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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Questo manoscritto descrive un protocollo dettagliato per produrre matrici di microtessuti del muscolo scheletrico umano 3D e saggi di funzione minimamente invasivi a valle in situ, comprese le analisi della forza contrattile e della manipolazione del calcio.

Abstract

I modelli tridimensionali (3D) in vitro del muscolo scheletrico sono un prezioso progresso nella ricerca biomedica in quanto offrono l'opportunità di studiare la riforma e la funzione del muscolo scheletrico in un formato scalabile che è suscettibile di manipolazioni sperimentali. I sistemi di coltura muscolare 3D sono desiderabili in quanto consentono agli scienziati di studiare il muscolo scheletrico ex vivo nel contesto delle cellule umane. I modelli 3D in vitro imitano da vicino gli aspetti della struttura tissutale nativa del muscolo scheletrico adulto. Tuttavia, la loro applicazione universale è limitata dalla disponibilità di piattaforme semplici da fabbricare, costose e facili da usare e producono quantità relativamente elevate di tessuti muscolari scheletrici umani. Inoltre, poiché il muscolo scheletrico svolge un importante ruolo funzionale che è compromesso nel tempo in molti stati patologici, una piattaforma sperimentale per studi di microtissue è più pratica quando le misurazioni minimamente invasive del calcio transitorio e della forza contrattile possono essere condotte direttamente all'interno della piattaforma stessa. In questo protocollo, viene descritta la fabbricazione di una piattaforma a 96 pozzi nota come "MyoTACTIC" e la produzione in massa di microtissue del muscolo scheletrico umano 3D (hMMT). Inoltre, vengono riportati i metodi per un'applicazione minimamente invasiva della stimolazione elettrica che consente misurazioni ripetute della forza muscolare scheletrica e della manipolazione del calcio di ciascuna microtessuta nel tempo.

Introduzione

Il muscolo scheletrico è uno dei tessuti più abbondanti nel corpo umano e supporta funzioni chiave del corpo come la locomozione, l'omeostasi del calore e il metabolismo1. Storicamente, modelli animali e sistemi di coltura cellulare bidimensionali (2D) sono stati utilizzati per studiare i processi biologici e la patogenesi della malattia, nonché per testare composti farmacologici nel trattamento delle malattie del muscolo scheletrico2,3. Mentre i modelli animali hanno notevolmente migliorato la nostra conoscenza del muscolo scheletrico in salute e nelle malattie, il loro impatto traslazionale è stato ostacolato da costi elevati, considerazioni etiche e differenze interspecie2,4. Rivolgendosi ai sistemi basati su cellule umane per studiare il muscolo scheletrico, i sistemi di coltura cellulare 2D sono favorevoli grazie alla loro semplicità. Tuttavia, c'è una limitazione. Questo formato spesso non riesce a ricapitolare le interazioni cellula-cellula e cellula-matrice extracellulare che si verificano naturalmente all'interno del corpo5,6. Negli ultimi anni, i modelli di muscolo scheletrico tridimensionale (3D) sono emersi come una potente alternativa ai modelli animali interi e ai sistemi di coltura 2D convenzionali consentendo la modellazione di processi fisiologicamente e patologicamente rilevanti ex vivo7,8. In effetti, una pletora di studi ha riportato strategie per modellare il muscolo scheletrico umano in un formato di coltura 3D bioartificiale1. Una limitazione per molti di questi studi è che la forza attiva viene quantificata in seguito alla rimozione dei tessuti muscolari dalle piattaforme di coltura e all'attaccamento a un trasduttore di forza, che è distruttivo e quindi limitato a servire come endpoint assay9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 ,19,20,21. Altri hanno progettato sistemi di coltura che consentono metodi non invasivi di misurazione della forza attiva, ma non tutti sono suscettibili di applicazioni di test molecolari ad alto contenuto7,8,9,10,14,18,22, 23,24,25,26,27,28 ,29.

Questo protocollo descrive un metodo dettagliato per fabbricare microtessuti muscolari umani (hMMT) nella piattaforma microTissue Array deviCe To Investigate forCe (MyoTACTIC) del muscolo scheletrico (MyoTACTIC); un dispositivo a piastra a 96 pozzetti che supporta la produzione in blocco di microtissue del muscolo scheletrico 3D30. Il metodo di fabbricazione della piastra MyoTACTIC consente la generazione di una piastra di coltura da 96 pozzettilsilossano (PDMS) e tutte le caratteristiche corrispondenti del pozzo in una singola fase di fusione, per cui ogni pozzo richiede un numero relativamente piccolo di cellule per la formazione di microtessuti. I microsessu formati all'interno di MyoTACTIC contengono miotubi allineati, striati e multinucleati che sono riproducibili da un pozzo all'altro del dispositivo e, una volta maturati, possono rispondere a stimoli chimici ed elettrici in situ30. Qui, la tecnica per produrre un dispositivo a piastra di coltura PDMS MyoTACTIC da una replica in poliuretano (PU), un metodo ottimizzato per implementare cellule progenitrici miogeniche umane immortalizzate per fabbricare hMMT e la valutazione funzionale della generazione di forza hMMT ingegnerizzata e delle proprietà di manipolazione del calcio sono delineate e discusse.

Protocollo

1. Fabbricazione di lastre PDMS MyoTACTIC

NOTA: la fabbricazione di piastre PDMS MyoTACTIC richiede uno stampo negativo in PU, che può essere prodotto come descritto in precedenza30. Il file SolidWorks CAD (computer-aided design) per il design della piastra MyoTACTIC è stato reso disponibile su GitHub (https://github.com/gilbertlabcode/MyoTACTIC-SolidWork-CAD-file).

