Preparación de homogeneizados del músculo esquelético de rata para mediciones de nitratos y nitritos

Resumen

Presentamos protocolos para tres métodos diferentes para la homogeneización de cuatro grupos musculares diferentes de tejido muscular esquelético de rata para medir y comparar los niveles de nitrato y nitrito. Además, comparamos diferentes pesos de muestra para investigar si el tamaño de la muestra de tejido afecta los resultados de la homogeneización.

Resumen

Alguna vez se pensó que los iones de nitrato (NO₃^-) eran productos finales inertes del metabolismo del óxido nítrico (NO). Sin embargo, estudios previos demostraron que los iones de nitrato pueden convertirse de nuevo en NO en mamíferos a través de un mecanismo de reducción de dos pasos: el nitrato se reduce a nitrito (NO₂^-) principalmente por bacterias comensales orales, luego el nitrito se reduce a NO por varios mecanismos, incluso a través de proteínas que contienen hemo o molibdeno. Esta vía reductora del nitrato contribuye a mejorar las vías de señalización mediadas por NO, particularmente en el sistema cardiovascular y durante el ejercicio muscular. Los niveles de nitrato en el cuerpo antes de tal utilización están determinados por dos fuentes diferentes: oxidación endógena de NO y la ingesta de nitrato en la dieta, principalmente de plantas. Para dilucidar el ciclo complejo de NO en circunstancias fisiológicas, hemos examinado más a fondo la dinámica de sus metabolitos, iones de nitrato y nitrito, que son relativamente estables en comparación con NO. En estudios previos se identificó el músculo esquelético como un importante órgano de almacenamiento de iones de nitrato en mamíferos, así como una fuente directa de NO durante el ejercicio. Por lo tanto, establecer una metodología confiable para medir los niveles de nitrato y nitrito en el músculo esquelético es importante y debería ser útil para extender su aplicación a otras muestras de tejido. Este artículo explica en detalle la preparación de muestras de músculo esquelético, utilizando tres métodos de homogeneización diferentes, para mediciones de nitratos y nitritos y discute cuestiones importantes relacionadas con los procesos de homogeneización, incluido el tamaño de las muestras. Las concentraciones de nitrato y nitrito también se han comparado en cuatro grupos musculares diferentes.

Introducción

El óxido nítrico (NO), una pequeña molécula de señalización gaseosa, desempeña un papel crítico en los procesos fisiológicos y fisiopatológicos¹. El NO puede ser producido a partir de L-arginina por enzimas endógenas de la familia de la óxido nítrico sintasa (NOS) antes de someterse a una rápida oxidación a nitrato (NO 3-) y, posiblemente, nitrito (_NO2^-) en sangre y tejidos ^2,3. Recientemente, se ha demostrado que estos aniones se reducen de nuevo a NO en los sistemas de mamíferos⁴. El nitrato se convierte en nitrito, principalmente por nitrato reductasas bacterianas comensales en la cavidad oral que actúan sobre iones secretados por las glándulas salivales e ingeridos directamente ⁵, y en cierta medida, por enzimas de mamíferos como la xantina oxidorreductasa ^6,7. El nitrito puede reducirse aún más a NO por varios mecanismos, incluyendo la desoxihemoglobina⁸, la desoximioglobina⁹, las enzimas que contienen molibdeno 10 y la reducción no enzimática en presencia de protones^11,12.

Esta vía nitrato-nitrito-NO se mejora en condiciones hipóxicas en las que la actividad de NOS disminuye porque NOS requiere oxígeno para la generación^{de NO 4}. Muchos estudios recientes han reportado efectos beneficiosos del nitrato dietético sobre la regulación de la presión arterial y el rendimiento del ejercicio, sugiriendo que las vías de reducción de nitrato contribuyen al aumento de la señalización de NO^13,14,15. Estudios previos han demostrado que algunos músculos esqueléticos son probablemente los principales lugares de almacenamiento de nitrato en el cuerpo¹⁶. En comparación con la sangre u otros órganos internos como el hígado, el músculo esquelético (glúteo mayor) contiene niveles significativamente más altos de nitrato y tiene una masa sustancial en el cuerpo de los mamíferos. Se demostró que el ejercicio en cinta rodante mejora la reducción de nitratos a nitrito y NO en glúteos en un modelo de rata⁷. Estos resultados implican que algunos músculos esqueléticos podrían ser fuentes importantes de NO a través de vías de reducción de nitratos en situaciones fisiológicas. Estudios más recientes sugieren que estos hallazgos, incluyendo cambios en los niveles de nitrato muscular durante el ejercicio, también ocurren en humanos¹⁷.

