JoVE Logo
저자
연락처

로그인

JoVE 비디오를 활용하시려면 도서관을 통한 기관 구독이 필요합니다. 전체 비디오를 보시려면 로그인하거나 무료 트라이얼을 시작하세요.

기사 소개

  • 요약
  • 초록
  • 서문
  • 프로토콜
  • 결과
  • 토론
  • 공개
  • 감사의 말
  • 자료
  • 참고문헌
  • 재인쇄 및 허가

요약

이 원고는 수축력 및 칼슘 취급 분석을 포함하여 기능분석에서 3D 인간 골격 근 미세 조직 및 최소 침습 다운스트림의 배열을 생성하는 상세한 프로토콜을 설명합니다.

초록

골격 근의 체외 모델에서 3차원 (3D)은 골격 근육 개혁을 연구하고 실험 적 조작에 적합한 확장 가능한 형식으로 기능을 할 수있는 기회를 제공함에 따라 생체 의학 연구에서 귀중한 발전입니다. 3D 근육 배양 시스템은 과학자들이 인간 세포의 맥락에서 골격 근 ex vivo를 연구할 수 있게 해 주도록 하는 것이 바람직합니다. 체외 모델에서 3D는 성인 골격 근의 기본 조직 구조의 측면을 밀접하게 모방합니다. 그러나 보편적 인 응용 프로그램은 조작, 비용 및 사용자 친화적 인 플랫폼의 가용성에 의해 제한되며 상대적으로 많은 양의 인간 골격 근육 조직을 산출합니다. 또한, 골격 근은 많은 질병 상태에서 시간이 지남에 따라 손상되는 중요한 기능적 역할을 하기 때문에, 미세 조직 연구를 위한 실험 플랫폼은 최소침습칼슘 과도 및 수축력 측정이 플랫폼 자체 내에서 직접 수행될 수 있을 때 가장 실용적입니다. 본 프로토콜에서, 'MyoTACTIC'로 알려진 96웰 플랫폼의 제조, 3D 인간 골격 근육 미세 조직(hMMTs)의 대량 생산이 설명된다. 또한, 시간이 지남에 따라 각 미세 조직의 골격 근육력 및 칼슘 처리의 반복적인 측정을 가능하게 하는 전기 자극의 최소 침습적 적용 방법을 보고한다.

서문

골격 근은 인체에서 가장 풍부한 조직 중 하나이며 운동, 열 항상성 및 신진 대사1과같은 주요 신체 기능을 지원합니다. 역사적으로, 동물 모델 및 2차원(2D) 세포 배양 시스템은 생물학적 과정및 질병 병인을 연구하고, 골격 근질환 의 치료에 약리학적 화합물을 테스트하는 데 사용되어왔다2,3. 동물 모델은 건강과 질병에 있는 골격 근육에 대한 우리의 지식을 크게 향상시켰지만, 그들의 번역 영향은 높은 비용, 윤리적 고려 사항 및 종 간 차이2,4에의해 방해되었습니다. 골격 근육을 연구하기 위해 인간 세포 기반 시스템으로 전환할 때, 2D 세포 배양 시스템은 단순성 때문에 유리합니다. 그러나 제한사항이 있습니다. 이 형식은 종종 신체5,6내에서 자연적으로 발생하는 세포 세포 및 세포 외 세포 매트릭스 상호 작용을 다시 수적으로 회수하지 못합니다. 지난 몇 년 동안, 3차원(3D) 골격 근 모델은 생리학적 및 병리학적으로 관련된 과정의 모델링을 허용함으로써 전체 동물 모델 및 종래의 2D 배양 시스템에 대한 강력한 대안으로 등장하였다7,8. 실제로, 연구의 과다 바이오 인공 3D 배양 포맷1에서인간의 골격 근육을 모델링하는 전략을보고했다. 이러한 연구의 많은 한 가지 제한은 활성 힘이 배양 플랫폼에서 근육 조직을 제거하고 힘 변환기에 부착한 후 정량화되어 있으며, 이는파괴적이고 따라서 종점 분석9,10,12,13,14,15,16,17,18로 봉사하는 것으로 제한된다. ,19,20,21. 다른 사람들은 활성력을 측정하는 비침습적 방법을 허용하는 배양 시스템을 설계했지만, 모두 고함량 분자 테스트 응용 프로그램7,8,9,10,14,18,22,23,24,25,26,27, 27, 28에적합합니다. ,29.

이 프로토콜은 골격 근육 (Myo) 마이크로 조직 배열 편차 대한 조사를 위해 인간 근육 미세 조직 (hMMTs)을 제조하는 상세한 방법을 설명 (MyoTACTIC) 플랫폼; 3D 골격 근 미세조직(30)의벌크 생산을 지원하는 96개의 웰 플레이트 장치. 근로전술 플레이트 제조 방법은 96개의 잘 된 폴리디메틸실록산(PDMS) 배양판과 모든 상응하는 음피성을 단일 주조 단계에서 가능하게 하며, 이에 따라 각각의 우물은 미세 조직 형성을 위해 상대적으로 적은 수의 세포가 필요하다. 근로전술 내에서 형성된 미세조직은 장치의 우물에서 잘 에서 재현할 수 있는 정렬, striated 및 다핵근구를 포함하고, 성숙시, 시투30에서화학 및 전기 자극에 반응할 수 있다. 본 명세서에서, 폴리우레탄(PU) 복제본으로부터 PDMS 근구배양판 장치를 제조하는 기술은, hMMT를 제조하기 위해 불멸의 인간 근생 전조세포를 구현하는 최적화된 방법, 그리고 엔지니어링된 hMMT 력 생성 및 칼슘 취급 특성의 기능적 평가를 설명하고 논의한다.

프로토콜

1. PDMS 심오전술 플레이트 제작

참고 : PDMS 근로식 플레이트 제작은 이전에 설명 된30과같이 제조 될 수있는 PU 음성 금형이 필요합니다. MyoTACTIC 플레이트 설계를 위한 컴퓨터 지원 설계(CAD) SolidWorks 파일은 GitHub(https://github.com/gilbertlabcode/MyoTACTIC-SolidWork-CAD-file)에서 사용할 수 있게 되었습니다.

