches de fichier à une ligne par tranche ( Vidéo supplémentaire2).
  12. Copiez toutes les mesures, y compris le numéro de tranche (image), dans une feuille de calcul et comparez l’intensité fluorescente de chaque tranche à l’intensité fluorescente spontanée minimale du fichier en utilisant ΔF/F0 = (Fimmédiat - Fminimum)/Fminimum (Vidéo supplémentaire 2).
  13. Calculez le temps pour chaque image en multipliant la vitesse de l’image d’enregistrement vidéo par le nombre de tranches (image) et tracez ΔF/F0 par rapport au temps pour la réponse transitoire du calcium hMMT à la stimulation (Vidéo supplémentaire 2).
  14. Sélectionnez le signal transitoire de pic de calcium pour chacune des 6 contractions consécutives et les valeurs moyennes pour calculer le changement d’intensité fluorescent de crête moyen relatif de chaque hMMT (Vidéo supplémentaire 2).
    REMARQUE: Toujours exclure les données résultant de la première contraction de contraction de l’analyse globale. Une feuille de calcul intitulée « Calcium Handling Template.xlsx » a été fournie sur GitHub (https://github.com/gilbertlabcode/Calcium-Handling-Template-) pour faciliter l’analyse transitoire du calcium hMMT. Les cellules remplissables dans lesquelles les valeurs et les entrées doivent être saisies sont surlignées en gris. Assurez-vous d’ajuster les nombres de sélection de pic car il ne s’agit que d’un guide pour faciliter la sélection des pics (Vidéo supplémentaire 2).

Résultats

Les méthodes décrites ici sont les méthodes permettant de couler une plate-forme de culture myoTACtique à base de PDMS à 96 puits à partir d’un moule PU, de fabriquer des réseaux de tissus répliques hMMT et d’analyser deux aspects de la fonction hMMT dans la génération de force du dispositif de culture et la manipulation du calcium. La figure 1 offre un aperçu schématique de la préparation des puits de culture myotactique avant l’ensemencement de la hMMT. PDMS est un polym...

Discussion

Ce manuscrit décrit des méthodes pour fabriquer et analyser un modèle de culture 3D hMMT qui peut être appliqué à des études de biologie musculaire de base, à la modélisation de maladies ou à des tests de molécules candidates. La plate-forme MyoTACTIC est économique, facile à fabriquer et nécessite un nombre relativement faible de cellules pour produire des microtissus musculaires squelettiques. Les mmTh formés au sein de la plateforme de culture MyoTACTIC sont constitués de myotubes alignés, multinuclé...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Remerciements

Nous tenons à remercier Mohammad Afshar, Haben Abraha, Mohsen Afshar-Bakooshli et Sadegh Davoudi d’avoir contribué à l’invention de la plateforme de culture MyoTACTIC et d’avoir établi les méthodes de fabrication et d’analyse décrites ici. HL a reçu un financement d’un programme de formation en génie du Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie (CRSNG) en génie et en entrepreneuriat d’organes sur puce et d’une bourse d’études supérieures Wildcat de l’Université de Toronto. PMG est titulaire de la Chaire de recherche du Canada en réparation endogène et a reçu le soutien de l’Institut ontarien de médecine régénérative, du Réseau de cellules souches et de Medicine by Design, un programme d’excellence en recherche Canada First. Des diagrammes schématiques ont été créés avec BioRender.com.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
0.9% Saline Solution, SterileHouse Brand101010 mL aliquots of the solution are made and stored at 4°C
25G NeedleBD, Medstore, University of Toronto2548-CABD305127
6-Aminocaproic Acid, ≥99% (titration), PowderSigma - AldrichA2504-100GA 50 mg / mL stock solution is generated by dissolving 5 mg of 6-aminocaproic acid powder in 100 mL of autoclaved, distilled water. The solution is vaccum filtered and 10 mL aliquots are stored at 4°C
6.35 mm ID TubingVWR60985-528
AB1167 Myoblast Cell LineInstitut de Myologie (Paris, France)
Arbitrary Waveform GeneratorRigolDG1022Z
Basement Membrane Extract (Geltrex)Thermo Fisher ScientificA14132-02Stored as aliquots of 50 µL or 100 µL at -80°C
Benchtop Vacuum ChamberSigma - AldrichD2672
BNC to Aligator Clip CableOrdered from Amazon
Culture PlasticsSarstedtIncludes culture plates, serological pipettes, etc
Dimethyl SulfoxideSigma - AldrichD8418-250ML
DPBS, Powder, No Calcium, No MagnesiumThermo Fisher Scientific21600069
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1X)Gibco11995-065This is a high glucose DMEM with L-glutamine and sodium pyruvate
Fetal Bovine SerumFisher Scientific10437028
Fibrinogen from Bovine PlasmaSigma - AldrichF8630-5GAliquots ranging from 7 - 10 mg of fibrinogen powder are made and stored at -20°C
Filtropur Syringe Filter, 0.22um Pore SizeSarstedt83.1826.001
Horse SerumGibco16050-122
Human Recombinant InsulinSigma - Aldrich91077CStock solution is 100X and made by dissolving 1 mg of human recombinant insulin in 1 mL of DMEM and 1 µL of NaOH 10N. Solution is filtered and stored as 1 mL aliquots at 4°C
Image Acquisition SoftwareOlympuscellSens Dimension
Image Processing SoftwareNational Institutes of HealthImageJ
Isotemp OvenThermo Fisher Scientific201
MicroscopeOlympusIX83
Microscope - Camera MountLabcamLabcam for iPhoneOrdered from Amazon
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)Gibco15140-122
Plastic Disposable Syringes, 1ccBD2606-309659
Plastic Disposable Syringes, 50ccBD2612-309653
Pluronic F-127, Powder, BioReagentSigma - AldrichP2443-250GA 5% stock solution of pluronic acid is made by dissolving 5 g of pluronic acid powder in 100 mL of chilled, autoclaved, distilled water. The solution is vaccum filtered and 10 mL aliquots are stored at 4°C
Polydimethylsiloxane (Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit)Dow4019862Kits are also available at Thermo Fisher Scientific, Sigma - Aldrich, etc.
Polyurethane Negative MoldIn House
Release AgentMann Release Technologies200
Rotary Vane Vacuum PumpEdwardsA65401906
ScalpelAlmedic, Medstore, University of Toronto2586-M36-0100
Single Edge Razor BladeVWR55411-050
Skeletal Muscle Cell Basal MediumPromocellC-2326030 mL aliquotes are generated and at stored at 4°C.
Skeletal Muscle Cell Growth Medium (Ready-to-use)PromocellC-2306042 mL aliquots are generated and stored at 4°C.
Smartphone (iPhone)AppleSE
Standard Duty Dry Vacuum PumpWelch2546B-01
Sterilization BagAlliance211-SCM2
ThimbleIgegeOrdered from Amazon
Thrombin from human plasmaSigma - AldrichT6884-250UN100 units of thrombin is dissolved in 1 mL of a 0.1% BSA solution. 10 µL aliquots are prepared and stored at - 20°C.
Tin coated copper wireArcoB8871K48Ordered from Amazon
Trypan Blue Solution, 0.4%Thermo Scientific15250061
Trypsin-EDTA, 0.25%Thermo FIsher Scientific25200072
Vacuum Chamber 2SP Bel-ArtF42027-0000

Références

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