硝酸塩および亜硝酸塩測定のためのラット骨格筋ホモジネートの調製

要約

硝酸塩と亜硝酸塩のレベルを測定および比較するために、ラット骨格筋組織の4つの異なる筋肉群を均質化するための3つの異なる方法のプロトコルを提示します。さらに、異なるサンプル重量を比較して、組織のサンプルサイズが均質化の結果に影響を与えるかどうかを調査します。

要約

硝酸イオン(NO₃^-)は、かつて一酸化窒素(NO)代謝の不活性な最終生成物であると考えられていました。しかし、以前の研究では、硝酸イオンは2段階の還元メカニズムによってNOに戻すことができることが実証されました:硝酸塩は主に経口共生細菌によって亜硝酸塩(NO₂^-)に還元され、次に亜硝酸塩はヘムまたはモリブデン含有タンパク質を含むいくつかのメカニズムによってNOに還元されます。この還元性硝酸塩経路は、特に心血管系および筋肉運動中のNO媒介シグナル伝達経路の増強に寄与する。そのような利用前の体内の硝酸塩のレベルは、主に植物からの内因性NO酸化と食事性硝酸塩摂取の2つの異なる供給源によって決定されます。生理的環境下での複雑なNOサイクルを解明するために、NOと比較して比較的安定な代謝物である硝酸イオンと亜硝酸イオンの動態をさらに調べました。以前の研究では、骨格筋は哺乳類の硝酸イオンの主要な貯蔵器官であり、運動中のNOの直接的な供給源として特定されていました。したがって、骨格筋の硝酸塩と亜硝酸塩のレベルを測定するための信頼できる方法論を確立することは重要であり、他の組織サンプルへの適用を拡大するのに役立つはずです。この論文では、硝酸塩と亜硝酸塩の測定のために、3つの異なる均質化方法を使用して骨格筋サンプルの調製について詳しく説明し、サンプルのサイズを含む均質化プロセスに関連する重要な問題について議論します。硝酸塩と亜硝酸塩の濃度も、4つの異なる筋肉グループで比較されています。

概要

小さなガス状のシグナル伝達分子である一酸化窒素(NO)は、生理学的および病態生理学的プロセスにおいて重要な役割を果たします¹。NOは、硝酸塩(NO 3-)およびおそらく亜硝酸塩(NO₂-)への急速な酸化を受ける前に、一酸化窒素シンターゼ(NOS)ファミリーの内因性酵素によってL^-アルギニンから生成することができます血液および組織^2,3。最近、これらのアニオンは哺乳類系においてNOに還元されることが示されている⁴。硝酸塩は、主に唾液腺から分泌され、直接^{摂取されたイオン}に作用する口腔内の共生細菌硝酸レダクターゼ5、およびある程度はキサンチンオキシドレダクターゼ^6,7などの哺乳類の酵素によって亜硝酸塩に変換されます。亜硝酸塩は、デオキシヘモグロビン⁸、デオキシミオグロビン⁹、モリブデン含有酵素10、およびプロトン^11,12の存在下での非酵素的還元を含むいくつかのメカニズムによってさらにNOに還元することができる。

この硝酸塩-亜硝酸塩-NO経路は、NOSがNO生成⁴のために酸素を必要とするため、NOS活性が低下する低酸素条件下で増強される。最近の多くの研究では、血圧調節と運動パフォーマンスに対する食事性硝酸塩の有益な効果が報告されており、硝酸塩還元経路がNOシグナル伝達の増強に寄与することが示唆されています^13,14,15。以前の研究では、いくつかの骨格筋が体内の主要な硝酸塩貯蔵場所である可能性が高いことが示されています¹⁶。血液や肝臓などの他の内臓と比較して、骨格筋(大殿筋)は有意に高いレベルの硝酸塩を含み、哺乳類の体内にかなりの質量を持っています。トレッドミル運動は、ラットモデル⁷において、亜硝酸塩および大臀筋中のNOへの硝酸塩還元を促進することが示された。これらの結果は、いくつかの骨格筋が生理学的状況における硝酸塩還元経路を介したNOの重要な供給源である可能性があることを示唆しています。より最近の研究では、運動中の筋肉の硝酸レベルの変化を含むこれらの発見は、人間でも発生することが示唆されています¹⁷。

現在の著者のうちの2人は、血液および他の液体サンプル中の硝酸塩および亜硝酸塩レベルを測定する方法を以前に確立していた¹⁸。しかし、組織ホモジネート中のこれらのアニオンのレベルが最初に分析されたとき、詳細なプロトコルは利用できませんでした。いくつかの異なる臓器における硝酸塩-亜硝酸塩-NOのダイナミクスを理解するために、私たちの目標は、骨格筋を含む哺乳類組織の硝酸塩と亜硝酸塩のレベルを測定するための正確で効率的な方法を開発することでした。以前の研究では、げっ歯類の組織を使用して信頼性の高い均質化プロセスを開発し、それらのホモジネート中の硝酸塩と亜硝酸塩の含有量を分析しました7,16,19。この均質化法の使用は、ヒト骨格筋生検サンプルに拡大され、それによって値が確認され、重要なことに、血液/血漿と比較して筋肉について観察された値は、げっ歯類で観察されたものと同様の範囲および比率であった¹⁷。近年、他のグループも骨格筋ホモジネート中の硝酸塩と亜硝酸塩のレベルを測定し始め、私たちのグループによって報告されたものと同等の値を報告しました^20,21。