  1. 실리콘 엘라스토머 키트의 성분을 이용하여 단량제에 단조량의 1:15 비율로 일회용 플라스틱 컵에 PDMS 폴리머 용액 110g을 준비한다. 폴리머 용액을 완전히 혼합하고 균일할 때까지 5mL 일회용 세로지피펫을 사용하여 2-3분 동안 저어줍니다.
    주의: 피부 및 눈과 의접촉 PDMS 폴리머 용액을 피하십시오; 흡입을 피하십시오. 액체 PDMS 혼합물을 처리할 때 항상 실험실 코트와 일회용 장갑을 착용하고 특정 안전 프로토콜에 대한 안전 데이터 시트(SDS)를 참조하십시오.
    참고: PDMS 폴리머 용액 유출 시 일회용 커버물로 장비 표면(예: 스케일, 벤치 탑 등)을 보호합니다.
  2. -30분 동안 표준 듀티 드라이 진공 펌프에 연결된 벤치탑 진공 챔버 내에 컵을 배치하거나 모든 거품이 제거될 때까지 실온에서 혼합물을 분해합니다. 5-10분마다 진공을 부러뜨려 탈가스를 돕습니다. 빈 50mL 주사기 배럴을 사용하여 공기를 급락시키고 필요에 따라 폴리머 혼합물 표면에 남은 기포를 날려 버리도록 하십시오.
    참고 : 6.35mm ID 튜브를 사용하여 P1250 파이펫 팁을 배럴에 연결하여 공기 스트림의 속도와 정확성을 향상시킬 수 있습니다.
  3. PDMS 폴리머 용액이 탈가스화되는 동안, 마른 종이 타월로 가장자리와 표면을 부드럽게 닦아 PU 네거티브 몰드에 부착된 PDMS의 남은 조각을 제거합니다. 70-100kPag로 설정된 시설 압축 공기를 사용하여 남은 미세 입자를 제거하십시오.
    참고: PU 네거티브 몰드를 밀봉 가능한 비닐 봉지에 넣고 실험실 교통으로부터 보호되는 서랍 내에 보관하여 손상 및 미립자 축적으로부터 보호합니다.
  4. PU 금형을 일회용 덮개로 보호한 화학 후드에 놓습니다. 금형을 ~75°로 수평으로 서서 방출 제의 균일한 층으로 활성 표면을 분사하십시오. 금형을 위에서 아래로 살포한 다음, 금형에서 캔을 15-20cm 를 잡고 앞뒤로 스위핑 동작을 사용하여 금형을 좌우로 분사합니다. 금형을 180° 회전시키고 스프레이를 반복한 다음 PU 금형이 화학 후드에 10-15분 동안 앉아 건조시키도록 합니다.
    주의: 방출제가 화학 연기 후드 내에서 사용되도록 하고, 피부와 눈과의 접촉을 피하고, 특정 안전 프로토콜에 대한 안전 데이터 시트(SDS)를 참조하십시오.
    참고: 박막은 활성 표면을 완전히 커버해야 하지만, 과도한 코팅은 다음 단계에서 PDMS로 전송될 수 있으며, 이는 hMMT 파종에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다. 표면은 촉감에 매끄럽게 느껴야하지만 젖지 않아야합니다.
  5. 100g의 PDMS를 PU 몰드에 고르게 붓고 회전식 베인 진공 펌프에 연결된 진공 챔버 내에 놓습니다. PDMS가 채워진 금형을 ~45분 동안 데가스로 데이스하여 처음 20분 동안 5-10분간격으로 진공 씰을 부러뜨려 공정을 가속화합니다. PDMS 혼합물이 모든 거품이 완전히 무효화 될 때까지 진공 챔버 내에 둡니다.
    참고: 로터리 베인 진공 펌프는 낮은 진공을 달성하고 이 단계에 필요한 시간을 줄이는 데 사용됩니다. PDMS 채워진 금형의 탈기는 벤치탑 진공 챔버와 표준 듀티 드라이 진공 펌프를 사용하여 수행 될 수 있지만, 모든 기포의 혼합물을 무효화하는 시간은 더 길어질 것이다. 필수 는 특히 hMMT 앵커링 포스트가 될 운명 그 지역에서 PDMS 폴리머 솔루션에서 모든 거품의 제거입니다. 이 지역의 거품은 앵커 포스트 파손, 문화 우물의 손실, 그리고 차례로 금형에 쐐기 남아있는 PDMS의 작은 조각을 초래할 것이다.
  6. 탈가스 PDMS채워진 PU 몰드를 65°C 오븐으로 옮기고 밤새 배양하여 액체 고무를 치료합니다.
  7. 오븐에서 경화 된 PDMS 양성 판을 제거하고 적어도 30 분 동안 실온에서 접시를 식힙니다.
  8. 블레이드없는 메스로 PDMS와 금형의 벽 사이의 손잡이 뒷면을 실행하여 PU 금형에서 부드럽게 경화 된 PDMS를 분리합니다. 상단 가장자리를 따라 시작하여 금형의 베이스로 아래로 밀어이 부분을 분리하기 전에 4 면을 모두 분리합니다. 이 단계는 핸들 의 뒷면이 PDMS와 PU 금형의 모든 4 벽 사이에 원활하게 실행될 때 완료됩니다.
    참고: 블레이드없는 메스로 천천히 조심스럽게 작동하여 PU 금형을 깨거나 PDMS를 찢어 버리는 것을 방지합니다. 이 단계는 15-20 분 정도 걸릴 것입니다.
  9. 한쪽 끝에서 시작하여 블레이드없는 메스를 사용하여 PDMS의 가장자리를 들어 올리고 경화 된 PDMS 배양 판과 PU 금형 사이의 손가락을 작동시하십시오. 그런 다음 양손을 사용하여 접시 아래에 손가락을 더 밀어 넣고 PU 금형에서 천천히 벗겨냅니다.
    참고: 천천히 작업하고 양손을 사용하여 접시를 고르게 벗깁니다. 굽힘 최소화하여 앵커 포스트 파손 가능성을 줄입니다. 이 단계는 5-10 분 정도 걸릴 것입니다.
  10. 단일 가장자리 면도날을 사용하여 플레이트를 조직 파종 목적으로 6 ± 2 MyoTACTIC우물(그림 1)의그룹으로 자른다. 전체 MyoTACTIC 플레이트 또는 플레이트 부분을 120°C 및 100-140 kPag에서 25분 건조 사이클(살균 시간 20분, 건조 시간 5분)에 대한 기기 살균 가방 및 오토클레이브에 넣습니다.

2. 불멸의 인간 근세포 세포 배양

참고 : 이 프로토콜에 사용되는 불멸의 myoblasts는 Institut 드 Myologie (파리, 프랑스)31에서얻었다.