  1. Preparare ~ 110 g di soluzione polimerica PDMS in un bicchiere di plastica monouso con un rapporto 1:15 tra monomero e agente polimerizzante utilizzando i componenti del kit di elastomeri siliconici. Mescolare la soluzione polimerica per 2-3 minuti utilizzando una pipetta sierologica monouso da 5 ml fino a quando non è completamente miscelata e omogenea.
    ATTENZIONE: Evitare il contatto della soluzione polimerica PDMS con la pelle e gli occhi; ed evitare l'inalazione. Indossare sempre un camice da laboratorio e guanti monouso quando si maneggia la miscela PDMS liquida e fare riferimento alla scheda di dati di sicurezza (SDS) per protocolli di sicurezza specifici.
    NOTA: Proteggere le superfici delle apparecchiature (ad esempio, bilancia, piano di lavoro, ecc.) con un rivestimento monouso in caso di fuoriuscita di soluzione polimerica PDMS.
  2. Degassare la miscela a temperatura ambiente posizionando la tazza all'interno di una camera a vuoto da banco collegata a una pompa per vuoto a secco standard per ~ 30 minuti o fino a quando tutte le bolle non vengono rimosse. Rompere il vuoto ogni 5-10 minuti per aiutare nel degasaggio. Utilizzare un barilotto vuoto da 50 mL per immergere l'aria ed espellere eventuali bolle rimanenti sulla superficie della miscela polimerica secondo necessità.
    NOTA: un pezzo di tubo ID da 6,35 mm può essere utilizzato per collegare una punta della pipetta P1250 alla canna per migliorare la velocità e la precisione del flusso d'aria.
  3. Mentre la soluzione polimerica PDMS si sta degassando, rimuovere eventuali pezzi rimanenti di PDMS aderenti allo stampo negativo PU pulendo delicatamente i bordi e la superficie con un tovagliolo di carta asciutto. Utilizzare aria compressa dell'impianto, impostata su 70-100 kPag per rimuovere le particelle fini rimanenti.
    NOTA: Proteggere lo stampo negativo in PU da danni e dall'accumulo di particolato mettendolo in un sacchetto di plastica sigillabile e conservandolo all'interno di un cassetto protetto dal traffico di laboratorio.
  4. Posizionare lo stampo in PU in una cappa chimica che è stata protetta con un rivestimento monouso. Posizionare lo stampo orizzontalmente a ~ 75 ° e spruzzare la superficie attiva con uno strato uniforme di distaccante. Spruzzare lo stampo dall'alto verso il basso, quindi da sinistra a destra, tenendo la lattina a 15-20 cm dallo stampo e utilizzando un movimento fluido avanti e indietro. Ruotare lo stampo di 180 ° e ripetere gli spruzzi, quindi lasciare riposare lo stampo in PU nella cappa chimica per 10-15 minuti per asciugare.
    ATTENZIONE: assicurarsi che il distaccante sia utilizzato all'interno di una cappa aspirante chimica, evitare il contatto con la pelle e gli occhi e fare riferimento alla scheda di dati di sicurezza (SDS) per protocolli di sicurezza specifici
    NOTA: un film sottile deve coprire completamente la superficie attiva, ma un rivestimento eccessivo può essere trasferito al PDMS nella fase successiva, che a sua volta può avere un impatto negativo sulla semina hMMT. La superficie dovrebbe essere liscia al tatto ma non bagnata.
  5. Versare 100 g di PDMS in modo uniforme nello stampo pu e posizionarlo all'interno di una camera a vuoto collegata a una pompa per vuoto rotativa a palette. Degasare lo stampo riempito con PDMS per ~ 45 minuti, rompendo il sigillo sottovuoto ogni 5-10 minuti per i primi 20 minuti per accelerare il processo. Lasciare all'interno della camera a vuoto fino a quando la miscela PDMS è completamente priva di tutte le bolle.
    NOTA: una pompa per vuoto rotativa a palette viene utilizzata per ottenere un vuoto inferiore e ridurre il tempo necessario per questa fase. Il degasaggio dello stampo riempito con PDMS può essere eseguito utilizzando la camera a vuoto da banco e la pompa per vuoto a secco standard, tuttavia, il tempo per svuotare la miscela di tutte le bolle sarà più lungo. Ciò che è essenziale è la rimozione di tutte le bolle dalla soluzione polimerica PDMS, specialmente in quelle regioni destinate a diventare pali di ancoraggio hMMT. Le bolle in questa regione comporteranno la rottura dell'ancora dopo la rottura, la perdita di pozzi di coltura e, a sua volta, si tradurrà in un piccolo pezzo di PDMS che rimane incastrato nello stampo.
  6. Trasferire lo stampo in PU riempito di PDMS degassato in un forno a 65 °C, incubando durante la notte per polimerizzare la gomma liquida.
  7. Rimuovere la piastra positiva PDMS indurita dal forno e raffreddare la piastra a temperatura ambiente per almeno 30 minuti.
  8. Con un bisturi senza lama, staccare delicatamente il PDMS polimerizzato dallo stampo in PU facendo scorrere la parte posteriore del manico tra il PDMS e le pareti dello stampo. Iniziare lungo il bordo superiore e separare tutti e 4 i lati, prima di spingere verso il basso fino alla base dello stampo e staccare questa porzione. Questo passaggio è completo quando la parte posteriore della maniglia scorre senza intoppi tra il PDMS e tutte e 4 le pareti dello stampo PU.
    NOTA: Lavorare lentamente e con attenzione con il bisturi senza lama per evitare di rompere lo stampo PU o strappare il PDMS. Questo passaggio dovrebbe richiedere 15-20 minuti.
  9. Partendo da un'estremità, utilizzare il bisturi senza lama per sollevare il bordo del PDMS e lavorare le dita tra la piastra di coltura PDMS polimerizzata e lo stampo PU. Quindi, usando entrambe le mani, spingere ulteriormente le dita sotto la piastra, staccandosi lentamente e uscendo dallo stampo PU.
    NOTA: Lavorare lentamente e usare entrambe le mani per sbucciare uniformemente il piatto. Ridurre al minimo la flessione per ridurre la probabilità di rottura del post di ancoraggio. Questo passaggio dovrebbe richiedere 5-10 minuti.
  10. Utilizzare una lama di rasoio a bordo singolo per tagliare la piastra in gruppi di 6 ± 2 pozzetti MyoTACTIC (Figura 1) per scopi di semina dei tessuti. Posizionare piastre MyoTACTIC complete, o porzioni di piastra, in un sacchetto di sterilizzazione dello strumento e in un'autoclave per un ciclo a secco di 25 minuti (20 minuti di tempo di sterilizzazione e 5 minuti di tempo di asciugatura) a 120 °C e 100-140 kPag.

