Nitrat ve Nitrit Ölçümleri için Sıçan İskelet Kas Homojenatlarının Hazırlanması

Özet

Nitrat ve nitrit seviyelerini ölçmek ve karşılaştırmak için sıçan iskelet kası dokusunun dört farklı kas grubunun homojenizasyonu için üç farklı yöntem için protokoller sunuyoruz. Ayrıca, doku numune büyüklüğünün homojenizasyon sonuçlarını etkileyip etkilemediğini araştırmak için farklı numune ağırlıklarını karşılaştırıyoruz.

Özet

Nitrat iyonlarının (NO₃^-) bir zamanlar nitrik oksit (NO) metabolizmasının inert son ürünleri olduğu düşünülüyordu. Bununla birlikte, önceki çalışmalar, nitrat iyonlarının memelilerde iki aşamalı bir indirgeme mekanizması ile NO'ya geri dönüştürülebileceğini göstermiştir: nitrat, çoğunlukla oral kommensal bakteriler tarafından nitrite (NO₂^-) indirgenir, daha sonra nitrit, heme veya molibden içeren proteinler de dahil olmak üzere çeşitli mekanizmalar tarafından NO'ya indirgenir. Bu indirgeyici nitrat yolu, özellikle kardiyovasküler sistemde ve kas egzersizi sırasında NO-aracılı sinyal yolaklarının geliştirilmesine katkıda bulunur. Bu tür bir kullanımdan önce vücuttaki nitrat seviyeleri iki farklı kaynak tarafından belirlenir: endojen NO oksidasyonu ve diyet nitrat alımı, esas olarak bitkilerden. Fizyolojik koşullarda karmaşık NO döngüsünü aydınlatmak için, NO'ya kıyasla nispeten kararlı olan metabolitlerinin, nitrat ve nitrit iyonlarının dinamiklerini daha fazla inceledik. Önceki çalışmalarda iskelet kası, memelilerde nitrat iyonları için önemli bir depolama organı ve egzersiz sırasında doğrudan bir NO kaynağı olarak tanımlanmıştır. Bu nedenle, iskelet kasındaki nitrat ve nitrit seviyelerini ölçmek için güvenilir bir metodoloji oluşturmak önemlidir ve uygulamasının diğer doku örneklerine genişletilmesinde yardımcı olmalıdır. Bu yazıda, nitrat ve nitrit ölçümleri için üç farklı homojenizasyon yöntemi kullanılarak iskelet kası numunelerinin hazırlanması ayrıntılı olarak açıklanmakta ve numunelerin büyüklüğü de dahil olmak üzere homojenizasyon prosesleri ile ilgili önemli konular tartışılmaktadır. Nitrat ve nitrit konsantrasyonları da dört farklı kas grubunda karşılaştırılmıştır.

Giriş

Küçük bir gaz halindeki sinyal molekülü olan nitrik oksit (NO), fizyolojik ve patofizyolojik süreçlerde kritik bir rol oynar¹. NO, nitrik oksit sentaz (NOS) ailesinin endojen enzimleri tarafından L-arginin'den, nitrata (NO 3-) ve muhtemelen kandaki ve dokulardaki nitrite (NO 2^-) hızlı oksidasyona uğramadan önce üretilebilir ^2,3. Son zamanlarda, bu anyonların memeli sistemlerinde NO'ya geri indirgendiği gösterilmiştir⁴. Nitrat, esas olarak tükürük bezleri tarafından salgılanan ve doğrudan yutulan ^iyonlara etki eden ağız boşluğundaki kommensal bakteriyel nitrat redüktazları tarafından nitrite dönüştürülür 5 ve bir dereceye kadar ksantin oksidoredüktaz ^6,7 gibi memeli enzimleri tarafından. Nitrit, deoksihemoglobin⁸, deoksimiyoglobin⁹, molibden içeren enzimler^{10 ve proton 11,12} varlığında enzimatik olmayan indirgeme dahil olmak üzere çeşitli ^{mekanizmalarla} NO'ya daha da indirgenebilir.

