Подготовка гомогенатов скелетных мышц крыс для измерения нитратов и нитритов

Резюме

Мы представляем протоколы для трех различных методов гомогенизации четырех различных групп мышц скелетной мышечной ткани крыс для измерения и сравнения уровней нитратов и нитритов. Кроме того, мы сравниваем различные веса образцов, чтобы выяснить, влияет ли размер образца ткани на результаты гомогенизации.

Аннотация

Ионы нитратов (NO₃^{-) когда-то} считались инертными конечными продуктами метаболизма оксида азота (NO). Тем не менее, предыдущие исследования показали, что ионы нитратов могут быть преобразованы обратно в NO у млекопитающих с помощью двухэтапного механизма восстановления: нитрат восстанавливается до нитритов (NO₂^-) в основном пероральными комменсальными бактериями, а затем нитрит восстанавливается до NO несколькими механизмами, в том числе с помощью белков, содержащих гем или молибден. Этот восстановительный нитратный путь способствует усилению NO-опосредованных сигнальных путей, особенно в сердечно-сосудистой системе и во время мышечных упражнений. Уровни нитратов в организме до такого использования определяются двумя различными источниками: эндогенным окислением NO и потреблением нитратов с пищей, главным образом из растений. Чтобы прояснить сложный цикл NO в физиологических условиях, мы дополнительно изучили динамику его метаболитов, нитратов и нитрит-ионов, которые относительно стабильны по сравнению с NO. В предыдущих исследованиях скелетные мышцы были идентифицированы как основной орган хранения ионов нитратов у млекопитающих, а также как прямой источник NO во время физических упражнений. Поэтому создание надежной методологии измерения уровней нитратов и нитритов в скелетных мышцах важно и должно быть полезно для расширения ее применения на другие образцы тканей. В этой статье подробно объясняется подготовка образцов скелетных мышц с использованием трех различных методов гомогенизации для измерения нитратов и нитритов и обсуждаются важные вопросы, связанные с процессами гомогенизации, включая размер образцов. Концентрации нитратов и нитритов также сравнивались по четырем различным группам мышц.

Введение

Оксид азота (NO), небольшая газообразная сигнальная молекула, играет решающую роль в физиологических и патофизиологических процессах¹. NO может быть продуцирован из L-аргинина эндогенными ферментами семейства синтазы оксида азота (NOS) до быстрого окисления до нитрата (NO₃^-) и, возможно, нитрита (NO₂^-) в крови и тканях ^2,3. Недавно было показано, что эти анионы восстанавливаются обратно до NO в системах^{млекопитающих 4}. Нитрат превращается в нитрит, главным образом, комменсальными бактериальными нитратредуктазами в полости рта, действующими на ионы, выделяемые слюнными железами и непосредственно поглощаемые ⁵, и в некоторой степени ферментами млекопитающих, такими как ксантиноксидоредуктаза ^6,7. Нитрит может быть дополнительно восстановлен до NO несколькими механизмами, включая дезоксигемоглобин⁸, дезоксимиоглобин⁹, молибденсодержащие ферменты¹⁰ и неферментативное восстановление в присутствии протонов^11,12.

Этот путь нитрат-нитрит-NO усиливается в гипоксических условиях, в которых активность NOS уменьшается, потому что NOS требует кислорода для no generation⁴. Во многих недавних исследованиях сообщалось о благотворном влиянии диетических нитратов на регуляцию артериального давления и физическую активность, предполагая, что пути снижения нитратов способствуют увеличению передачи сигналов NO 13,14,15. Предыдущие исследования показали, что некоторые скелетные мышцы, вероятно, являются основными местами хранения нитратов в организме¹⁶. По сравнению с кровью или другими внутренними органами, такими как печень, скелетные мышцы (ягодичная мышца) содержат значительно более высокие уровни нитратов и имеют значительную массу в организме млекопитающих. Было показано, что упражнения на беговой дорожке усиливают снижение нитратов до нитритов и до NO в ягодичной мышце у крыс в модели⁷. Эти результаты подразумевают, что некоторые скелетные мышцы могут быть важными источниками NO через пути снижения нитратов в физиологических ситуациях. Более поздние исследования показывают, что эти результаты, включая изменения уровня мышечных нитратов во время физических упражнений, также происходят у людей¹⁷.