2. Coltura di cellule progenitrici di mioblasti umani immortalizzati

NOTA: I mioblasti immortalizzati utilizzati in questo protocollo sono stati ottenuti dall'Institut de Myologie (Parigi, Francia)31.

  1. Ottenere un flaconcino di cellule congelate dal dewar di azoto liquido e scongelare rapidamente il flaconcino a 37 °C a bagnomaria (in meno di 1 minuto). Le cellule vengono congelate ad una densità di 7,5 x 105 cellule per 1 mL di mezzi di congelamento costituiti per il 90% da siero bovino fetale (FBS) e per il 10% da dimetilsolfossido (DMSO).
  2. Trasferire delicatamente il contenuto del flaconcino in un tubo conico da 15 mL contenente 9 mL di mezzo di lavaggio preriscaldato composto da 89% DMEM 1x, 10% FBS e 1% Pen/Strep per diluire il DMSO. Ruotare il tubo conico da 15 ml a 400 x g per 10 minuti e quindi aspirare via il fluido facendo attenzione ad evitare il pellet cellulare.
  3. Risospesciare il pellet in 1 mL di terreno di crescita costituito da 84% di cellule muscolari scheletriche basali con Skeletal Muscle Cell Growth Medium Supplement Mix, 15% FBS e 1% Pen / Strep e quindi trasferire in un tubo conico da 50 mL con 29 mL di mezzi di crescita.
  4. Trasferire 10 mL di terreno contenente circa 2,5 x 105 celle in una parabola di coltura cellulare da 100 mm x 20 mm. Ripetere questo passaggio con i restanti 20 ml della soluzione cellulare. Quindi trasferire le piastre di coltura cellulare in un incubatore di colture cellulari umidificato impostato a 37 °C e 5% CO2.
  5. Aggiorna i media culturali a giorni alterni. Coltiva le cellule fino a raggiungere una confluenza ~ 70% -80% (in genere 4-5 giorni), a quel punto le cellule sono preparate per la semina. 1,5 x 10 sono necessarie5 celle per generare ogni hMMT. Pertanto, passare le cellule secondo necessità per ottenere il numero richiesto di cellule.
    NOTA: Le linee cellulari progenitrici di mioblasti immortalizzate non devono mai superare l'80% di confluenza prima di seminare le cellule in pozzetti MyoTACTIC, passare le cellule o preparare scorte di congelatore. Le hMMT fabbricate da celle che hanno superato l'80% di confluenza spesso non riescono a raggiungere la maturità contrattile. Le procedure di passaggio sono identiche ai metodi descritti di seguito nel passaggio 3.