このプロトコルペーパーの目的は、硝酸塩と亜硝酸塩のレベルをその後測定するための3つの異なる均質化方法を使用した骨格筋ホモジネートの調製を詳細に説明することです。さらに、骨格筋サンプル中の硝酸塩および亜硝酸塩の値に対する均質化に使用される組織重量の影響を調べました。これらの手法は、他の種類の哺乳類組織にも容易に適用できると考えています。近年、特に運動生理学の分野では、筋肉群による硝酸塩/亜硝酸塩/NO生理機能の違いが注目されています。また、4つの異なるげっ歯類の筋肉における硝酸塩と亜硝酸塩の量を報告し、これらの異なる筋肉間で両方のイオンの不均一な分布を発見しました。さらなる研究が必要な観察。

プロトコル

動物プロトコルは、NIDDK動物管理および使用委員会(ASP K049-MMB-20)によって承認されました。動物は、AAALACのウェブサイトで無料で入手できる実験動物の世話と使用に関する現在のガイドに従って取り扱われました。

1.ラット骨格筋収集

1. ラットが深い麻酔下にある間(5%イソフルラン、尾/脚のピンチに対する反応がないことによって確認)、左心室の頂点に19 Gの針を配置し、右心房に刻み目を作ることにより、ヘパリンを含む生理食塩水で灌流を開始します。.少なくとも1.5リットル/ kgが組織を流れるまで、ヘパリンを含む生理食塩水を内臓に灌流させます。.この時点で、動物は放血で死んでおり、死体はサンプル収集のために処理する準備ができています。
   注:亜硝酸塩は残りのヘモグロビンによって硝酸塩に酸化されるため、特に亜硝酸塩の正確な測定には、良好な灌流を達成することが重要です。
2. 標的筋肉組織を同定し、清浄な手術器具を用いて後肢²² からそれらを切除する。筋肉組織からできるだけ多くの脂肪と結合組織を取り除きます。
3. 必要な量の筋肉を微量遠心チューブに入れ、ドライアイスの上に置きます。ティッシュを充填したチューブを-80°Cの冷凍庫に保管します。
   注:ヒト生検サンプルの場合は、採取後すぐにきれいなガーゼで完全に拭き取り、余分な血液を取り除きます。

2.均質化の準備

1. 亜硝酸塩保存液(ストップ液)の調製
   1. 890 mMのフェリシアン化カリウム(K₃Fe(CN)₆)と118 mM NEM(N-エチルマレイミド)を蒸留水に含む透明な黄色の溶液を調製し、結晶がないことを確認します。非イオン性界面活性剤(洗剤)を1:9の比率(v / v、 材料表)で加え、泡立ちを避けるために穏やかに混ぜます。
   2. 停止液を蒸留水で1:9の比率に希釈します。希釈停止液(筋肉組織と希釈停止液の比率1:5)をホモジナイズチューブに入れます。
      注:20ミリグラムの組織には100μLの停止液が必要であり、200mgの組織にはチューブ内の1000μLの停止液が必要です。添加溶液中の界面活性剤の存在は、細胞膜の破壊にとって重要である。任意の非イオン性界面活性剤を使用できますが、化学発光法に干渉しないことを確認するように注意する必要があります。
2. ティッシュの準備
   1. -80°Cの冷凍庫からティッシュを取り出し、氷中でゆっくりと解凍します。骨格筋から残りの脂肪と結合組織を取り除きます。骨格筋の断片を切り取り、ガーゼで拭いて乾かします。
   2. 組織の量(20、50、および200 mg)を量ります。事前に計量した骨格筋をホモジナイズチューブのストップ溶液に入れるか、事前に計量した組織を清潔な微量遠心チューブに入れて後で使用できます。

