硝酸塩および亜硝酸塩測定のためのラット骨格筋ホモジネートの調製

要約

硝酸塩と亜硝酸塩のレベルを測定および比較するために、ラット骨格筋組織の4つの異なる筋肉群を均質化するための3つの異なる方法のプロトコルを提示します。さらに、異なるサンプル重量を比較して、組織のサンプルサイズが均質化の結果に影響を与えるかどうかを調査します。

要約

硝酸イオン(NO₃^-)は、かつて一酸化窒素(NO)代謝の不活性な最終生成物であると考えられていました。しかし、以前の研究では、硝酸イオンは2段階の還元メカニズムによってNOに戻すことができることが実証されました:硝酸塩は主に経口共生細菌によって亜硝酸塩(NO₂^-)に還元され、次に亜硝酸塩はヘムまたはモリブデン含有タンパク質を含むいくつかのメカニズムによってNOに還元されます。この還元性硝酸塩経路は、特に心血管系および筋肉運動中のNO媒介シグナル伝達経路の増強に寄与する。そのような利用前の体内の硝酸塩のレベルは、主に植物からの内因性NO酸化と食事性硝酸塩摂取の2つの異なる供給源によって決定されます。生理的環境下での複雑なNOサイクルを解明するために、NOと比較して比較的安定な代謝物である硝酸イオンと亜硝酸イオンの動態をさらに調べました。以前の研究では、骨格筋は哺乳類の硝酸イオンの主要な貯蔵器官であり、運動中のNOの直接的な供給源として特定されていました。したがって、骨格筋の硝酸塩と亜硝酸塩のレベルを測定するための信頼できる方法論を確立することは重要であり、他の組織サンプルへの適用を拡大するのに役立つはずです。この論文では、硝酸塩と亜硝酸塩の測定のために、3つの異なる均質化方法を使用して骨格筋サンプルの調製について詳しく説明し、サンプルのサイズを含む均質化プロセスに関連する重要な問題について議論します。硝酸塩と亜硝酸塩の濃度も、4つの異なる筋肉グループで比較されています。

概要

小さなガス状のシグナル伝達分子である一酸化窒素(NO)は、生理学的および病態生理学的プロセスにおいて重要な役割を果たします¹。NOは、硝酸塩(NO 3-)およびおそらく亜硝酸塩(NO₂-)への急速な酸化を受ける前に、一酸化窒素シンターゼ(NOS)ファミリーの内因性酵素によってL^-アルギニンから生成することができます血液および組織^2,3。最近、これらのアニオンは哺乳類系においてNOに還元されることが示されている⁴。硝酸塩は、主に唾液腺から分泌され、直接^{摂取されたイオン}に作用する口腔内の共生細菌硝酸レダクターゼ5、およびある程度はキサンチンオキシドレダクターゼ^6,7などの哺乳類の酵素によって亜硝酸塩に変換されます。亜硝酸塩は、デオキシヘモグロビン⁸、デオキシミオグロビン⁹、モリブデン含有酵素10、およびプロトン^11,12

プロトコル

動物プロトコルは、NIDDK動物管理および使用委員会(ASP K049-MMB-20)によって承認されました。動物は、AAALACのウェブサイトで無料で入手できる実験動物の世話と使用に関する現在のガイドに従って取り扱われました。

1.ラット骨格筋収集

1. ラットが深い麻酔下にある間(5%イソフルラン、尾/脚のピンチに対する反応がないことによって確認)、左心室の頂点に19 Gの針を配置し、右心房に刻み目を作ることにより、ヘパリンを含む生理食塩水で灌流を開始します。.少なくとも1.5リットル/ kgが組織を流れるまで、ヘパリンを含む生理食塩水を内臓に灌流させます。.この時点で、動物は放血で死んでおり、死体はサンプル収集のために処理する準備ができています。
   注:亜硝酸塩は残りのヘモグロビンによって硝酸塩に酸化されるため、特に亜硝酸塩の正確な測定には、良好な灌流を達成することが重要です。
2. 標的筋肉組織を同定し、清浄な手術器具を用いて後肢²² からそれらを切除する。筋肉組織からできるだけ多くの脂肪と結合組織を取り除きます。
3. 必要な量の筋肉を微量遠心チューブに入れ、ドライアイスの上に置きます。ティッシュを充填したチューブを-80°Cの冷凍庫に保管します。
   注:ヒト生検サンプルの場合は、採取後すぐにきれいなガーゼで完全に拭き取り、余分な血液を取り除きます。

結果

代表的な結果を得るために、8匹のWistarラット(雄および雌、体重250±50g)の骨格筋組織を使用した。ラット骨格筋ホモジネート(各方法で50mgの大殿筋)を3つの異なるホモジナイズツール(回転ホモジナイザー、ビーズホモジナイザー、および粉砕機)によって調製した。次に、これらのホモジネートの硝酸塩と亜硝酸塩の含有量を、一酸化窒素分析装置(NOA)を使用して測定しました(?.......

ディスカッション

生理学的介入の機能としてNO代謝物、硝酸塩および亜硝酸塩の変化を監視するには、代謝に重要なさまざまな臓器におけるこれらのイオンのレベルを測定することが不可欠です。血液中のヘモグロビンはNOとその代謝物と反応するため、組織サンプルからできるだけ迅速に血液を除去することも重要です。したがって、動物に生理食塩水を灌流してから骨格筋組織(臀筋、TA、EDL、腓腹筋)を収?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
gentleMACS dissociator	Miltenyi Biotec	130-093-235
gentle MACS M tube	Miltenyi Biotec	130-093-236	Length: 87 mm; Diameter: 30 mm
Heparin Sodium	Hospira	NDC-0409-7620-13
Isoflurane	Baxter	NDC-10019-360-60
Methanol	Sigma	646377
Minilys bead homogenizer	Bertin Instruments	P000673-MLYS0-A
NEM; N-ethylmaleimide	Sigma	4260
Nitric Oxide analyzer	GE	Sievers NOA 280i
NP-40; 4-Nonylphenylpolyethylene glycol	Sigma	74385
Potassium ferricyanide; K3Fe(CN)6	Sigma	702587
Precellys lysing kit	Bertin Instruments	P000911-LYSK0-A	contains 2 mL tubes with 2.8 mm ceramic (zirconium oxide) beads for homogenization
Pulverizer kit	Cellcrusher	Cellcrusher kit