Bu nitrat-nitrit-NO yolu, NOS aktivitesinin azaldığı hipoksik koşullar altında geliştirilir, çünkü NOS NO nesil⁴ için oksijen gerektirir. Son zamanlarda yapılan birçok çalışma, diyet nitratının kan basıncı regülasyonu ve egzersiz performansı üzerindeki yararlı etkilerini bildirmiştir, bu da nitrat azaltma yollarının NO sinyalinin ^13,14,15'in artmasına katkıda bulunduğunu düşündürmektedir. Önceki çalışmalar, bazı iskelet kaslarının muhtemelen vücuttaki başlıca nitrat depolama yerleri olduğunu göstermiştir¹⁶. Kan veya karaciğer gibi diğer iç organlarla karşılaştırıldığında, iskelet kası (gluteus maximus) önemli ölçüde daha yüksek nitrat seviyeleri içerir ve memeli vücudunda önemli bir kütleye sahiptir. Koşu bandı egzersizinin, bir sıçan modeli^7'de nitrite ve gluteustaki NO'ya nitrat indirgemesini arttırdığı gösterilmiştir. Bu sonuçlar, bazı iskelet kaslarının fizyolojik durumlarda nitrat indirgeme yolları yoluyla NO için önemli kaynaklar olabileceğini düşündürmektedir. Daha yeni çalışmalar, egzersiz sırasında kas nitrat seviyelerindeki değişiklikler de dahil olmak üzere bu bulguların insanlarda da meydana geldiğini göstermektedir¹⁷.

Mevcut yazarlardan ikisi daha önce kan ve diğer sıvı numunelerdeki nitrat ve nitrit seviyelerini ölçmek için bir yöntem oluşturmuştu¹⁸. Bununla birlikte, bu anyonların doku homojenatlarındaki seviyeleri başlangıçta analiz edildiğinde, ayrıntılı protokoller mevcut değildi. Birkaç farklı organdaki nitrat-nitrit-NO dinamiklerini anlamak için amacımız, iskelet kası da dahil olmak üzere memeli dokularındaki nitrat ve nitrit seviyelerini ölçmek için doğru ve verimli bir yöntem geliştirmekti. Daha önceki çalışmalarda, güvenilir homojenizasyon prosesleri geliştirmek ve daha sonra bu homojenatlardaki nitrat ve nitrit içeriğini analiz etmek için kemirgen dokuları kullanıldı 7,16,19. Bu homojenizasyon yönteminin kullanımı, değerlerin doğrulandığı insan iskelet kası biyopsi örneklerine genişletildi ve daha da önemlisi, kas için kan / plazmaya kıyasla gözlemlenen değerler, kemirgenlerde gözlenenlere benzer aralıklarda ve oranlarda idi¹⁷. Son yıllarda, diğer gruplar da iskelet kası homojenatlarındaki nitrat ve nitrit seviyelerini ölçmeye başladı ve grubumuz^20,21 tarafından bildirilenlerle karşılaştırılabilir değerler bildirdi.

Bu protokol belgesinin amacı, nitrat ve nitrit seviyelerinin daha sonraki ölçümleri için üç farklı homojenizasyon yöntemi kullanılarak iskelet kası homojenatlarının hazırlanmasını ayrıntılı olarak tanımlamaktır. Ayrıca homojenizasyon için kullanılan doku ağırlığının iskelet kası örneklerinde nitrat ve nitrit değerleri üzerindeki etkileri incelenmiştir. Bu yöntemlerin diğer memeli dokularına da rahatlıkla uygulanabileceğine inanıyoruz. Son yıllarda özellikle egzersiz fizyolojisi alanında kas gruplarına göre nitrat/nitrit/NO fizyolojisindeki olası farklılıklara dikkat çekilmiştir. Ayrıca dört farklı kemirgen kasındaki nitrat ve nitrit miktarlarını rapor ediyoruz ve her iki iyonun da bu farklı kaslar arasında eşit olmayan bir dağılımını buluyoruz; daha fazla çalışma gerektiren bir gözlem.

Protokol

Hayvan protokolü NIDDK Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (ASP K049-MMB-20) tarafından onaylanmıştır. Hayvanlar, AAALAC web sitesinde ücretsiz olarak bulunan mevcut Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzuna göre ele alınmış ve tedavi edilmiştir.