  1. 액체 질소 탈전에서 냉동 세포의 하나의 유리병을 얻고 37 °C 수조에서 유리병을 빠르게 해동 (1 분 미만). 세포는 90% 태아소 혈청(FBS)과 10% 디메틸 설프리산화물(DMSO)로 구성된 동결 매체의 1mL당7.5 x 10 5 세포의 밀도로 동결된다.
  2. 유리병의 내용물들을 15mL 원판튜브로 부드럽게 전송하여 89% DMEM 1x, 10% FBS 및 1% 펜/스트렙으로 구성된 9mL의 사전 온난한 세척 매체를 함유하여 DMSO를 희석시 한다. 15mL 원판 튜브를 400 x g에서 10 분 동안 돌린 다음 세포 펠릿을 피하기 위해 주의를 기울여 미디어를 흡입하십시오.
  3. 골격 근육 세포 성장 중간 보충 믹스, 15% FBS 및 1% 펜/스트렙으로 구성된 성장 매체의 1 mL에서 펠릿을 다시 중단한 다음 29mL의 성장 매체를 가진 50mL 원추형 튜브로 이송합니다.
  4. 약 2.5 x 105 셀을 함유한 10mL의 배지를 100mm x 20mm 세포 배양 접시에 옮킨다. 셀 용액의 나머지 20mL로 이 단계를 반복합니다. 그런 다음 세포 배양 접시를 37°C 및 5% CO2로설정된 가습세포 배양배기로 옮는다.
  5. 격일로 문화 미디어를 새로 고칩니다. 세포가 달성될 때까지 세포를 배양하여 ~ 70%-80% 수렴성(일반적으로 4-5일) 이 시점에서 세포가 파종에 대비합니다. 1.5 x105 셀은 각 hMMT를 생성해야합니다. 따라서 필요한 수의 세포를 달성하기 위해 필요에 따라 세포를 통과합니다.
    참고: 불멸의 근아세포 선조 세포주는 세포를 MyoTACTIC 우물로 파종하거나 세포를 지체하거나 냉동고 주식을 준비하기 전에 80%의 합류를 초과해서는 안 됩니다. 80%의 컨플루언스를 초과한 세포에서 제작된 hMMT는 수축 성숙도에 도달하지 못하는 경우가 많습니다. 통과 절차는 3단계에서 설명된 방법과 동일합니다.