3. Semina di hMMT ingegnerizzati con MyoTACTIC

  1. Preparazione di pozzi di coltura MyoTACTIC e reagenti per la semina hMMT.
    NOTA: questo protocollo fornisce dettagli specifici per produrre 6 hMMT.
    1. 2-3 ore prima della semina cellulare, posizionare una porzione di piastra MyoTACTIC da 6 pozzetti in una piastra di coltura cellulare di 10 cm. Preparare bene ogni singola coltura MyoTACTIC aggiungendo 100 μL di una soluzione di F-127 Pluronic al 5% in ciascun pozzetto. Mettere il coperchio sul piatto di coltura da 10 cm, applicare la paraffina per sigillare lo spazio tra il piatto da 10 cm e il coperchio, quindi posizionare la piastra da 10 cm contenente la porzione MyoTACTIC in una centrifuga dotata di un adattatore spinner a piastre.
      NOTA: se non è disponibile un adattatore per spinner a piastra centrifuga, è possibile utilizzare una punta per pipetta p20 per rimuovere con cura le bolle da dietro i montanti, assicurando così che l'intera superficie di coltura sia rivestita in modo uniforme.
    2. Centrifugare a 1.550 x g per 1 minuto per rimuovere tutte le bolle all'interno dei pozzetti di coltura, specialmente dietro i pali. Conservare la capsula di coltura cellulare di 10 cm contenente la porzione di piastra MyoTACTIC contenente la soluzione di Pluronic F-127 a 4 °C fino a quando le cellule non sono preparate per la semina.
      NOTA: il rivestimento Pluronic F-127 può essere applicato per un minimo di 2 ore fino a 24 ore. Ad esempio, i pozzetti possono essere riempiti con la soluzione Pluronic F-127 alla fine della giornata per l'uso il giorno successivo. Non superare le 24 ore in quanto ciò avrà un impatto negativo sul rimodellamento dell'hMMT e non riuscirà a formare tessuti sani che raggiungono la maturità contrattile.
    3. Scongelare lentamente un'aliquota di estrazione di membrana basale da 50 μL e un'aliquota di trombina da 10 μL (soluzione madre da 100 U/mL) sul ghiaccio all'interno della cappa di coltura.
      NOTA: Non ricongelare le aliquote dell'estratto di membrana basale. Sono monouso. Le aliquote di trombina sono riutilizzabili, quindi, ricongelare fino a 5 volte dopo l'uso.
    4. Pesare ~ 7 mg di fibrinogeno in polvere in un tubo microcentrifuga da 1,5 ml e quindi trasferirlo nella cappa di coltura cellulare. Aggiungere 700 μL di soluzione di NaCl allo 0,9% (wt/vol) in acqua (o soluzione salina) per arrivare a una soluzione di concentrazione finale di 10 mg/mL. Non vorticoso il fibrinogeno per dissolversi, posizionare invece il tubo in un incubatore di colture cellulari a 37 °C per 3-5 minuti.
    5. Rimuovere e far scorrere delicatamente il tubo, quindi ruotare la soluzione disciolta in una mini centrifuga da banco (microfuga) e tornare alla cappa di coltura. Filtrare la soluzione di fibrinogeno utilizzando una siringa da 1 mL dotata di un filtro a siringa da 0,22 μm. Trasferire la soluzione di fibrinogeno disciolto in ghiaccio insieme all'estratto di membrana basale e alle aliquote di trombina.
    6. Infine, preparare il mezzo di semina hMMT che verrà introdotto nei pozzetti di coltura dopo la semina dei tessuti. Questo mezzo contiene Skeletal Muscle Cell Basal Medium integrato con il 20% di FBS, l'1% di P/S e il 3% di acido 6-aminocaproico (ACA; la concentrazione finale di 1,5 mg/mL si ottiene diluendo da una soluzione madre da 50 mg/mL; la % è espressa come v/v). Preriscaldare il supporto a 37 °C prima dell'uso.
  2. Preparazione di cellule per la semina hMMT.
    1. Raccogliere le piastre di coltura cellulare dall'incubatore di colture. Aspirare il fluido da ogni piastra, quindi lavare le celle una volta con D-PBS aggiungendo 5 ml di D-PBS in ogni piastra di coltura. Quindi aspirare il D-PBS e staccare le cellule aggiungendo 1 ml di tripsina-EDTA allo 0,25% in ogni piatto di coltura. Mettere nell'incubatore di colture cellulari per 3 min.
    2. Arrestare la tripsina aggiungendo 3 ml di mezzo di lavaggio (89% di 1x DMEM + 10% FBS + 1% Pen/Strep) al piatto di coltura. Trasferire la soluzione cellulare in un tubo conico di dimensioni appropriate, quindi pellettare le celle centrifugando a 400 x g per 10 minuti. Aspirare il fluido avendo cura di evitare il pellet cellulare. Quindi risospesare il pellet di cella in 1 mL del mezzo di lavaggio.
    3. Contare le cellule usando un emocitometro e un colorante blu di tripano sotto microscopia a campo luminoso.
      Se si utilizzano più piastre di cellule, questa sospensione cellulare sarà molto concentrata. Diluire le sospensioni cellulari prima di contare secondo necessità.
    4. Poiché ogni tessuto richiede 150.000 cellule risospese in 15 μL della miscela di matrice extracellulare (ECM), sono necessarie 900.000 cellule in 90 μL di miscela ECM per 6 tessuti. Per tenere conto della perdita di soluzione cellulare-ECM che si verifica durante il processo di preparazione a causa della formazione di bolle o della perdita di pipette, preparare una miscela extra cellula-ECM (cioè 8 tessuti o 1.200.000 cellule in 120 μL di ECM). Trasferire il volume della sospensione cellulare contenente 1.200.000 cellule in un nuovo tubo conico. Aumentare il volume a 10 ml con il mezzo di lavaggio e girare a 400 x g per 10 minuti.
    5. Mentre le cellule girano verso il basso, preparare una miscela ECM da 150 μL in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL utilizzando la seguente ricetta. Aggiungere prima 60 μL di DMEM (40% di volume), quindi aggiungere 60 μL di soluzione di Fibrinogeno 10 mg/mL (40% di volume) e infine aggiungere 30 μL di estratto di membrana basale (20% di volume). Conservare la miscela ECM su ghiaccio fino all'uso.
      NOTA: Utilizzare sempre punte pre-refrigerate a -20 °C quando si lavora con soluzioni contenenti estratto di membrana basale. La miscela ECM contiene 4 mg/mL di fibrinogeno.
  3. Semina hMMTs