1. Sıçan iskelet kası toplama

1. Bir sıçan derin anestezi altındayken (% 5 izofluran, kuyruk / bacak sıkışmasına reaksiyon olmadan doğrulanır), sol ventrikülün tepesine 19 G'lik bir iğne yerleştirerek ve sağ atriyumda bir çentik yaparak heparin içeren salin ile perfüzyona başlayın. Heparinli salinin, dokudan en az 1,5 litre / kg akıncaya kadar iç organlardan nüfuz etmesine izin verin. Bu noktada, hayvanlar ekssanguinasyondan ölmüştür ve karkaslar numune toplama için işlenmeye hazırdır.
   NOT: İyi perfüzyon elde etmek, özellikle nitritin doğru ölçümleri için kritik öneme sahiptir, çünkü nitrit, kalan herhangi bir hemoglobin tarafından nitrata oksitlenir.
2. Hedef kas dokularını tanımlayın ve temiz cerrahi aletler kullanarak bunları arka bacaklardan²² çıkarın. Kas dokularından mümkün olduğunca fazla yağ ve bağ dokusu çıkarın.
3. İstenilen miktarda kası bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin ve ardından kuru buz üzerine yerleştirin. Doku ile doldurulmuş tüpleri -80 °C dondurucuda saklayın.
   NOT: İnsan biyopsi örnekleri durumunda, fazla kanı gidermek için temiz gazlı bezle toplandıktan hemen sonra iyice lekeleyin.

2. Homojenizasyon için hazırlık

1. Nitrit koruyucu çözeltinin hazırlanması (durdurma çözeltisi)
   1. Damıtılmış suda 890 mM potasyum ferrisiyanür (K₃Fe (CN)₆) ve 118 mM NEM (N-etilmaleimid) içeren berrak sarı bir çözelti hazırlayın ve kristal olmadığından emin olun. İyonik olmayan yüzey aktif maddeyi (deterjan) 1:9 oranında (v/v, Malzeme Tablosu) ekleyin ve köpüklenmeyi önlemek için hafifçe karıştırın.
   2. Durdurma çözeltisini damıtılmış su ile 1:9 oranında seyreltin. Seyreltilmiş durdurma çözeltisini (kas dokusunun seyreltilmiş durdurma çözeltisine 1:5 oranı) homojenizasyon tüpüne yerleştirin.
      NOT: Yirmi miligram doku 100 μL durdurma çözeltisi gerektirecek ve 200 mg doku tüpte 1000 μL durdurma çözeltisi gerektirecektir. Ek çözeltide deterjan varlığı, hücre zarlarının bozulması için kritik öneme sahiptir. İyonik olmayan herhangi bir deterjan kullanılabilir, ancak kemilüminesans yöntemine müdahale etmediğini doğrulamak için dikkatli olunmalıdır.
2. Doku hazırlama
   1. Dokuyu -80 °C dondurucudan çıkarın ve yavaşça buzda çözün. Kalan yağ ve bağ dokusunu iskelet kasından çıkarın. İskelet kası parçalarını kesin ve kuruması için gazlı bez üzerinde lekeleyin.
   2. Doku miktarını (20, 50 ve 200 mg) tartın. Önceden tartılmış iskelet kasını homojenizasyon tüplerindeki durdurma çözeltisine yerleştirin veya önceden tartılmış dokuyu daha sonra kullanmak üzere temiz bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin.