Два из нынешних авторов ранее установили метод измерения уровней нитратов и нитритов в крови и других жидких образцах¹⁸. Однако, когда уровни этих анионов в тканевых гомогенатах были первоначально проанализированы, подробные протоколы были недоступны. Чтобы понять динамику нитрат-нитрит-НЕТ в нескольких различных органах, наша цель состояла в том, чтобы разработать точный и эффективный метод измерения уровней нитратов и нитритов в тканях млекопитающих, включая скелетные мышцы. В более ранних исследованиях ткани грызунов использовались для разработки надежных процессов гомогенизации, а затем анализа содержания нитратов и нитритов в этих гомогенатах ^7,16,19. Использование этого метода гомогенизации было распространено на образцы биопсии скелетных мышц человека, в результате чего значения были подтверждены, и, что важно, значения, наблюдаемые для мышц по сравнению с кровью / плазмой, были в аналогичных диапазонах и соотношениях с теми, которые наблюдались у грызунов¹⁷. В последние годы другие группы также начали измерять уровни нитратов и нитритов в гомогенатах скелетных мышц, сообщая о сопоставимых значениях с теми, о которых сообщила наша группа^20,21.

Целью данной протокольной работы является подробное описание получения гомогенатов скелетных мышц с использованием трех различных методов гомогенизации для последующего измерения уровней нитратов и нитритов. Кроме того, изучалось влияние массы тканей, используемой для гомогенизации, на значения нитратов и нитритов в образцах скелетных мышц. Мы считаем, что эти методы могут быть легко применены к другим типам тканей млекопитающих. В последнее время, особенно в области физиологии физических упражнений, внимание было уделено возможным различиям в физиологии нитратов/нитритов/NO в зависимости от групп мышц. Мы также сообщаем о количестве нитратов и нитритов в четырех различных мышцах грызунов и находим неравномерное распределение обоих ионов между этими различными мышцами; наблюдение, требующее дальнейшего изучения.

протокол

Протокол для животных был одобрен Комитетом по уходу и использованию животных NIDDK (ASP K049-MMB-20). Животные обрабатывались и лечились в соответствии с действующим Руководством по уходу и использованию лабораторных животных, свободно доступным на веб-сайте AAALAC.

1. Коллекция скелетных мышц крыс

1. Пока крыса находится под глубокой анестезией (5% изофлурана, подтвержденная отсутствующей реакцией на защемление хвоста / ноги), начните перфузию физиологическим раствором, содержащим гепарин, поместив иглу 19 г в вершину левого желудочка и сделав кольца на правом предсердии. Дайте физиологическому раствору с гепарином перфузиться через внутренние органы до тех пор, пока через ткань не пройдет не менее 1,5 литра / кг. В этот момент животные мертвы от экссангинации, а туши готовы к обработке для сбора образцов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Достижение хорошей перфузии имеет решающее значение, особенно для точных измерений нитритов, потому что нитрит окисляется в нитраты любым оставшимся гемоглобином.
2. Определите целевые мышечные ткани и иссечение их из задних ног²² с помощью чистых хирургических инструментов. Удалите как можно больше жира и соединительных тканей из мышечных тканей.
3. Поместите нужное количество мышц в микроцентрифужную трубку, а затем поместите на сухой лед. Храните тюбики, заполненные тканью, в морозильной камере -80 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В случае образцов биопсии человека, тщательно промойте их сразу после сбора чистой марлей, чтобы удалить лишнюю кровь.