    1. Raccogliere il tubo conico contenente le cellule filate e aspirare il mezzo avendo cura di evitare il pellet cellulare. Far scorrere vigorosamente l'estremità del tubo con un dito guantato per rimuovere il pellet e continuare a scorrere fino a quando il pellet appare come un liquame cellulare.
      NOTA: È importante aspirare il maggior numero possibile di mezzi di lavaggio per garantire che la sospensione cell-ECM sia alla diluizione desiderata. Utilizzare una pipetta per rimuovere i supporti di lavaggio rimanenti, se necessario.
    2. Trasferire 120 μL della soluzione ECM al tubo contenente il pellet cellulare. Pipettare su e giù per risospescere completamente le celle all'interno dell'ECM per generare una sospensione a cella singola. Pipettare lentamente e con attenzione per evitare l'introduzione di bolle, che ridurrebbero il volume di lavoro. Quindi, posizionare la soluzione cellulare-ECM su ghiaccio fino all'uso.
    3. Recuperare le porzioni di piastra MyoTACTIC contenenti pozzetti MyoTACTIC rivestiti con F-127 Pluronic dal frigorifero a 4 ° C e posizionare il piatto da 10 cm contenente i pozzetti MyoTACTIC sopra un impacco di ghiaccio all'interno della cappa di coltura cellulare.
    4. Aspirare la soluzione Pluronic F-127 da ciascun pozzo. Il PDMS è poroso e assorbirà la soluzione Pluronic F-127, specialmente se le piastre sono state filate con una centrifuga. Lasciare che la soluzione residua di Pluronic F-127 si rilasci e si depositi sul fondo del pozzo lasciando riposare i pozzetti per 5 minuti, quindi aspirare di nuovo.
      NOTA: utilizzare una pipetta Pasteur con una punta p1250 attaccata all'estremità e una punta p200 sopra la punta p1250 quando si aspira la soluzione Pluronic F-127. Ciò migliorerà la precisione per prevenire l'aspirazione accidentale delle strutture dei pali. Evitare di raschiare l'area di semina della cella a forma di piscina ovale sul fondo del pozzo con la pipetta in quanto ciò interrompe il rivestimento Pluronic F-127 e interferisce con il processo di auto-organizzazione hMMT. La tecnica corretta è quella di librare la punta della pipetta appena sopra la piscina ovale mentre si aspira la soluzione Pluronic F-127.
    5. Pipettare accuratamente la sospensione cell-ECM per risospescere eventuali cellule che potrebbero essere affondate sul fondo del tubo. Quindi trasferire 105 μL di sospensione cell-ECM in un tubo fresco pre-refrigerato da 1,5 mL. Fare attenzione ad afferrare il tubo vicino alla parte superiore per evitare che la soluzione si riscaldi.
    6. Aggiungere 0,84 μL della soluzione madre di trombina da 100 U/mL alla sospensione cellulare-ECM da 105 μL per arrivare ad una concentrazione finale di 0,2 U/mg di fibrinogeno. Pipettare rapidamente, con attenzione e accuratamente per mescolare, evitando l'introduzione di bolle.
      NOTA: La trombina avvia la rapida conversione del fibrinogeno in un coagulo di fibrina. Come tale, c'è un tempo limitato per seminare i tessuti dopo l'aggiunta di trombina. Per evitare la coagulazione prematura prima che la miscela cellula-ECM venga trasferita nei pozzetti di coltura, impostare una pipetta p20 a 15 μL prima di aggiungere la trombina. Utilizzare punte pre-refrigerate o immergere la punta della pipetta in DMEM ghiacciato per alcuni secondi prima di raccogliere e trasferire 15 μL della miscela cellula-ECM in ciascun pozzetto. È una buona pratica preparare aliquote di miscela cellulare-ECM in modo tale che non vengano seminati più di 6 hMMT alla volta.
    7. Per seminare i tessuti, aggiungere 15 μL di miscela cellula-ECM (cioè 150.000 cellule) a ogni singolo pozzetto. Aggiungere con attenzione la miscela cell-ECM al centro della piscina ovale ed evitare di premere la punta della pipetta sul fondo del pozzo. Quindi, con due movimenti leggeri, distribuire la sospensione cellulare dietro ogni palo nel pozzo. Una volta che la superficie è uniformemente rivestita nella sospensione cell-ECM, passare al pozzo successivo.
      NOTA: Lavorare in modo efficiente per evitare la gelificazione prematura della miscela cellula-ECM nel tubo prima che tutti i tessuti siano seminati. Quando si seminano i pozzetti, è estremamente importante evitare il trasferimento di bolle in quanto la bolla interferirà con il rimodellamento dell'hMMT, rendendo l'hMMT inutilizzabile.
    8. Posizionare il coperchio sulla piastra di coltura di 10 cm contenente i pozzetti seminati e trasferirlo in un incubatore di colture tissutali a 37 °C per circa 5 minuti.
      NOTA: Inserire il tubo microcentrifuga con miscela residua cellula-ECM nell'incubatore come conferma del processo di polimerizzazione del gel.
    9. Dopo che la miscela cellula-ECM si è polimerizzata, aggiungere 200 μL di mezzi di semina hMMT preribaltati a ciascun pozzetto MyoTACTIC. Sostituire il coperchio del piatto da 10 cm e restituire all'incubatrice le porzioni della piastra MyoTACTIC all'interno del piatto da 10 cm. Questo punto temporale è indicato come Giorno -2. Non disturbare i tessuti fino al passaggio successivo.
  4. Differenziazione degli hMMT
    1. Dopo 2 giorni di incubazione, rimuovere accuratamente il mezzo di semina hMMT utilizzando una pipetta e sostituirlo con 200 μL di mezzi di differenziazione preriscaldati contenenti il 2% di siero equino, l'1% di Pen/Strep, il 4% di ACA (cioè 2 mg/mL di concentrazione finale da una concentrazione di stock di 50 mg/mL; % è espresso come v/v) e 10 μg/mL di insulina ricombinante umana nel DMEM. Questo punto temporale è indicato come Giorno 0 di differenziazione.
    2. Successivamente, a giorni alterni, scambia metà dei media con nuovi mezzi di differenziazione fino al giorno 12 di differenziazione, l'ultimo giorno della cultura (Figura 2a).
      NOTA: I dettagli del protocollo per fabbricare hMMT utilizzando mioblasti umani primari sono stati pubblicati altrove30. Se ci sono preoccupazioni per la vitalità cellulare dopo la semina, incubare hMMT con calceina e ioduro di propidio per quantificare la vitalità.