Dos de los autores actuales habían establecido previamente un método para medir los niveles de nitrato y nitrito en muestras de sangre y otros líquidos¹⁸. Sin embargo, cuando se analizaron inicialmente los niveles de estos aniones en homogeneizados tisulares, no se disponía de protocolos detallados. Para comprender la dinámica nitrato-nitrito-NO en varios órganos diferentes, nuestro objetivo era desarrollar un método preciso y eficiente para medir los niveles de nitrato y nitrito en tejidos de mamíferos, incluido el músculo esquelético. En estudios anteriores, los tejidos de roedores fueron utilizados para desarrollar procesos de homogeneización confiables y luego analizar el contenido de nitrato y nitrito en esos homogeneizados 7,16,19. El uso de este método de homogeneización se extendió a muestras de biopsia de músculo esquelético humano, por lo que los valores fueron confirmados, y es importante destacar que los valores observados para el músculo en comparación con la sangre / plasma estaban en rangos y proporciones similares a los observados en roedores¹⁷. En los últimos años, otros grupos también comenzaron a medir los niveles de nitrato y nitrito en homogeneizados del músculo esquelético, reportando valores comparables a los reportados por nuestro grupo^20,21.

El objetivo de este documento de protocolo es describir en detalle la preparación de homogeneizados del músculo esquelético utilizando tres métodos de homogeneización diferentes para la medición posterior de los niveles de nitrato y nitrito. Además, se examinaron los efectos del peso del tejido utilizado para la homogeneización sobre los valores de nitrato y nitrito en muestras de músculo esquelético. Creemos que estos métodos se pueden aplicar fácilmente a otros tipos de tejidos de mamíferos. Recientemente, especialmente en el campo de la fisiología del ejercicio, se había prestado atención a las posibles diferencias en la fisiología de nitrato/nitrito/NO según los grupos musculares. También informamos las cantidades de nitrato y nitrito en cuatro músculos roedores diferentes y encontramos una distribución no uniforme de ambos iones entre estos músculos diferentes; una observación que requiere más estudio.

Protocolo

El protocolo animal fue aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales del NIDDK (ASP K049-MMB-20). Los animales fueron manejados y tratados de acuerdo con la Guía actual para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio disponible gratuitamente en el sitio web de AAALAC.

1. Colección de músculo esquelético de rata

1. Mientras una rata está bajo anestesia profunda (isoflurano al 5%, confirmado por la ausencia de reacción al pellizco de la cola / pierna), comience la perfusión con solución salina que contenga heparina colocando una aguja de 19 G en un ápice del ventrículo izquierdo y haciendo un corte en la aurícula derecha. Permita que la solución salina con heparina perfunda a través de los órganos internos hasta que al menos 1,5 litros/kg hayan fluido a través del tejido. En este punto, los animales están muertos por exsanguinación y los cadáveres están listos para ser procesados para la recolección de muestras.
   NOTA: Lograr una buena perfusión es crítico, especialmente para mediciones precisas de nitrito, porque el nitrito se oxida en nitrato por cualquier hemoglobina restante.
2. Identificar los tejidos musculares objetivo y extirparlos de las patas traseras²² utilizando instrumentos quirúrgicos limpios. Retire tanta grasa y tejidos conectivos de los tejidos musculares como sea posible.
3. Coloque la cantidad deseada de músculo en un tubo de microcentrífuga y luego colóquela en hielo seco. Guarde los tubos llenos de pañuelos de papel en el congelador a -80 °C.
   NOTA: En el caso de muestras de biopsia humana, séquelas completamente inmediatamente después de la recolección con una gasa limpia para eliminar el exceso de sangre.