3. 심근과 hMMT를 시드

  1. hMMT 파종을 위한 근기문화우물 및 시약의 준비.
    참고: 이 프로토콜은 6hMMT를 생성하기 위한 구체적인 세부 정보를 제공합니다.
    1. 세포 파종 전 2-3 시간, 10cm 세포 배양 접시에 6웰 MyoTACTIC 플레이트 부분을 놓습니다. 각 각 웰에 5% Pluronic F-127 용액의 100 μL을 추가하여 각 개별 근사 문화를 잘 준비하십시오. 10cm 배양 접시에 뚜껑을 놓고 파라핀을 바르면 10cm 접시와 뚜껑 사이의 공간을 밀봉한 다음, 심근부분을 함유한 10cm 플레이트를 플레이트 스피너 어댑터가 장착된 원심분리기에 넣습니다.
      참고: 원심분리기 플레이트 스피너 어댑터를 사용할 수 없는 경우 p20 파이펫 팁을 사용하여 포스트 뒤에서 거품을 조심스럽게 제거하여 전체 배양 표면을 고르게 코팅할 수 있습니다.
    2. 1,550 x g의 원심분리기는 문화 우물 내의 모든 거품을 제거하기 위해 1 분 동안, 특히 게시물 뒤에 있습니다. 세포가 파종될 때까지 4°C에 Pluronic F-127 용액을 함유한 MyoTACTIC 플레이트 부분을 함유한 10cm 세포 배양 접시를 저장한다.
      참고: 플루론 F-127 코팅은 24시간까지 2시간 정도 가을로 도포할 수 있다. 예를 들어, 우물은 다음날 사용하기 위해 하루의 끝에 Pluronic F-127 솔루션으로 채워질 수 있습니다. 이 hMMT 리모델링에 부정적인 영향을 미치고 수축 성숙에 도달 하는 건강 한 조직을 형성 하지 못할 것 이다 24 h를 초과 하지 마십시오.
    3. 50 μL 지하 멤브레인 추출물 알리쿼트와 10μL 혈소판 알리쿼트(100 U/mL 스톡 용액) 1개를 배양 후드 내의 얼음에 천천히 해동합니다.
      참고: 지하 멤브레인 추출 알리쿼트(aliquots)를 재동결하지 마십시오. 그들은 일회용입니다. Thrombin 알리따스는 재사용 이 가능하므로 사용 후 최대 5회 다시 동결할 수 있습니다.
    4. 1.5mL 마이크로센심분리기 튜브에서 분말 피브리노겐의 7 mg을 계량한 다음 세포 배양 후드로 옮김합니다. 물(또는 식염수 용액)에 0.9%(wt/vol) NaCl 용액의 700 μL을 추가하여 10 mg/mL 최종 농도 솔루션에 도달합니다. 용해하는 피브리노겐을 피혈성하지 말고, 대신 3-5 분 동안 37 °C 세포 배양 인큐베이터에 튜브를 배치하십시오.
    5. 튜브를 부드럽게 제거하고 플릭한 다음 벤치탑 미니 원심분리기(microfuge)에서 용해액을 스핀하고 배양 후드로 돌아갑니다. 0.22 μm 주사기 필터가 장착된 1mL 주사기를 사용하여 피브리노겐 용액을 필터링합니다. 용존 된 피브리노겐 용액을 지하 막 추출물 및 혈전 알리쿼트와 함께 얼음으로 옮기습니다.
    6. 마지막으로, 조직의 시드 후 문화 우물에 소개 될 hMMT 파종 미디어를 준비합니다. 이 매체에는 20% FBS, 1% P/S 및 3% 6-aminocaproic acid(ACA; 1.5 mg/mL 최종 농도)로 보충된 골격 근육 세포 기초 매체가 포함되어 있으며, 50 mg/mL 스톡 용액에서 희석하여 최종 농도가 달성되고, %는 v/v로 표현됩니다. 사용하기 전에 37 °C에서 미디어를 미리 데워보시면 됩니다.
  2. hMMT 파종을 위한 세포의 준비.
    1. 배양 배양 배양판에서 세포 배양판을 수집한다. 각 플레이트에서 미디어를 흡인한 다음 각 배양판에 5mL의 D-PBS를 추가하여 D-PBS로 한 번 세척합니다. 다음으로 D-PBS를 흡기하고 각 배양 요리에 0.25%의 트립신-EDTA 1mL을 추가하여 세포를 분리합니다. 세포 배양 인큐베이터에 3 분 동안 배치하십시오.
    2. 배양 접시에 3mL 워시 매체(DMEM 1x 의 89% + 10% FBS + 1% 펜/스트렙)를 추가하여 트립신을 중단합니다. 셀 용액을 적절한 크기의 원판 튜브로 옮긴 다음 10분 동안 400 x g에서 원심분리하여 세포를 펠릿합니다. 세포 펠릿을 피하기 위해 주의를 기울이는 미디어를 흡인합니다. 그런 다음 세척 매체의 1mL에서 세포 펠릿을 다시 중단합니다.
    3. 혈안세포계와 트리판 블루 염료를 사용하여 세포를 계산합니다.
      세포의 다중 플레이트를 사용하는 경우, 이 세포 현탁액은 매우 집중될 것이다. 필요에 따라 계산하기 전에 셀 현탁액을 희석시.
    4. 각 조직은 세포외 매트릭스(ECM) 혼합물의 15 μL에서 150,000개의 세포를 재중단해야 하기 때문에, ECM 혼합물의 90 μL에서 900,000개의 세포가 6개의 조직에 필요합니다. 기포 형성 또는 파이펫 손실로 인한 준비 과정에서 발생하는 세포-ECM 용액 손실을 고려하여, 엑스트라 셀-ECM 혼합물(즉, 8조직 또는 120μL in ECM)을 준비한다. 1,200,000세포를 포함하는 세포 현탁액의 부피를 새로운 원문 튜브로 옮기다. 세척 매체로 볼륨을 10mL로 늘리고 10 분 동안 400 x g에서 회전하십시오.
    5. 세포가 아래로 회전하는 동안, 다음 레시피를 사용하여 1.5 mL 마이크로 센심 분리기 튜브에 150 μL ECM 혼합물을 준비합니다. 먼저 DMEM의 60 μL (40 % 부피)를 추가 한 다음 60 μL의 피브리노겐 10 mg / mL 용액 (40 % 부피)을 추가하고 마지막으로 지하 멤브레인 추출물 (20 % 부피)의 30 μL을 추가합니다. ECM 혼합물을 사용 때까지 얼음에 보관하십시오.
      참고: 지하 멤브레인 추출물이 포함된 솔루션으로 작업할 때항상 -20°C에서 미리 냉각된 팁을 사용합니다. ECM 혼합물은 피브리노겐의 4 mg/mL을 함유하고 있습니다.
  3. 시드 hMMT
    1. 세포가 분사되는 원적 관을 수집하고 세포 펠릿을 피하기 위해 주의를 기울여 미디어를 흡인합니다. 장갑을 낀 손가락으로 튜브 끝을 힘차게 쓸어내어 펠릿을 빼내고 펠릿이 세포 슬러리로 나타날 때까지 계속 깜박입니다.
      참고: 셀-ECM 서스펜션이 원하는 희석에 있는지 확인하기 위해 가능한 한 많은 세척 매체를 흡인하는 것이 중요합니다. 파이펫을 사용하여 필요한 경우 남은 세척 매체를 제거합니다.
    2. ECM 용액의 120 μL을 세포 펠릿을 포함하는 튜브로 이송한다. 파이펫은 ECM 내의 세포를 철저히 재보페하여 단일 셀 현탁액을 생성합니다. 파이펫은 거품을 도입하지 않도록 천천히 조심스럽게 사용하여 작업 량을 줄입니다. 그런 다음 셀-ECM 용액을 사용할 때까지 얼음 위에 놓습니다.
    3. 4°C 냉장고에서 코팅된 MyoTACTIC 웰을 함유한 MyoTACTIC 플레이트 부분을 검색하고, 세포 배양 후드 내부에 있는 얼음 팩 위에 MyoTACTIC 유정이 들어 있는 10cm 접시를 놓습니다.
    4. 각 우물에서 토론 F-127 솔루션을 흡인. PDMS는 다공성이며 특히 플레이트가 원심분리기로 회전하는 경우, 플라우론 F-127 용액을 흡수할 것입니다. 잔류 플루론 F-127 솔루션을 허용하고 우물이 5 분 동안 앉아 있게함으로써 우물의 바닥에 정착 한 다음 다시 흡인하십시오.
      참고: P1250 팁이 부착된 파스퇴 파이펫과 P1250 팁 위에 p200 팁을 사용하면 푸론 F-127 용액을 흡입할 때. 이렇게 하면 포스트 구조의 우발적인 포부를 방지하기 위한 정밀도가 향상됩니다. 이 플루론 F-127 코팅을 방해하고 hMMT 자기 조직 과정을 방해로 파이펫과 우물의 하단에 타원형 수영장 모양의 셀 파종 영역을 긁어 하지 마십시오. 적절한 기술은 피펫 팁을 타원형 수영장 바로 위에 마우스로 가져가는 동시에 Pluronic F-127 용액을 경각시하는 것입니다.
    5. 튜브의 바닥에 침몰 할 수있는 모든 세포를 재일시 중단하기 위해 조심스럽게 세포-ECM 현탁액을 피펫. 그런 다음 셀-ECM 서스펜션 105 μL을 신선하고 미리 냉각된 1.5mL 튜브로 옮춥니다. 용액이 온난화되는 것을 방지하기 위해 튜브를 상단에 가까이 파악하십시오.
    6. 105 μL 세포-ECM 서스펜션에 100 U/mL 혈전 재고 용액의 0.84 μL을 추가하여 0.2 U/mg의 피브리노겐 농도에 도달합니다. 피펫은 거품의 도입을 피하면서, 신속하고 철저하게 혼합합니다.
      참고: Thrombin은 피브린 응고로 피브리노겐의 급속한 변환을 시작합니다. 이와 같이, 혈소판 첨가 시 조직을 시드하는 데 시간이 제한되어 있다. 세포-ECM 혼합물이 배양 우물로 옮겨지기 전에 조기 응고를 피하려면, 혈전을 첨가하기 전에 p20 파이펫을 15 μL로 설정한다. 미리 차가운 팁을 사용하거나 파이펫 팁을 얼음 차가운 DMEM에 몇 초 동안 담근 후 셀-ECM 혼합물의 15 μL을 각 우물로 수집하고 전달합니다. 세포-ECM 혼합물 알리쿼트(aliquots)를 한 번에 6hMMT 이하로 절제하는 것이 가장 좋습니다.
    7. 조직을 시드하려면 각 개별에 세포-ECM 혼합물(즉, 150,000개의 세포)의 15μL을 추가합니다. 조심스럽게 타원형 풀의 중심에 셀-ECM 혼합물을 추가하고 우물의 바닥에 파이펫 팁을 누르는 것을 피하십시오. 그런 다음 두 번의 가벼운 움직임으로 각 포스트 뒤에 셀 서스펜션을 잘 퍼집니다. 표면이 셀-ECM 서스펜션에 고르게 코팅되면 다음 우물로 이동합니다.
      참고: 모든 조직이 시드되기 전에 튜브내 세포-ECM 혼합물의 조기 겔화를 피하기 위해 효율적으로 작업하십시오. 우물을 파종할 때 거품이 hMMT의 리모델링을 방해하므로 거품이 전송되지 않도록 하는 것이 매우 중요하며 hMMT를 사용할 수 없게 됩니다.
    8. 시드 유정을 함유한 10cm 배양판에 뚜껑을 놓고 37°C 조직 배양 배양인으로 약 5분 동안 이송한다.
      참고: 잔류 세포-ECM 혼합물을 가진 미세원심분리기 튜브를 인큐베이터에 넣어 겔 중합 공정의 확인으로 놓는다.
    9. 세포-ECM 혼합물이 중합된 후, 각 MyoTACTIC에 미리 워진 hMMT 파종 매체의 200 μL을 잘 추가한다. 10cm 접시의 뚜껑을 교체하고 10cm 접시 안에 있는 MyoTACTIC 플레이트 부분을 인큐베이터로 되돌려 놓습니다. 이 시간 지점을 Day -2라고 합니다. 다음 단계까지 조직을 방해하지 마십시오.
  4. hMMT 차별화
    1. 인큐베이션 2일 후, 파이펫을 사용하여 hMMT 파종 매체를 조심스럽게 제거하고 2% 말 혈청, 1% 펜/스트렙, 4% ACA(즉, 50 mg/mL의 재고 농도에서 2 mg/mL 최종 농도)를 포함하는 예동전분암분암200 μL로 교체하고, 10mg/mL의 주식 농도로부터 2mg/mL 최종 농도를 v/v/mL로 표현하였다. 이 시점은 분화의 0일이라고 합니다.
    2. 그 후 매일, 12일까지 신선한 차별화 매체와 미디어의 절반을 교환, 문화의 마지막 날(그림 2a).
      참고: 기본 인간 myoblasts를 사용하여 hMMT를 조작하는 프로토콜 세부 사항은 다른 곳에서 게시되었습니다30. 세포 생존 가능성에 대한 우려가있는 경우, 칼신과 프로스티움 요오드hhMMT를 배양하여 생존 가능성을 정량화하십시오.