4. Stimolazione elettrica e analisi della post deflessione indotta da hMMT

  1. Impostare un supporto per palco in vetro trasparente o plastica su un microscopio invertito e collegare una fotocamera dello smartphone all'oculare del microscopio utilizzando un supporto per fotocamera per microscopio. Verrà utilizzata la microscopia a contrasto di fase con ingrandimento 10x (Figura 3a).
    NOTA: qualsiasi microscopio a contrasto di fase invertito dotato di un obiettivo di ingrandimento 10x sarà appropriato. I costrutti del pozzo PDMS verranno rimossi dal piatto da 10 cm e posizionati direttamente sul supporto del palco inferiore trasparente e, quindi, aperti all'aria. Sterilizzare tutte le superfici e le attrezzature con il 70% di etanolo e ridurre al minimo il traffico nell'area durante la sperimentazione.
  2. Per preparare gli elettrodi di stimolazione elettrica, tagliare ~ 30 cm di filo di rame rivestito di stagno. Quindi, partendo dal mozzo di un ago smussato normale da 25 G, avvolgere strettamente ~ 10 cm del filo attorno alla metà superiore, lasciando ~ 20 cm di filo in eccesso. Ripetere per un secondo ago e quindi tagliare il mozzo da ciascun ago.
    NOTA: il filo deve essere stretto attorno all'ago per assicurarsi che non si muova e la parte avvolta del filo dell'elettrodo non deve toccare il PDMS in quanto ciò può impedire la generazione del campo elettrico.
  3. Collegare BNC al cavo connettore a clip alligatore a un canale di uscita sul generatore di forme d'onda e impostare il canale per impulsi quadrati con ciclo di lavoro del 20%, ampiezza di 5 V (intensità del campo elettrico di 10 V / cm). La frequenza si altererà tra 0,5 Hz e 20 Hz per contrazioni e contrazioni tetaniche, rispettivamente.
    NOTA: le impostazioni del generatore di forme d'onda potrebbero richiedere un'ottimizzazione specifica dell'esperimento
  4. Posizionare una porzione di piastra MyoTACTIC contenente hMMT sullo stadio del microscopio e inserire delicatamente ogni estremità smussata dell'elettrodo nel PDMS direttamente dietro ogni palo nella piscina ovale. Fissare con cura le sezioni di 20 cm di filo in eccesso allo stadio del microscopio in modo che gli aghi rimangano verticali e ~ 10 cm di ciascun filo rimangano liberi per il collegamento (Figura 3a).
    ATTENZIONE: non posizionare mai un dito nudo su entrambe le estremità dell'elettrodo. Assicurarsi che un ditale sia indossato sul dito indice per applicare una leggera pressione all'elettrodo al momento dell'inserimento nel PDMS.
  5. Focalizzare il campo visivo del microscopio su uno dei due post, in modo tale che la messa a fuoco sia nitida sul bordo del palo più vicino all'elettrodo. Quindi, blocca la messa a fuoco della fotocamera dello smartphone sull'area più chiara del post. Questo è importante per l'analisi a valle in quanto un cambiamento di messa a fuoco durante la registrazione interferirà con l'analisi.
  6. Collegare le estremità libere dei fili nastrati al generatore di forme d'onda tramite morsetti a coccodrillo (Figura 3a).
  7. Avviare la registrazione video sulla fotocamera dello smartphone, quindi attivare l'uscita del canale per avviare la stimolazione. Indurre l'hMMT a subire 3 contrazioni e 3 contrazioni tetaniche, con 2 minuti di riposo tra la serie di spasmi e stimolazione tetanica.
  8. Disattivare l'uscita del canale, staccare le clip di alligatore dai fili di rame rivestiti di stagno, rimuovere il nastro dai fili e pulire ogni elettrodo con etanolo al 70% prima di inserirlo nei successivi pozzetti hMMT. Ripetere la procedura dal passaggio 4.5 per tutti gli hMMT.
    NOTA: Limitare il tempo che gli hMMT trascorrono al di fuori dell'incubatore stimolando non più di 3 tessuti alla volta. Se rimangono da analizzare ulteriori hMMT all'interno della porzione di piastra MyoTACTIC, riportare la piastra all'incubatore per 10 minuti per consentire agli hMIT di tornare a 37 °C.
  9. Per analizzare la post deflessione in modo da calcolare la generazione di forza hMMT, utilizzare lo script personalizzato, che è stato reso disponibile su GitHub (https://github.com/gilbertlabcode/myoTACTIC). Segui le istruzioni in README.md per impostare e avviare lo script, quindi apri ogni video di tracciamento post per condurre l'analisi della forza.
  10. Seleziona una regione di interesse (ROI) lungo il bordo del post da monitorare per lo spostamento del post. Premere Invio per confermare il ROI e premere nuovamente Invio per eseguire lo script (Video supplementare 1).
    NOTA: grandi deflessioni causano il guasto del tracker. Se il tracker fallisce durante la contrazione, la dimensione del ROI può essere aumentata per rendere il tracciamento meno sensibile, ma consentire il tracciamento di grandi deflessioni. Nel codice sono disponibili tre dimensioni che possono essere ottimizzate regolando i commenti dello script.
  11. Lo script termina con due requisiti di input. Innanzitutto, inserisci y per confermare che il video conteneva più contrazioni. In secondo luogo, immettere y (sì) o n (no) per esportare i risultati in un file . Csv (Video supplementare 1).
  12. Assicurati che i risultati della deflessione siano riportati come spostamento in pixel per ogni contrazione. Convertire i pixel in valori μm per l'impostazione di ingrandimento 10x del microscopio. Quindi, convertire i numeri post spostamento in forze contrattili assolute (μN) moltiplicando i valori (μm) per il fattore di conversione forza-spostamento di 2,36 μN / μm, che corrisponde al rapporto agente polimerizzante 1:15 / monomero del PDMS utilizzato nella fabbricazione MyoTACTIC30.