2. Preparación para la homogeneización

1. Preparación de solución conservadora de nitrito (solución de parada)
   1. Preparar una solución amarilla transparente que contenga 890 mM de ferricianuro de potasio (K₃Fe(CN)₆) y 118 mM de NEM (N-etilmaleimida) en agua destilada, asegurándose de que no haya cristales. Agregue surfactante no iónico (detergente) en una proporción de 1: 9 (v / v, Tabla de materiales) y mezcle suavemente para evitar la formación de espuma.
   2. Diluir la solución de parada en una proporción de 1:9 con agua destilada. Coloque la solución de parada diluida (proporción 1:5 de tejido muscular a solución de parada diluida) en el tubo de homogeneización.
      NOTA: Veinte miligramos de tejido requerirán 100 μL de solución de parada, y 200 mg de tejido requerirán 1000 μL de solución de parada en el tubo. La presencia de detergente en la solución añadida es crítica para la interrupción de las membranas celulares. Se puede usar cualquier detergente no iónico, pero se debe tener cuidado para verificar que no interfiera con el método de quimioluminiscencia.
2. Preparación de tejidos
   1. Saque el tejido del congelador a -80 °C y descongele lentamente en hielo. Retire la grasa restante y el tejido conectivo del músculo esquelético. Corte los trozos de músculo esquelético y seque la gasa para que se seque.
   2. Pese la cantidad de tejido (20, 50 y 200 mg). Coloque el músculo esquelético previamente pesado en la solución de parada en los tubos de homogeneización o coloque el tejido prepesado en un tubo de microcentrífuga limpio para su uso posterior.

3. Homogeneización

1. Homogeneizador rotativo (Figura 1)
   1. Coloque el tubo tipo M que contiene el músculo esquelético previamente pesado y la solución de parada premedida en la máquina. Homogeneice cada muestra dos veces (fijando en el ciclo de homogeneización más destructivo) y coloque el tubo en hielo inmediatamente después de cada homogeneización durante 5 minutos para que se enfríe.
   2. Centrifugar brevemente a 2.000 × g y 4 °C durante 5 min. Vuelva a colocar el tubo lleno sobre hielo y añada el volumen adecuado de metanol (≥ 99,9 %, 10 veces el peso del tejido). Vórtice a fondo durante 15 s.
      NOTA: Para 20 mg de tejido, utilice 200 μL de metanol. El metanol se utiliza para precipitar proteínas del homogeneizado tisular y no interfiere con el método de quimioluminiscencia. Si se utiliza otro método de precipitación de proteínas, pruebe su compatibilidad con la quimioluminiscencia.
   3. Homogeneizar una vez más e incubar en hielo durante 30 min. Centrifugar las muestras durante 35 min a 4 °C y 3.500 × g. Aspirar el sobrenadante y medir los niveles de nitrito/nitrato, o almacenar a -80 °C para su uso posterior.
2. Homogeneizador de cuentas (Figura 2)
   1. Coloque el tejido muscular esquelético en un tubo que contenga perlas (proporción 1:5 para tejido: solución de parada diluida) y homogeneice dos veces durante 45 s a la velocidad más alta disponible en el instrumento utilizado. Coloque el tubo en hielo inmediatamente después de cada homogeneización durante 5 minutos para que se enfríe.
   2. Centrifugar brevemente con una centrífuga de escritorio pequeña (2.000 x g) durante 5 segundos. Vuelva a colocar el tubo sobre hielo y añadir un volumen adecuado de metanol (pureza ≥ 99,9 %, 10 veces el peso del tejido). Vórtice a fondo durante 15 s.
      NOTA 1: Para 20 mg de tejido, utilizar 200 μL de metanol.
      NOTA 2: El metanol se utiliza para precipitar proteínas del homogeneizado tisular y no interfiere con el método de quimioluminiscencia. Si se utiliza otro método de precipitación de proteínas, pruebe su compatibilidad con la quimioluminiscencia.
   3. Homogeneizar una vez más durante 45 s a la velocidad más alta disponible en el instrumento utilizado. Incubar en hielo durante 30 min. Centrífuga a 17.000 x g, 4 °C, 30 min. Aspirar el sobrenadante y medir los niveles de nitrito/nitrato, o almacenar a -80 °C para su uso posterior.
3. Pulverizador (Figura 3)
   1. Prepare tubos que contengan solución de parada diluida (5 veces el peso del tejido) y péselos. Registre el peso (tubo + solución de parada).
   2. Coloque la herramienta pulverizadora de nitrógeno líquido en hielo seco y espere aproximadamente 30 minutos para que alcance la temperatura deseada.
   3. Usando pinzas enfriadas en nitrógeno líquido, transfiera una muestra (el peso del tejido ya se ha medido) al pulverizador. Agregue una cucharada pequeña de nitrógeno líquido para asegurarse de que el tejido esté a temperatura de nitrógeno líquido.
   4. Después de que el 95% del nitrógeno líquido se haya vaporizado, coloque la herramienta de trituración sobre el tejido y presione firmemente. Deberías sentir el aplastamiento de la muestra. Usando el mazo, golpee la herramienta de trituración 3-5x.
   5. Revise la muestra en busca de trozos restantes con una cuchara enfriada en nitrógeno líquido. Después de enfriar en nitrógeno líquido, use un pedazo de papel de seda para limpiar el agua congelada antes de tocar el pañuelo. Si hay un trozo presente, muévalo hacia el centro y luego golpea 5-6 veces más con el mazo.
   6. Cuando se haya pulverizado toda la muestra, utilizar la cuchara líquida refrigerada por nitrógeno para transferir directamente el tejido triturado al tubo previamente pesado que contiene la solución de parada diluida (paso 3.3.1). Asegúrese de realizar este paso rápidamente, ya que cuando el músculo esquelético aplastado se calienta, se vuelve pegajoso y difícil de transferir.
   7. Vórtice durante 15 s. Verifique que no haya tejido atascado en la parte superior del tubo abriendo el tubo. Si lo hay, trate de desalojarlo y luego vuelva a vomarcar.
   8. Centrifugar la muestra durante 2-3 s utilizando una pequeña centrífuga de escritorio. Vuelva a pesar el tubo. Calcule el peso del tejido deduciendo el peso original del tubo (paso 3.3.1) de este nuevo peso. Coloque el tubo sobre hielo.
      NOTA: Los pesos exactos ayudarán a determinar el peso exacto del tejido y la cantidad de tejido que se perdió durante la pulverización.
   9. Una vez que todas las muestras hayan sido procesadas hasta el paso 3.3.8, añadir un volumen adecuado de metanol (≥ 99,9 %, 10 veces el peso del tejido). Vortex a fondo durante 15 s, e incubar en hielo durante 30 min.
      NOTA: Para 20 mg de tejido, utilice 200 μL de metanol. El metanol se utiliza para precipitar proteínas del homogeneizado tisular y no interfiere con el método de quimioluminiscencia. Si se utiliza otro método de precipitación de proteínas, pruebe su compatibilidad con la quimioluminiscencia.
   10. Centrífuga a 17.000 × g, 4 °C, 30 min. Aspirar el sobrenadante y medir los niveles de nitrito/nitrato, o almacenar a -80 °C para su uso posterior.

