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* これらの著者は同等に貢献しました
硝酸塩と亜硝酸塩のレベルを測定および比較するために、ラット骨格筋組織の4つの異なる筋肉群を均質化するための3つの異なる方法のプロトコルを提示します。さらに、異なるサンプル重量を比較して、組織のサンプルサイズが均質化の結果に影響を与えるかどうかを調査します。
硝酸イオン(NO3-)は、かつて一酸化窒素(NO)代謝の不活性な最終生成物であると考えられていました。しかし、以前の研究では、硝酸イオンは2段階の還元メカニズムによってNOに戻すことができることが実証されました:硝酸塩は主に経口共生細菌によって亜硝酸塩(NO2-)に還元され、次に亜硝酸塩はヘムまたはモリブデン含有タンパク質を含むいくつかのメカニズムによってNOに還元されます。この還元性硝酸塩経路は、特に心血管系および筋肉運動中のNO媒介シグナル伝達経路の増強に寄与する。そのような利用前の体内の硝酸塩のレベルは、主に植物からの内因性NO酸化と食事性硝酸塩摂取の2つの異なる供給源によって決定されます。生理的環境下での複雑なNOサイクルを解明するために、NOと比較して比較的安定な代謝物である硝酸イオンと亜硝酸イオンの動態をさらに調べました。以前の研究では、骨格筋は哺乳類の硝酸イオンの主要な貯蔵器官であり、運動中のNOの直接的な供給源として特定されていました。したがって、骨格筋の硝酸塩と亜硝酸塩のレベルを測定するための信頼できる方法論を確立することは重要であり、他の組織サンプルへの適用を拡大するのに役立つはずです。この論文では、硝酸塩と亜硝酸塩の測定のために、3つの異なる均質化方法を使用して骨格筋サンプルの調製について詳しく説明し、サンプルのサイズを含む均質化プロセスに関連する重要な問題について議論します。硝酸塩と亜硝酸塩の濃度も、4つの異なる筋肉グループで比較されています。
小さなガス状のシグナル伝達分子である一酸化窒素(NO)は、生理学的および病態生理学的プロセスにおいて重要な役割を果たします1。NOは、硝酸塩(NO 3-)およびおそらく亜硝酸塩(NO2-)への急速な酸化を受ける前に、一酸化窒素シンターゼ(NOS)ファミリーの内因性酵素によってL-アルギニンから生成することができます血液および組織2,3。最近、これらのアニオンは哺乳類系においてNOに還元されることが示されている4。硝酸塩は、主に唾液腺から分泌され、直接摂取されたイオンに作用する口腔内の共生細菌硝酸レダクターゼ5、およびある程度はキサンチンオキシドレダクターゼ6,7などの哺乳類の酵素によって亜硝酸塩に変換されます。亜硝酸塩は、デオキシヘモグロビン8、デオキシミオグロビン9、モリブデン含有酵素10、およびプロトン11,12
動物プロトコルは、NIDDK動物管理および使用委員会(ASP K049-MMB-20)によって承認されました。動物は、AAALACのウェブサイトで無料で入手できる実験動物の世話と使用に関する現在のガイドに従って取り扱われました。
1.ラット骨格筋収集
代表的な結果を得るために、8匹のWistarラット(雄および雌、体重250±50g)の骨格筋組織を使用した。ラット骨格筋ホモジネート(各方法で50mgの大殿筋)を3つの異なるホモジナイズツール(回転ホモジナイザー、ビーズホモジナイザー、および粉砕機)によって調製した。次に、これらのホモジネートの硝酸塩と亜硝酸塩の含有量を、一酸化窒素分析装置(NOA)を使用して測定しました(?.......
生理学的介入の機能としてNO代謝物、硝酸塩および亜硝酸塩の変化を監視するには、代謝に重要なさまざまな臓器におけるこれらのイオンのレベルを測定することが不可欠です。血液中のヘモグロビンはNOとその代謝物と反応するため、組織サンプルからできるだけ迅速に血液を除去することも重要です。したがって、動物に生理食塩水を灌流してから骨格筋組織(臀筋、TA、EDL、腓腹筋)を収?.......
著者は、利益相反はないと宣言しています。Alan N. Schechterは、心血管疾患の治療のための亜硝酸塩の使用について国立衛生研究所に発行されたいくつかの特許の共同発明者としてリストされています。彼は、臨床開発のためのこれらの特許のNIHライセンスに基づいてロイヤルティを受け取りますが、他の補償は受け取りません。これらの取り決めは、JoVEジャーナルポリシーの遵守には影響しません。
この作業は、学内NIH / NIDDK助成金ZIA DK 0251041-14によって、メリーランド州アランNシェクターに支援されました。
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
gentleMACS dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
gentle MACS M tube | Miltenyi Biotec | 130-093-236 | Length: 87 mm; Diameter: 30 mm |
Heparin Sodium | Hospira | NDC-0409-7620-13 | |
Isoflurane | Baxter | NDC-10019-360-60 | |
Methanol | Sigma | 646377 | |
Minilys bead homogenizer | Bertin Instruments | P000673-MLYS0-A | |
NEM; N-ethylmaleimide | Sigma | 4260 | |
Nitric Oxide analyzer | GE | Sievers NOA 280i | |
NP-40; 4-Nonylphenylpolyethylene glycol | Sigma | 74385 | |
Potassium ferricyanide; K3Fe(CN)6 | Sigma | 702587 | |
Precellys lysing kit | Bertin Instruments | P000911-LYSK0-A | contains 2 mL tubes with 2.8 mm ceramic (zirconium oxide) beads for homogenization |
Pulverizer kit | Cellcrusher | Cellcrusher kit |
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