2. Подготовка к гомогенизации

1. Приготовление нитритсодержащего раствора (стоп-раствора)
   1. Готовят прозрачный желтый раствор, содержащий 890 мМ феррицианида калия (K₃Fe(CN)₆) и 118 мМ NEM (N-этилмалеймид) в дистиллированной воде, обеспечивая отсутствие кристаллов. Добавьте неионное поверхностно-активное вещество (моющее средство) в соотношении 1:9 (v/v, таблица материалов) и аккуратно перемешайте, чтобы избежать вспенивания.
   2. Стоп-раствор разбавить в соотношении 1:9 дистиллированной водой. Поместите разбавленный стоп-раствор (соотношение мышечной ткани 1:5 к разбавленному стоп-раствору) в гомогенизационную трубку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Двадцать миллиграммов ткани потребуют 100 мкл стоп-раствора, а 200 мг ткани потребуют 1000 мкл стоп-раствора в пробирке. Наличие моющего средства в добавленном растворе имеет решающее значение для разрушения клеточных мембран. Можно использовать любое неионное моющее средство, но необходимо позаботиться о том, чтобы убедиться, что оно не мешает методу хемилюминесценции.
2. Подготовка тканей
   1. Выньте ткань из морозильной камеры при температуре -80 °C и медленно оттаивайте во льду. Удалите оставшийся жир и соединительную ткань из скелетной мышцы. Отрежьте кусочки скелетных мышц и промокайте на марле, чтобы высохнуть.
   2. Взвесьте количество ткани (20, 50 и 200 мг). Поместите предварительно взвешенную скелетную мышцу в стоп-раствор в гомогенизационных трубках или поместите предварительно взвешенную ткань в чистую микроцентрифужную трубку для последующего использования.

3. Гомогенизация

1. Роторный гомогенизатор (рисунок 1)
   1. Поместите в машину трубку М-типа, содержащую предварительно взвешенную скелетную мышцу и предварительно измеренный стоп-раствор. Гомогенизируйте каждый образец дважды (установив наиболее разрушительный цикл гомогенизации) и поместите трубку на лед сразу после каждой гомогенизации в течение 5 минут для охлаждения.
   2. Центрифугируют кратковременно при 2000 × г и 4 °C в течение 5 мин. Поместите полный тюбик обратно на лед и добавьте соответствующий объем метанола (≥ 99,9 %, 10x веса ткани). Вихрь тщательно в течение 15 с.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для 20 мг ткани используйте 200 мкл метанола. Метанол используется для осаждения белков из тканевого гомогената и не препятствует методу хемилюминесценции. Если используется другой метод осаждения белка, проверьте его совместимость с хемилюминесценцией.
   3. Еще раз гомогенизировать и инкубировать на льду в течение 30 мин. Центрифугирование образцов в течение 35 мин при 4 °C и 3 500 × г. Аспирируйте супернатант и измеряйте уровни нитритов/нитратов или храните при -80 °C для последующего использования.
2. Гомогенизатор бусин (рисунок 2)
   1. Поместите скелетную мышечную ткань в шарикодержащую трубку (соотношение 1:5 для ткани: разбавленный стоп-раствор) и гомогенизируйте дважды в течение 45 с на самой высокой скорости, доступной на используемом инструменте. Поместите трубку на лед сразу после каждой гомогенизации на 5 мин для охлаждения.
   2. Кратковременно центрифугировать с помощью небольшой настольной центрифуги (2 000 x g) в течение 5 секунд. Поместите трубку обратно на лед и добавьте соответствующий объем метанола (чистота ≥ 99,9 %, 10x веса ткани). Вихрь тщательно в течение 15 с.
      ПРИМЕЧАНИЕ 1: Для 20 мг ткани используйте 200 мкл метанола.
      ПРИМЕЧАНИЕ 2: Метанол используется для осаждения белков из тканевого гомогената и не препятствует методу хемилюминесценции. Если используется другой метод осаждения белка, проверьте его совместимость с хемилюминесценцией.
   3. Гомогенизируйте еще раз в течение 45 с на самой высокой скорости, доступной на используемом инструменте. Инкубировать на льду в течение 30 мин. Центрифуга при 17 000 х г, 4 °C, 30 мин. Аспирируйте супернатант и измеряйте уровни нитритов/нитратов или храните при -80 °C для последующего использования.
3. Измельчитель (рисунок 3)
   1. Подготовьте пробирки, содержащие разбавленный стоп-раствор (в 5 раз больше массы ткани) и взвесьте их. Запишите вес (трубка + стоп-раствор).
   2. Поместите инструмент для измельчения жидкого азота на сухой лед и подождите примерно 30 минут, пока он достигнет нужной температуры.
   3. Используя пинцет, охлажденный жидким азотом, перенесите один образец (вес ткани уже измерен) в пульверизатор. Добавьте небольшую ложку жидкого азота, чтобы убедиться, что ткань находится при температуре жидкого азота.
   4. После того, как 95% жидкого азота испарится, поместите дробильный инструмент поверх ткани и плотно надавите. Вы должны почувствовать раздавливание образца. С помощью молотка ударьте дробильным инструментом в 3-5 раз.
   5. Проверьте образец на наличие оставшихся кусков с помощью ложки, охлажденной жидким азотом. После охлаждения в жидком азоте используйте лист папиросной бумаги, чтобы протереть замерзшую воду, прежде чем прикасаться к ткани. Если кусок присутствует, переместите его в центр, а затем ударьте молотком еще 5-6 раз.
   6. Когда весь образец будет измельчен, используйте ложку с жидким азотным охлаждением для непосредственного переноса измельченной ткани в предварительно взвешенную трубку, содержащую разбавленный стоп-раствор (этап 3.3.1). Обязательно выполняйте этот шаг быстро, так как когда раздавленная скелетная мышца нагревается, она становится липкой и трудно переносимой.
   7. Вихрь на 15 с. Убедитесь, что никакая ткань не застряла в верхней части трубки, открыв трубку. Если есть, попробуйте выбить его, а затем снова вихрь.
   8. Центрифугирование образца в течение 2-3 с с помощью небольшой настольной центрифуги. Еще раз взвесьте трубку. Рассчитайте вес ткани, вычитая исходный вес трубки (шаг 3.3.1) из этого нового веса. Поместите трубку на лед.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Точные веса помогут определить точный вес ткани и то, сколько ткани было потеряно во время измельчения.
   9. После того, как все образцы были обработаны до этапа 3.3.8, добавьте соответствующий объем метанола (≥ 99,9%, 10x веса ткани). Тщательно вихрь в течение 15 с, и насиживайте на льду в течение 30 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для 20 мг ткани используйте 200 мкл метанола. Метанол используется для осаждения белков из тканевого гомогената и не препятствует методу хемилюминесценции. Если используется другой метод осаждения белка, проверьте его совместимость с хемилюминесценцией.
   10. Центрифуга при 17 000 × г, 4 °C, 30 мин. Аспирируйте супернатант и измеряйте уровни нитритов/нитратов или храните при -80 °C для последующего использования.