5. Analisi dei transitori di calcio mediante stimolazione elettrica

NOTA: Per gli esperimenti di manipolazione del calcio, i mioblasti immortalizzati sono stati stabilmente trasdotti con il reporter MHCK7-GCAMP6 come precedentemente descritto11,12. Le cellule trasdotte sono state selezionate FACS per GFP per ottenere la popolazione positiva e quindi utilizzate per fabbricare hMMT. Metodi alternativi per l'imaging del calcio come l'utilizzo di coloranti metrici di rapporto come Fura-2 AM e Indo-1 o l'imaging a vita di fluorescenza di indicatori di calcio (ad esempio, Fluo-4 o Oregon Green BAPTA1) possono essere suscettibili al nostro sistema.

  1. Impostare lo stadio del microscopio e l'apparecchiatura di stimolazione (elettrodi, generatore di forme d'onda, ecc.) come precedentemente descritto nel passaggio 4. Per questo esperimento, utilizzare un ingrandimento 4x.
    NOTA: saranno necessari una camera oscura e un microscopio a epifluorescenza dotato di una fotocamera CCD.
  2. Avviare il software di imaging del microscopio, selezionare il canale del filtro FITC (luce blu) e selezionare la funzione di registrazione del filmato. Impostato su un'esposizione di 500 ms e una risoluzione di 680 x 510 (Binning 2x2).
    NOTA: il software di imaging può variare e l'esposizione viene impostata manualmente dall'utente. Fare attenzione ad evitare la sovraesposizione all'hMMT prima della stimolazione. A riposo, un contorno/ombra di tessuto scuro con fluorescenza spontanea è normale mentre un'immagine tissutale chiara è sovraesposizione (Video supplementare 2). Assicurarsi che l'esposizione sia coerente per tutti gli hMMT all'interno di un esperimento.
  3. Chiudere l'otturatore del microscopio e tenere spento il canale FITC fino a quando non è pronto per registrare la manipolazione del calcio.
  4. Quando tutte le apparecchiature e il software sono configurati, recuperare la porzione di piastra MyoTACTIC contenente gli hMMT da analizzare e posizionarla direttamente sul palco del microscopio. Quindi, inserire e collegare gli elettrodi come descritto in precedenza nel passaggio 4.
  5. Utilizzate brightfield per mettere a fuoco il campo visivo al centro dell'hMMT selezionato. Quindi, spegnere la lampada.
  6. Aprire l'otturatore del canale FITC del microscopio, verificare che la luce blu sia accesa, quindi selezionare Movie Record nel software.
  7. Accendere l'uscita sul generatore di forme d'onda per avviare la stimolazione elettrica. Indurre l'hMMT a subire 8 contrazioni e 8 contrazioni del tetano. Consentire 2 minuti di riposo tra la serie di spasmi e stimolazione del tetano, durante i quali l'otturatore FITC è in posizione chiusa.
    NOTA: Consentire 10 s di attività spontanea prima e dopo la stimolazione elettrica per registrare la fluorescenza minima a fini di calcolo e analisi dei dati.
  8. Spegnere l'uscita del canale, staccare le clip di alligatore dai fili di rame rivestiti di stagno, rimuovere il nastro dai fili e pulire ogni elettrodo con etanolo al 70% prima di inserirlo nei successivi pozzetti hMMT. Ripetere la procedura di stimolazione e registrazione per tutti gli hMMT.
  9. Salva i filmati in formato di file TIFF per l'analisi in ImageJ o software di imaging alternativo.
    NOTA: Limitare il tempo che gli hMMT trascorrono al di fuori dell'incubatore stimolando non più di 3 tessuti alla volta. Se l'hMMT aggiuntivo all'interno della porzione di piastra MyoTACTIC rimane da analizzare, riportare il dispositivo all'incubatore per 10 minuti per consentire agli hMIT di tornare a 37 °C.
  10. Per analizzare i dati transitori del calcio, aprire prima ImageJ. Selezionare Analizza, quindi Imposta misure, quindi selezionare il valore grigio medio e deselezionare tutte le altre opzioni. Al termine, aprire un video di calcio (.tiff) (Video supplementare 2).
  11. Delineare il bordo del microtissue utilizzando uno strumento di selezione dei poligoni e salvare quest'area come ROI (Video supplementare 2). In Altro nella finestra ROI Manager, selezionare Multi misura e misurare l'intensità fluorescente per tutte le sezioni di file in una riga per sezione ( Videosupplementare 2).
  12. Copia tutte le misurazioni, incluso il numero di fetta (fotogramma), in un foglio di calcolo e confronta l'intensità fluorescente di ogni fetta con l'intensità fluorescente spontanea minima dal file usando ΔF/F0 = (Fimmediato - Fminimo)/ Fminimo (Video supplementare 2).
  13. Calcola il tempo per ogni fotogramma moltiplicando la velocità del fotogramma di registrazione del filmato per il numero di sezioni (fotogramma) e traccia ΔF / F0 rispetto al tempo per la risposta transitoria del calcio hMMT alla stimolazione (Video supplementare 2).
  14. Selezionare il segnale transitorio di picco del calcio per ciascuna delle 6 contrazioni consecutive e i valori medi per calcolare la variazione media relativa dell'intensità fluorescente di picco di ciascun hMMT (Video supplementare 2).
    NOTA: escludere sempre dall'analisi complessiva i dati derivanti dalla prima contrazione di contrazione. Un foglio di calcolo intitolato "Calcium Handling Template.xlsx" è stato fornito su GitHub (https://github.com/gilbertlabcode/Calcium-Handling-Template-) per facilitare l'analisi dei transitori di calcio hMMT. Le celle compilabili in cui devono essere immessi valori e input sono evidenziate in grigio. Assicurati di regolare i numeri di selezione dei picchi in quanto questa è solo una guida per aiutare nella selezione dei picchi (Video supplementare 2).