4. hMMT 유도 포스트 편향의 전기 자극 및 분석

  1. 반전 된 현미경에 투명 바닥 유리 또는 플라스틱 무대 마운트를 설정하고 현미경 카메라 마운트를 사용하여 현미경 접안렌즈에 스마트 폰 카메라를 부착합니다. 10x 배율에서 위상 대비 현미경 검사가 사용될것이다(도 3a).
    참고: 10배배율 목표를 가진 반전된 위상 대비 현미경이 적절할 것입니다. PDMS 웰 컨스트럭처는 10cm 접시에서 제거되어 투명한 바닥 단면 마운트에 직접 배치되므로 공기에 개방됩니다. 70%의 에탄올로 모든 표면과 장비를 소독하고 실험 중에 해당 지역의 교통을 최소화합니다.
  2. 전기 자극 전극을 준비하려면 주석 코팅 구리 와이어의 ~30cm를 잘라냅니다. 그런 다음, 25 G 일반 베벨 바늘의 허브에서 시작하여 와이어의 ~10cm를 상단 절반 주위에 단단히 감싸서 ~ 20cm의 초과 와이어를 남깁니다. 두 번째 바늘을 반복한 다음 각 바늘에서 허브를 잘라냅니다.
    참고: 전선이 바늘 주위로 단단해야 이동하지 않도록 하고 전극의 와이어 래핑 부분은 전기장 생성을 방해할 수 있으므로 PDMS를 만지지 않아야 합니다.
  3. BNC를 앨리게이터 클립 커넥터 케이블에 파형 발전기의 출력 채널에 연결하고 20%의 듀티 사이클, 5 V 진폭(10V/cm의 전기장 강도)으로 제곱 펄스 채널을 설정합니다. 주파수는 각각 트위치와 파상풍 수축에 대해 0.5Hz에서 20Hz 사이로 변경됩니다.
    참고: 파형 생성기 설정에는 실험별 최적화가 필요할 수 있습니다.
  4. 현미경 단계에 hMMT를 함유한 MyoTACTIC 플레이트 부분을 배치하고 타원형 풀의 각 포스트 바로 뒤에 각 전극 베벨 끝을 PDMS에 부드럽게 삽입합니다. 바늘이 수직으로 유지되도록 현미경 단계에 초과 와이어의 20cm 섹션을 신중하게 테이프로 테이프각 와이어의 ~10cm연결무료남아(그림 3a).
    주의: 전극의 양쪽 끝에 맨손가락을 두지 마십시오. 검지 손가락에 굴무를 착용하여 PDMS에 삽입시 전극에 가벼운 압력을 가해야 합니다.
  5. 전극에 가장 가까운 포스트 엣지에 초점을 맞추는 두 개의 게시물 중 하나에 현미경 시야를 집중시다. 그런 다음 스마트폰 카메라 포커스를 게시물의 가장 명확한 영역에 잠급니다. 이는 다운스트림 분석에 중요하며 기록은 분석을 방해할 수 있습니다.
  6. 악어 클램프(도3a)를통해 테이핑된 와이어의 프리 엔드를 파형 발생기에 연결합니다.
  7. 스마트폰 카메라에서 비디오 녹화를 시작한 다음 채널 출력을 켜서 자극을 시작합니다. hMMT를 유도하여 트위치와 파상풍 자극 시리즈 사이에 2분 간 나머지 3개의 트위치와 파상풍 수축을 겪게 한다.
  8. 채널 출력을 끄고, 주석 코팅 된 구리 와이어에서 악어 클립을 분리하고, 전선에서 테이프를 제거하고, 후속 hMMT 우물에 삽입하기 전에 70 % 에탄올로 각 전극을 닦으십시오. 모든 hMMT에 대해 4.5 단계에서 절차를 반복합니다.
    참고: hMMT가 한 번에 3개 이하의 조직을 자극하여 인큐베이터 외부에서 보내는 시간을 제한합니다. MyoTACTIC 플레이트 부분 내의 추가 hMMT가 분석될 경우, 플레이트를 10분 동안 인큐베이터로 돌려보내 hMMT가 37°C로 복귀할 수 있도록 한다.
  9. hMMT 힘 생성을 계산할 수 있도록 포스트 편향을 분석하려면 GitHub(https://github.com/gilbertlabcode/myoTACTIC)에서 사용할 수 있는 사용자 지정 스크립트를 사용합니다. README.md 지침에 따라 스크립트를 설정하고 실행한 다음 각 게시물 추적 비디오를 열어 힘 분석을 수행합니다.
  10. 포스트 모서리를 따라 관심 영역(ROI)을 선택하여 사후 변위를 추적합니다. ENTER를 눌러 ROI를 확인하고 다시 Enter를 눌러 스크립트를 실행합니다(추가비디오 1).
    참고: 큰 편향으로 인해 트래커가 실패합니다. 수축 중에 트래커가 실패하면 ROI 크기를 늘려 추적에 덜 민감하지만 큰 편향 추적을 허용할 수 있습니다. 코드에 세 가지 크기가 제공되며 스크립트 주석을 조정하여 조정할 수 있습니다.
  11. 스크립트는 두 가지 입력 요구 사항으로 끝납니다. 먼저 y를 입력하여 비디오에 여러 수축이 포함되어 있는지 확인합니다. 둘째, 결과를 내보내기 위해 y(예) 또는 n(아니오)을 입력합니다. CSV 파일(보충 비디오 1).
  12. 포스트 편향 결과가 각 수축에 대해 픽셀단위로 변위로 보고되는지 확인합니다. 현미경 10배배율 설정에 대한 픽셀값을 μm 값으로 변환합니다. 이어서, 미전술제작30에사용되는 PDMS의 1:15 경화제대로부터 단량제에 해당하는 2.36 μN/μm의 강제 변위 변환 계수에 의해 값(μm)을 곱하여 포스트 변위 수를 절대 수축력(μN)으로 변환한다.