3. Homojenizasyon

1. Döner homojenizatör (Şekil 1)
   1. Önceden tartılmış iskelet kasını ve önceden ölçülmüş durdurma çözeltisini içeren M tipi tüpü makineye yerleştirin. Her numuneyi iki kez homojenize edin (en yıkıcı homojenizasyon döngüsüne göre ayarlayın) ve tüpü her homojenizasyondan hemen sonra soğuması için 5 dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin.
   2. 5 dakika boyunca 2.000 × g ve 4 °C'de kısaca santrifüj yapın. Tam tüpü tekrar buzun üzerine yerleştirin ve uygun miktarda metanol ekleyin (≥% 99.9, doku ağırlığının 10x'i). 15 s için iyice vorteks.
      NOT: 20 mg doku için 200 μL metanol kullanın. Metanol, proteinleri doku homojenatından çökeltmek için kullanılır ve kemilüminesans yöntemine müdahale etmez. Başka bir protein çökeltme yöntemi kullanılıyorsa, kemilüminesans ile uyumluluğunu test edin.
   3. Bir kez daha homojenize edin ve 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Numuneleri 4 °C'de 35 dakika ve 3.500 × g santrifüj yapın. Süper nantantı aspire edin ve nitrit / nitrat seviyelerini ölçün veya daha sonra kullanmak üzere -80 ° C'de saklayın.
2. Boncuk homojenizatörü (Şekil 2)
   1. İskelet kası dokusunu boncuk içeren bir tüpe yerleştirin (doku için 1:5 oranı: seyreltilmiş durdurma çözeltisi) ve kullanılan cihazda bulunan en yüksek hızda 45 s için iki kez homojenize edin. Her homojenizasyondan hemen sonra tüpü soğuması için 5 dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin.
   2. 5 saniye boyunca küçük bir masaüstü santrifüj (2.000 x g) kullanarak kısaca santrifüj. Tüpü tekrar buzun üzerine yerleştirin ve uygun miktarda metanol ekleyin (saflık ≥% 99.9, doku ağırlığının 10 katı). 15 s için iyice vorteks.
      NOT 1: 20 mg doku için 200 μL metanol kullanın.
      NOT 2: Metanol, proteinleri doku homojenatından çökeltmek için kullanılır ve kemilüminesans yöntemine müdahale etmez. Başka bir protein çökeltme yöntemi kullanılıyorsa, kemilüminesans ile uyumluluğunu test edin.
   3. Kullanılan cihazda bulunan en yüksek hızda 45 sn boyunca bir kez daha homojenize edin. 30 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın. 17.000 x g, 4 °C, 30 dk'da santrifüj. Süper nantantı aspire edin ve nitrit / nitrat seviyelerini ölçün veya daha sonra kullanmak üzere -80 ° C'de saklayın.
3. Pulverizatör (Şekil 3)
   1. Seyreltilmiş durdurma çözeltisi (doku ağırlığının 5 katı) içeren tüpler hazırlayın ve tartın. Ağırlığı kaydedin (tüp + durdurma çözümü).
   2. Sıvı azot öğütücü aletini kuru buz üzerine yerleştirin ve istenen sıcaklığa ulaşması için yaklaşık 30 dakika bekleyin.
   3. Sıvı azotla soğutulmuş cımbız kullanarak, bir numuneyi (zaten ölçülen doku ağırlığı) pulverizatöre aktarın. Dokunun sıvı azot sıcaklığında olduğundan emin olmak için küçük bir kaşık sıvı azot ekleyin.
   4. Sıvı azotun% 95'i buharlaştıktan sonra, kırma aletini dokunun üstüne yerleştirin ve sıkıca bastırın. Örnek ezilmesini hissetmelisiniz. Tokmak kullanarak, kırma aletine 3-5x vurun.
   5. Sıvı azotla soğutulmuş bir kaşık kullanarak kalan parçalar için numuneyi kontrol edin. Sıvı azotta soğuduktan sonra, mendile dokunmadan önce donmuş suyu silmek için bir parça kağıt mendil kullanın. Bir parça varsa, merkeze taşıyın ve ardından tokmakla 5-6 kez daha vurun.
   6. Tüm numune toz haline getirildiğinde, ezilmiş dokuyu seyreltilmiş durdurma çözeltisini içeren önceden tartılmış tüpe doğrudan aktarmak için sıvı azot soğutmalı kaşığı kullanın (adım 3.3.1). Bu adımı hızlı bir şekilde uyguladığınızdan emin olun, çünkü ezilmiş iskelet kası ısındığında, yapışkan hale gelir ve aktarılması zorlaşır.
   7. 15 s. için vorteks. Tüpü açarak tüpün üst kısmında hiçbir doku sıkışmadığını kontrol edin. Varsa, yerinden çıkarmayı deneyin ve sonra tekrar vorteks.
   8. Küçük bir masaüstü santrifüj kullanarak numuneyi 2-3 sn santrifüj ile santrifüj yapın. Tüpü tekrar tartın. Orijinal tüp ağırlığını (adım 3.3.1) bu yeni ağırlıktan düşerek doku ağırlığını hesaplayın. Tüpü buzun üzerine yerleştirin.
      NOT: Tam ağırlıklar, tam doku ağırlığını ve pulverizasyon sırasında ne kadar doku kaybedildiğini belirlemeye yardımcı olacaktır.
   9. Tüm numuneler adım 3.3.8'e kadar işlendikten sonra, uygun miktarda metanol ekleyin (≥% 99.9, doku ağırlığının 10 katı). 15 saniye boyunca iyice vorteks yapın ve 30 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın.
      NOT: 20 mg doku için 200 μL metanol kullanın. Metanol, proteinleri doku homojenatından çökeltmek için kullanılır ve kemilüminesans yöntemine müdahale etmez. Başka bir protein çökeltme yöntemi kullanılıyorsa, kemilüminesans ile uyumluluğunu test edin.
   10. 17.000 × g, 4 °C, 30 dk. Süpernatantı aspire edin ve nitrit / nitrat seviyelerini ölçün veya daha sonra kullanmak üzere -80 ° C'de saklayın.