Risultati

Di seguito sono descritti i metodi per lanciare una piattaforma di coltura MyoTACTIC basata su PDMS a 96 pozzetti da uno stampo PU, per fabbricare matrici di tessuti replica hMMT e per analizzare due aspetti della funzione hMMT all'interno della generazione della forza del dispositivo di coltura e della manipolazione del calcio. La Figura 1 offre una panoramica schematica della preparazione dei pozzetti di coltura MyoTACTIC prima della semina hMMT. PDMS è un polimero a base di silicone ampi...

Discussione

Questo manoscritto descrive i metodi per fabbricare e analizzare un modello di coltura hMMT 3D che può essere applicato a studi di biologia muscolare di base, modellazione di malattie o per test di molecole candidate. La piattaforma MyoTACTIC è economica, facile da produrre e richiede un numero relativamente piccolo di cellule per produrre microtessuti muscolari scheletrici. Gli hMMT formati all'interno della piattaforma di coltura MyoTACTIC sono composti da miotubi allineati, multinucleati e striati e rispondono agli ...

Divulgazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Riconoscimenti

Vorremmo ringraziare Mohammad Afshar, Haben Abraha, Mohsen Afshar-Bakooshli e Sadegh Davoudi per aver contribuito all'invenzione della piattaforma culturale MyoTACTIC e per aver stabilito i metodi di fabbricazione e analisi descritti nel presente documento. HL ha ricevuto finanziamenti da un programma di formazione del Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) in Organ-on-a-Chip Engineering and Entrepreneurship Scholarship e da una borsa di studio per laureati Wildcat dell'Università di Toronto. PMG è la cattedra di ricerca canadese in riparazione endogena e ha ricevuto supporto per questo studio dall'Ontario Institute for Regenerative Medicine, dalla Stem Cell Network e da Medicine by Design, un canada first research excellence program. I diagrammi schematici sono stati creati con BioRender.com.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
0.9% Saline Solution, SterileHouse Brand101010 mL aliquots of the solution are made and stored at 4°C
25G NeedleBD, Medstore, University of Toronto2548-CABD305127
6-Aminocaproic Acid, ≥99% (titration), PowderSigma - AldrichA2504-100GA 50 mg / mL stock solution is generated by dissolving 5 mg of 6-aminocaproic acid powder in 100 mL of autoclaved, distilled water. The solution is vaccum filtered and 10 mL aliquots are stored at 4°C
6.35 mm ID TubingVWR60985-528
AB1167 Myoblast Cell LineInstitut de Myologie (Paris, France)
Arbitrary Waveform GeneratorRigolDG1022Z
Basement Membrane Extract (Geltrex)Thermo Fisher ScientificA14132-02Stored as aliquots of 50 µL or 100 µL at -80°C
Benchtop Vacuum ChamberSigma - AldrichD2672
BNC to Aligator Clip CableOrdered from Amazon
Culture PlasticsSarstedtIncludes culture plates, serological pipettes, etc
Dimethyl SulfoxideSigma - AldrichD8418-250ML
DPBS, Powder, No Calcium, No MagnesiumThermo Fisher Scientific21600069
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1X)Gibco11995-065This is a high glucose DMEM with L-glutamine and sodium pyruvate
Fetal Bovine SerumFisher Scientific10437028
Fibrinogen from Bovine PlasmaSigma - AldrichF8630-5GAliquots ranging from 7 - 10 mg of fibrinogen powder are made and stored at -20°C
Filtropur Syringe Filter, 0.22um Pore SizeSarstedt83.1826.001
Horse SerumGibco16050-122
Human Recombinant InsulinSigma - Aldrich91077CStock solution is 100X and made by dissolving 1 mg of human recombinant insulin in 1 mL of DMEM and 1 µL of NaOH 10N. Solution is filtered and stored as 1 mL aliquots at 4°C
Image Acquisition SoftwareOlympuscellSens Dimension
Image Processing SoftwareNational Institutes of HealthImageJ
Isotemp OvenThermo Fisher Scientific201
MicroscopeOlympusIX83
Microscope - Camera MountLabcamLabcam for iPhoneOrdered from Amazon
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)Gibco15140-122
Plastic Disposable Syringes, 1ccBD2606-309659
Plastic Disposable Syringes, 50ccBD2612-309653
Pluronic F-127, Powder, BioReagentSigma - AldrichP2443-250GA 5% stock solution of pluronic acid is made by dissolving 5 g of pluronic acid powder in 100 mL of chilled, autoclaved, distilled water. The solution is vaccum filtered and 10 mL aliquots are stored at 4°C
Polydimethylsiloxane (Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit)Dow4019862Kits are also available at Thermo Fisher Scientific, Sigma - Aldrich, etc.
Polyurethane Negative MoldIn House
Release AgentMann Release Technologies200
Rotary Vane Vacuum PumpEdwardsA65401906
ScalpelAlmedic, Medstore, University of Toronto2586-M36-0100
Single Edge Razor BladeVWR55411-050
Skeletal Muscle Cell Basal MediumPromocellC-2326030 mL aliquotes are generated and at stored at 4°C.
Skeletal Muscle Cell Growth Medium (Ready-to-use)PromocellC-2306042 mL aliquots are generated and stored at 4°C.
Smartphone (iPhone)AppleSE
Standard Duty Dry Vacuum PumpWelch2546B-01
Sterilization BagAlliance211-SCM2
ThimbleIgegeOrdered from Amazon
Thrombin from human plasmaSigma - AldrichT6884-250UN100 units of thrombin is dissolved in 1 mL of a 0.1% BSA solution. 10 µL aliquots are prepared and stored at - 20°C.
Tin coated copper wireArcoB8871K48Ordered from Amazon
Trypan Blue Solution, 0.4%Thermo Scientific15250061
Trypsin-EDTA, 0.25%Thermo FIsher Scientific25200072
Vacuum Chamber 2SP Bel-ArtF42027-0000

Riferimenti

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