5. 전기 자극을 이용한 칼슘 과도 분석

참고: 칼슘 취급 실험의 경우, 불멸의 myoblasts는 이전에 설명된 바와 같이 MHCK7-GCAMP6 기자와 안정적으로 변형되었다11,12. 트랜스포밍 된 세포는 양성 인구를 얻기 위해 GFP를 위해 분류 된 FACS가 hMMT를 조작하는 데 사용되었습니다. 후라-2 AM 및 Indo-1 과 같은 비율 메트릭 염료를 사용하는 것과 같은 칼슘 이미징을 위한 대체 방법 또는 칼슘 지표의 형광 평생 이미징(예: 플루오-4 또는 오리건 그린 BAPTA1)은 우리 시스템에 적합할 수 있습니다.

  1. 앞서 설명한 바와 같이 현미경 단계 및 자극 장비(전극, 파형 발생기 등)를 설정하여 4단계에서 설명하였다. 이 실험의 경우 4배 배율을 사용합니다.
    참고: CCD 카메라가 장착된 어두운 방과 피형성 현미경이 필요합니다.
  2. 현미경 이미징 소프트웨어를 실행하고 FITC 필터 채널(블루라이트)을 선택하고 영화 녹화 기능을선택합니다. 500 ms의 노출과 680 x 510 (Binning 2x2)의 해상도로 설정합니다.
    참고: 이미징 소프트웨어는 다를 수 있으며 노출은 사용자가 수동으로 설정합니다. 자극 전에 노출에 hMMT를 피하기 위해주의하십시오. 휴식 시, 명확한 조직 이미지가 노출을 통해 있는 동안 자발적인 형광을 가진 어두운 조직 윤곽/그림자는 정상입니다(보충 비디오 2). 실험 내의 모든 hMMT에 대한 노출이 일관되지 않도록 합니다.
  3. 현미경 셔터를 닫고 칼슘 처리를 기록 할 준비가 될 때까지 FITC 채널을 차단하십시오.
  4. 모든 장비와 소프트웨어가 설정되면 hMMT가 함유된 MyoTACTIC 플레이트 부분을 검색하여 현미경 단계에서 직접 설정합니다. 그런 다음 4단계에서 이전에 설명한 대로 전극을 삽입하고 연결합니다.
  5. 밝은 필드를 사용하여 선택한 hMMT의 중앙에 뷰 필드를 집중합니다. 그런 다음 램프를 끕니다.
  6. 현미경 FITC 채널 셔터를 열고 파란색 표시등이 켜져 있는지 확인한 다음 소프트웨어에서 무비 레코드를 선택합니다.
  7. 파형 생성기의 출력을 켜서 전기 자극을 시작합니다. hMMT를 유도하여 8개의 트위치와 8개의 파상풍 수축을 겪게 한다. FITC 셔터가 닫힌 위치에 있는 동안 트위치와 파상풍 자극 시리즈 사이에 2분 간 휴식을 허용합니다.
    참고: 전기 자극 전후에 10분의 자발적인 활동을 허용하여 계산 및 데이터 분석 목적으로 최소 형광을 기록합니다.
  8. 채널 출력을 끄고, 주석 코팅 된 구리 와이어에서 악어 클립을 분리하고, 전선에서 테이프를 제거하고, 후속 hMMT 우물에 삽입하기 전에 70 % 에탄올로 각 전극을 닦으십시오. 모든 hMMT에 대한 반복 자극 및 기록 절차를 반복합니다.
  9. ImageJ 또는 대체 이미징 소프트웨어에서 분석을 위해 TIFF 파일 형식으로 동영상을 저장합니다.
    참고: hMMT가 한 번에 3개 이하의 조직을 자극하여 인큐베이터 외부에서 보내는 시간을 제한합니다. MyoTACTIC 플레이트 부분 내의 추가 hMMT가 분석될 경우, hMMT가 37°C로 복귀할 수 있도록 10분 동안 인큐베이터로 장치를 반환한다.
  10. 칼슘 과도 데이터를 분석하려면 먼저 ImageJ를 엽니다. 분석을선택한 다음 측정값을 설정한다음 평균 회색 값을 선택하고 다른 모든 옵션을 선택 해제합니다. 완료되면 칼슘(.tiff) 비디오를 엽니다(보조비디오 2).
  11. 다각형 선택 도구를 사용하여 미세 조직의 경계를 설명하고 ROI(보충 비디오2)로이 영역을 저장합니다. ROI 관리자 창에서 자세히 살펴보면 다중 측정값을 선택하고 슬라이스당 한 행의 모든 파일 슬라이스에 대한 형광 강도를 측정합니다(추가비디오 2).
  12. 슬라이스 번호(프레임)를 포함한 모든 측정값을 스프레드시트에 복사하고 각 슬라이스의 형광 강도를 ΔF/F0 =(F직전 - F최소)/F최소(보조 비디오2)를사용하여 파일의 최소 자발적 형광 강도와 비교합니다.
  13. 동영상 기록 프레임 속도를 슬라이스 수(프레임)로 곱하여 각 프레임의 시간을 계산하고, 자극에 대한 hMMT 칼슘 과도 반응에 대한 시간에 대해 ΔF/F0을 플롯한다(보조비디오 2).
  14. 각 hMMT(보충비디오 2)의상대평균 피크 형광 강도 변화를 계산하기 위해 6회 연속 수축 및 평균 값각각에 대해 최대 칼슘 과도 신호를 선택한다.
    참고: 첫 번째 트위치 수축에서 발생하는 데이터는 항상 전체 분석에서 제외합니다. hMMT 칼슘 과도 분석을 용이하게 하기 위해 GitHub(https://github.com/gilbertlabcode/Calcium-Handling-Template-)에 "칼슘 취급 템플릿.xlsx"이라는 제목의 스프레드시트가 제공되었습니다. 값과 입력을 입력할 필셀이 회색으로 강조 표시됩니다. 피크 선택(보충 비디오 2)에도움이되는 가이드이기 때문에 피크 선택 번호를 조정해야합니다.