4. Medición de nitrito/nitrato con analizador de óxido nítrico (NOA)

1. Prepare todas las muestras mediante cualquiera de los tres métodos de homogeneización descritos anteriormente e inyéctelas en un NOA para la medición de nitratos y nitritos.
   NOTA: Los protocolos detallados para el uso de NOA se publicaron anteriormente¹⁹.

Resultados

Para obtener resultados representativos, se utilizaron tejidos del músculo esquelético de 8 ratas Wistar (machos y hembras, peso 250 ± 50 g). Los homogeneizados del músculo esquelético de rata (50 mg de músculo glúteo mayor para cada método) se prepararon mediante tres herramientas de homogeneización diferentes (homogeneizador rotativo, homogeneizador de perlas y pulverizador). Los contenidos de nitrato y nitrito de estos homogeneizados se determinaron utilizando un analizador de óxido nítrico (NOA) (

Discusión

Para monitorear los cambios en los metabolitos de NO, nitrato y nitrito, en función de las intervenciones fisiológicas, es imperativo medir los niveles de estos iones en los diferentes órganos que son críticos en su metabolismo. Como la hemoglobina en la sangre reaccionará con el NO y sus metabolitos, también es importante eliminar la sangre rápidamente de las muestras de tejido tanto como sea posible. Por lo tanto, los animales fueron perfundidos con solución salina antes de recolectar tejidos del músculo esque...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
gentleMACS dissociator	Miltenyi Biotec	130-093-235
gentle MACS M tube	Miltenyi Biotec	130-093-236	Length: 87 mm; Diameter: 30 mm
Heparin Sodium	Hospira	NDC-0409-7620-13
Isoflurane	Baxter	NDC-10019-360-60
Methanol	Sigma	646377
Minilys bead homogenizer	Bertin Instruments	P000673-MLYS0-A
NEM; N-ethylmaleimide	Sigma	4260
Nitric Oxide analyzer	GE	Sievers NOA 280i
NP-40; 4-Nonylphenylpolyethylene glycol	Sigma	74385
Potassium ferricyanide; K3Fe(CN)6	Sigma	702587
Precellys lysing kit	Bertin Instruments	P000911-LYSK0-A	contains 2 mL tubes with 2.8 mm ceramic (zirconium oxide) beads for homogenization
Pulverizer kit	Cellcrusher	Cellcrusher kit