4. Nitrik oksit analizörü (NOA) ile nitrit/nitrat ölçümü

1. Tüm numuneleri yukarıda açıklanan üç farklı homojenizasyon yönteminden biriyle hazırlayın ve nitrat ve nitrit ölçümü için bir NOA'ya enjekte edin.
   NOT: NOA kullanımı için ayrıntılı protokoller daha önce^{yayınlanmıştır 19}.

Sonuçlar

Temsili sonuçlar elde etmek için, 8 Wistar sıçanından (erkek ve dişiler, ağırlık 250 ± 50 g) iskelet kası dokuları kullanılmıştır. Sıçan iskelet kası homojenatları (her yöntem için 50 mg gluteus maximus kası) üç farklı homojenizasyon aracı (döner homojenizatör, boncuk homojenizatörü ve pulverizatör) ile hazırlanmıştır. Bu homojenatların nitrat ve nitrit içerikleri daha sonra bir nitrik oksit analizörü (NOA) kullanılarak belirlendi (Şekil 4). Bu üç ...

Tartışmalar

NO metabolitleri, nitrat ve nitritteki değişiklikleri izlemek için, fizyolojik müdahalelerin bir fonksiyonu olarak, bu iyonların metabolizmalarında kritik olan farklı organlardaki seviyelerini ölçmek zorunludur. Kandaki hemoglobin NO ve metabolitleri ile reaksiyona gireceğinden, kanı doku örneklerinden mümkün olduğunca hızlı bir şekilde çıkarmak da önemlidir. Böylece iskelet kas dokuları (gluteus, TA, EDL, gastroknemius kası) toplanmadan önce hayvanlar salin ile perfüze edildi ve hedef kas etraf...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
gentleMACS dissociator	Miltenyi Biotec	130-093-235
gentle MACS M tube	Miltenyi Biotec	130-093-236	Length: 87 mm; Diameter: 30 mm
Heparin Sodium	Hospira	NDC-0409-7620-13
Isoflurane	Baxter	NDC-10019-360-60
Methanol	Sigma	646377
Minilys bead homogenizer	Bertin Instruments	P000673-MLYS0-A
NEM; N-ethylmaleimide	Sigma	4260
Nitric Oxide analyzer	GE	Sievers NOA 280i
NP-40; 4-Nonylphenylpolyethylene glycol	Sigma	74385
Potassium ferricyanide; K3Fe(CN)6	Sigma	702587
Precellys lysing kit	Bertin Instruments	P000911-LYSK0-A	contains 2 mL tubes with 2.8 mm ceramic (zirconium oxide) beads for homogenization
Pulverizer kit	Cellcrusher	Cellcrusher kit