결과

여기에 설명된 방법은 PU 금형으로부터 96웰 PDMS 기반 MyoTACTIC 배양 플랫폼을 캐스팅하고, hMMT 복제 조직의 배열을 제조하고, 배양 장치-힘 생성 및 칼슘 취급 내의 hMMT 기능의 두 가지 측면을 분석하는 방법이다. 도 1은 hMMT 시드 전에 근로식 문화 우물의 준비에 대한 회로도 개요를 제공합니다. PDMS는 널리 사용되는 실리콘 계 폴리머로, 복잡한장치(32)를생성하...

토론

이 원고는 기본 근육 생물학, 질병 모델링 또는 후보 분자 테스트에 적용할 수 있는 3D hMMT 배양 모델을 제조하고 분석하는 방법을 설명합니다. MyoTACTIC 플랫폼은 비용 친화적이고 제조가 용이하며 골격 근육 미세 조직을 생산하기 위해 상대적으로 적은 수의 세포가 필요합니다. 근로전술 배양 플랫폼 내에 형성된 hMMT는 정렬, 다핵, 및 축소된 심포우로 구성되며, 수축을 유발하는 칼슘 과도를 시동?...

공개

저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.

감사의 말

우리는 모하마드 아프샤르, 하벤 아브라하, 모센 아프샤르-바쿠쉬리, 사데다부디에게 MyoTACTIC 문화 플랫폼의 발명에 기여하고 여기에 설명된 제조 및 분석 방법을 확립해 주셔서 감사합니다. HL은 오르간 온-칩 엔지니어링 및 기업가 정신 장학금 및 토론토 와일드캣 대학 졸업생 장학금의 자연 과학 및 공학 연구 위원회 (NSERC) 교육 프로그램에서 자금을 받았다. PMG는 내인성 수리에 있는 캐나다 연구 의자이고 재생 의학을 위한 온타리오 연구소, 줄기 세포 네트워크 및 디자인에 의하여 의학에서 이 연구 결과에 대한 지원을 수신했습니다, 캐나다 첫번째 연구 우수성 프로그램. 회로도 는 BioRender.com 함께 만들어졌습니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
0.9% Saline Solution, SterileHouse Brand101010 mL aliquots of the solution are made and stored at 4°C
25G NeedleBD, Medstore, University of Toronto2548-CABD305127
6-Aminocaproic Acid, ≥99% (titration), PowderSigma - AldrichA2504-100GA 50 mg / mL stock solution is generated by dissolving 5 mg of 6-aminocaproic acid powder in 100 mL of autoclaved, distilled water. The solution is vaccum filtered and 10 mL aliquots are stored at 4°C
6.35 mm ID TubingVWR60985-528
AB1167 Myoblast Cell LineInstitut de Myologie (Paris, France)
Arbitrary Waveform GeneratorRigolDG1022Z
Basement Membrane Extract (Geltrex)Thermo Fisher ScientificA14132-02Stored as aliquots of 50 µL or 100 µL at -80°C
Benchtop Vacuum ChamberSigma - AldrichD2672
BNC to Aligator Clip CableOrdered from Amazon
Culture PlasticsSarstedtIncludes culture plates, serological pipettes, etc
Dimethyl SulfoxideSigma - AldrichD8418-250ML
DPBS, Powder, No Calcium, No MagnesiumThermo Fisher Scientific21600069
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1X)Gibco11995-065This is a high glucose DMEM with L-glutamine and sodium pyruvate
Fetal Bovine SerumFisher Scientific10437028
Fibrinogen from Bovine PlasmaSigma - AldrichF8630-5GAliquots ranging from 7 - 10 mg of fibrinogen powder are made and stored at -20°C
Filtropur Syringe Filter, 0.22um Pore SizeSarstedt83.1826.001
Horse SerumGibco16050-122
Human Recombinant InsulinSigma - Aldrich91077CStock solution is 100X and made by dissolving 1 mg of human recombinant insulin in 1 mL of DMEM and 1 µL of NaOH 10N. Solution is filtered and stored as 1 mL aliquots at 4°C
Image Acquisition SoftwareOlympuscellSens Dimension
Image Processing SoftwareNational Institutes of HealthImageJ
Isotemp OvenThermo Fisher Scientific201
MicroscopeOlympusIX83
Microscope - Camera MountLabcamLabcam for iPhoneOrdered from Amazon
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)Gibco15140-122
Plastic Disposable Syringes, 1ccBD2606-309659
Plastic Disposable Syringes, 50ccBD2612-309653
Pluronic F-127, Powder, BioReagentSigma - AldrichP2443-250GA 5% stock solution of pluronic acid is made by dissolving 5 g of pluronic acid powder in 100 mL of chilled, autoclaved, distilled water. The solution is vaccum filtered and 10 mL aliquots are stored at 4°C
Polydimethylsiloxane (Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit)Dow4019862Kits are also available at Thermo Fisher Scientific, Sigma - Aldrich, etc.
Polyurethane Negative MoldIn House
Release AgentMann Release Technologies200
Rotary Vane Vacuum PumpEdwardsA65401906
ScalpelAlmedic, Medstore, University of Toronto2586-M36-0100
Single Edge Razor BladeVWR55411-050
Skeletal Muscle Cell Basal MediumPromocellC-2326030 mL aliquotes are generated and at stored at 4°C.
Skeletal Muscle Cell Growth Medium (Ready-to-use)PromocellC-2306042 mL aliquots are generated and stored at 4°C.
Smartphone (iPhone)AppleSE
Standard Duty Dry Vacuum PumpWelch2546B-01
Sterilization BagAlliance211-SCM2
ThimbleIgegeOrdered from Amazon
Thrombin from human plasmaSigma - AldrichT6884-250UN100 units of thrombin is dissolved in 1 mL of a 0.1% BSA solution. 10 µL aliquots are prepared and stored at - 20°C.
Tin coated copper wireArcoB8871K48Ordered from Amazon
Trypan Blue Solution, 0.4%Thermo Scientific15250061
Trypsin-EDTA, 0.25%Thermo FIsher Scientific25200072
Vacuum Chamber 2SP Bel-ArtF42027-0000