4. Измерение нитрит/нитрат с помощью анализатора оксида азота (NOA)

1. Подготовьте все образцы одним из трех различных методов гомогенизации, описанных выше, и введите их в NOA для измерения нитратов и нитритов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Подробные протоколы для использования NOA были опубликованы ранее¹⁹.

Результаты

Для получения репрезентативных результатов использовали скелетные мышечные ткани у 8 крыс Wistar (самцов и самок, вес 250 ± 50 г). Гомогенаты скелетных мышц крыс (50 мг ягодичной мышцы для каждого метода) получали тремя различными инструментами гомогенизации (роторный гомогенизатор, гомогениз...

Обсуждение

Чтобы контролировать изменения в метаболитах NO, нитратах и нитритах, в зависимости от физиологических вмешательств, необходимо измерить уровни этих ионов в различных органах, которые имеют решающее значение в их метаболизме. Поскольку гемоглобин в крови будет реагировать с NO и его мет...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
gentleMACS dissociator	Miltenyi Biotec	130-093-235
gentle MACS M tube	Miltenyi Biotec	130-093-236	Length: 87 mm; Diameter: 30 mm
Heparin Sodium	Hospira	NDC-0409-7620-13
Isoflurane	Baxter	NDC-10019-360-60
Methanol	Sigma	646377
Minilys bead homogenizer	Bertin Instruments	P000673-MLYS0-A
NEM; N-ethylmaleimide	Sigma	4260
Nitric Oxide analyzer	GE	Sievers NOA 280i
NP-40; 4-Nonylphenylpolyethylene glycol	Sigma	74385
Potassium ferricyanide; K3Fe(CN)6	Sigma	702587
Precellys lysing kit	Bertin Instruments	P000911-LYSK0-A	contains 2 mL tubes with 2.8 mm ceramic (zirconium oxide) beads for homogenization
Pulverizer kit	Cellcrusher	Cellcrusher kit