참고문헌

  1. Frontera, W. R., Ochala, J. Skeletal Muscle: A brief review of structure and function. Calcified Tissue International. 96 (3), 183-195 (2015).
  2. McGreevy, J. W., Hakim, C. H., McIntosh, M. A., Duan, D. Animal models of Duchenne muscular dystrophy: From basic mechanisms to gene therapy. DMM Disease Models and Mechanisms. 8 (3), 195-213 (2015).
  3. Young, J., et al. MyoScreen, a high-throughput phenotypic screening platform enabling muscle drug discovery. SLAS Discovery. 23 (8), 790-806 (2018).
  4. DiMasi, J. A., Hansen, R. W., Grabowski, H. G. The price of innovation: New estimates of drug development costs. Journal of Health Economics. 22 (2), 151-185 (2003).
  5. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
  6. Duval, K., et al. Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture. Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).
  7. Vandenburgh, H., et al. Drug-screening platform based on the contractility of tissue-engineered muscle. Muscle and Nerve. 37 (4), 438-447 (2008).
  8. Vandenburgh, H., et al. Automated drug screening with contractile muscle tissue engineered from dystrophic myoblasts. The FASEB Journal. 23 (10), 3325-3334 (2009).
  9. Kim, J. H., et al. 3D bioprinted human skeletal muscle constructs for muscle function restoration. Scientific Reports. 8 (1), 12307 (2018).
  10. Takahashi, H., Shimizu, T., Okano, T. Engineered human contractile myofiber sheets as a platform for studies of skeletal muscle physiology. Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).
  11. Afshar Bakooshli, M., et al. A 3D culture model of innervated human skeletal muscle enables studies of the adult neuromuscular junction. eLife. 8, 1-29 (2019).
  12. Madden, L., Juhas, M., Kraus, W. E., Truskey, G. A., Bursac, N. Bioengineered human myobundles mimic clinical responses of skeletal muscle to drugs. eLife. 2015 (4), 3-5 (2015).
  13. Urciuolo, A., et al. Engineering a 3D in vitro model of human skeletal muscle at the single fiber scale. PLoS One. 15 (5), 0232081 (2020).
  14. Cvetkovic, C., Rich, M. H., Raman, R., Kong, H., Bashir, R. A 3D-printed platform for modular neuromuscular motor units. Microsystems & Nanoengineering. 3 (1), 1-9 (2017).
  15. Shima, A., Morimoto, Y., Sweeney, H. L., Takeuchi, S. Three-dimensional contractile muscle tissue consisting of human skeletal myocyte cell line. Experimental Cell Research. 370 (1), 168-173 (2018).
  16. Capel, A. J., et al. Scalable 3D printed molds for human tissue engineered skeletal muscle. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 20 (2019).
  17. Gholobova, D., et al. Human tissue-engineered skeletal muscle: a novel 3D in vitro model for drug disposition and toxicity after intramuscular injection. Scientific Reports. 8 (1), 1-14 (2018).
  18. Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. Microphysiological 3D model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) from human iPS-derived muscle cells and optogenetic motor neurons. Science Advances. 4 (10), 5847 (2018).
  19. Rao, L., Qian, Y., Khodabukus, A., Ribar, T., Bursac, N. Engineering human pluripotent stem cells into a functional skeletal muscle tissue. Nature Communications. 9 (1), (2018).
  20. Maffioletti, S. M., et al. Three-dimensional human iPSC-derived artificial skeletal muscles model muscular dystrophies and enable multilineage tissue engineering. Cell Reports. 23 (3), 899-908 (2018).
  21. Chal, J., et al. Generation of human muscle fibers and satellite-like cells from human pluripotent stem cells in vitro. Nature Protocols. 11 (10), 1833-1850 (2016).
  22. Khodabukus, A., et al. Electrical stimulation increases hypertrophy and metabolic flux in tissue-engineered human skeletal muscle. Biomaterials. 198, 259-269 (2019).
  23. Nagashima, T., et al. In vitro model of human skeletal muscle tissues with contractility fabricated by immortalized human myogenic cells. Advanced Biosystems. , 2000121 (2020).
  24. Mills, R. J., et al. Development of a human skeletal micro muscle platform with pacing capabilities. Biomaterials. 198, 217-227 (2019).
  25. Legant, W. R., et al. Microfabricated tissue gauges to measure and manipulate forces from 3D microtissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (25), 10097-10102 (2009).
  26. Prüller, J., Mannhardt, I., Eschenhagen, T., Zammit, P. S., Figeac, N. Satellite cells delivered in their niche efficiently generate functional myotubes in three-dimensional cell culture. PLOS One. 13 (9), 0202574 (2018).
  27. Sakar, M. S., et al. Formation and optogenetic control of engineered 3D skeletal muscle bioactuators. Lab on a Chip. 12 (23), 4976-4985 (2012).
  28. Zhang, X., et al. A system to monitor statin-induced myopathy in individual engineered skeletal muscle myobundles. Lab on a Chip. 18 (18), 2787-2796 (2018).
  29. Rajabian, N., et al. Bioengineered skeletal muscle as a model of muscle aging and regeneration. Tissue Engineering Part A. 27 (1-2), 74-86 (2020).
  30. Afshar, M. E., et al. A 96-well culture platform enables longitudinal analyses of engineered human skeletal muscle microtissue strength. Scientific Reports. 10 (1), 6918 (2020).
  31. Mamchaoui, K., et al. Immortalized pathological human myoblasts: Towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders. Skeletal Muscle. 1 (1), 34 (2011).
  32. Halldorsson, S., Lucumi, E., Gómez-Sjöberg, R., Fleming, R. M. T. Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices. Biosensors and Bioelectronics. 63, 218-231 (2015).
  33. Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  34. Bakooshli, M. A., et al. A 3D model of human skeletal muscle innervated with stem cell-derived motor neurons enables epsilon-subunit targeted myasthenic syndrome studies. BioRxiv. , 275545 (2018).
  35. Vandenburgh, H. H., Karlisch, P., Farr, L. Maintenance of highly contractile tissue-cultured avian skeletal myotubes in collagen gel. Vitro Cellular & Developmental Biology. 24 (3), 166-174 (1988).
  36. Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (3), 1274-1278 (1979).
  37. Hinds, S., Bian, W., Dennis, R. G., Bursac, N. The role of extracellular matrix composition in structure and function of bioengineered skeletal muscle. Biomaterials. 32 (14), 3575-3583 (2011).

재인쇄 및 허가

JoVE'article의 텍스트 или 그림을 다시 사용하시려면 허가 살펴보기

허가 살펴보기

더 많은 기사 탐색

1683

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

개인 정보 보호

이용 약관

정책

연락처

사서에게 추천하기

JoVE 뉴스레터

연구

교육

저자

사서

JoVE 소개

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. 판권 소유