3.均質化

1. ロータリーホモジナイザー(図1)
   1. 事前に計量された骨格筋と事前に測定された停止液を含むM型チューブを機械に入れます。各サンプルを2回ホモジナイズし(最も破壊的なホモジナイズサイクルに設定)、各ホモジナイズ直後にチューブを氷上に5分間置き、冷却します。
   2. 2,000 × g 、4°Cで5分間短時間遠心分離します。チューブ全体を氷上に戻し、適切な量のメタノール(≥99.9%、組織重量の10倍)を加えます。15秒間徹底的に渦巻きます。
      注:20 mgの組織には、200 μLのメタノールを使用してください。メタノールは、組織ホモジネートからタンパク質を沈殿させるために使用され、化学発光法を妨げません。他のタンパク質沈殿法を使用する場合は、化学発光との適合性をテストします。
   3. もう一度ホモジナイズし、氷上で30分間インキュベートします。サンプルを4°Cで35分間遠心分離し、3,500 × gを遠心分離します。上清を吸引し、亜硝酸塩/硝酸塩レベルを測定するか、後で使用するために-80°Cで保存してください。
2. ビーズホモジナイザー(図2)
   1. 骨格筋組織をビーズ含有チューブ(組織:希釈停止液の比率1:5)に入れ、使用する機器で利用可能な最高速度で45秒間2回ホモジナイズします。各均質化の直後にチューブを氷上に5分間置き、冷却します。
   2. 小型の卓上遠心分離機(2,000 x g)を使用して5秒間短時間遠心分離します。チューブを氷上に戻し、適切な量のメタノール(純度99.9%≥、組織重量の10倍)を加えます。15秒間徹底的に渦巻きます。
      注1:20 mgの組織には、200 μLのメタノールを使用してください。
      注2:メタノールは、組織ホモジネートからタンパク質を沈殿させるために使用され、化学発光法を妨げません。他のタンパク質沈殿法を使用する場合は、化学発光との適合性をテストします。
   3. 使用する機器で利用可能な最高速度で45秒間もう一度均質化します。氷上で30分間インキュベートします。17,000 x g、4°C、30分間の遠心分離機。上清を吸引し、亜硝酸塩/硝酸塩レベルを測定するか、後で使用するために-80°Cで保存してください。
3. 粉砕機(図3)
   1. 希釈した停止液(組織重量の5倍)を含むチューブを準備し、それらを計量します。重量を記録します(チューブ+ストップ溶液)。
   2. 液体窒素粉砕機ツールをドライアイスの上に置き、希望の温度になるまで約30分間待ちます。
   3. 液体窒素で冷却したピンセットを用いて、1つのサンプル(組織重量測定済み)を粉砕機に移す。スプーン一杯の液体窒素を加えて、組織が液体窒素温度になるようにします。
   4. 液体窒素の95%が気化したら、破砕工具を組織の上に置き、しっかりと押します。サンプルのつぶれを感じるはずです。木槌を使用して、破砕工具を3〜5倍叩きます。
   5. 液体窒素で冷却したスプーンを使用して、サンプルに残りのチャンクがないか確認します。液体窒素で冷却した後、ティッシュペーパーを使用して、ティッシュに触れる前に凍結水を拭き取ります。チャンクが存在する場合は、それを中央に移動してから、木槌でさらに5〜6回叩きます。
   6. サンプル全体が粉砕されたら、液体窒素冷却スプーンを使用して、希釈停止液を含む事前に計量されたチューブに粉砕組織を直接移します(ステップ3.3.1)。押しつぶされた骨格筋が熱くなると、粘着性があり、移動しにくくなるため、この手順をすばやく実行してください。
   7. 15秒間渦。チューブを開いて、チューブの上部に組織が詰まっていないことを確認します。ある場合は、それを取り除いてから、もう一度渦を巻いてみてください。
   8. 小型の卓上遠心分離機を使用してサンプルを2〜3秒間遠心分離します。チューブの重量をもう一度量ります。この新しい重量から元のチューブ重量(ステップ3.3.1)を差し引いて、組織の重量を計算します。チューブを氷の上に置きます。
      注:正確な重量は、正確な組織重量と粉砕中に失われた組織の量を決定するのに役立ちます。
   9. ステップ3.3.8までのすべてのサンプルが処理されたら、適切な量のメタノール(≥99.9%、組織重量の10倍)を追加します。15秒間徹底的にボルテックスし、氷上で30分間インキュベートします。
      注:20 mgの組織には、200 μLのメタノールを使用してください。メタノールは、組織ホモジネートからタンパク質を沈殿させるために使用され、化学発光法を妨げません。他のタンパク質沈殿法を使用する場合は、化学発光との適合性をテストします。
   10. 17,000 × g、4°C、30分間遠心分離機上清を吸引して亜硝酸塩/硝酸塩レベルを測定するか、後で使用するために-80°Cで保存してください。

4. 一酸化窒素分析装置(NOA)による亜硝酸塩/硝酸塩測定

1. 上記の3つの異なる均質化方法のいずれかによってすべてのサンプルを準備し、硝酸塩および亜硝酸塩の測定のためにそれらをNOAに注入します。
   注:NOAの使用に関する詳細なプロトコルは^{、以前に公開されています19}。

結果

代表的な結果を得るために、8匹のWistarラット(雄および雌、体重250±50g)の骨格筋組織を使用した。ラット骨格筋ホモジネート(各方法で50mgの大殿筋)を3つの異なるホモジナイズツール(回転ホモジナイザー、ビーズホモジナイザー、および粉砕機)によって調製した。次に、これらのホモジネートの硝酸塩と亜硝酸塩の含有量を、一酸化窒素分析装置(NOA)を使用して測定しました(?...

ディスカッション

生理学的介入の機能としてNO代謝物、硝酸塩および亜硝酸塩の変化を監視するには、代謝に重要なさまざまな臓器におけるこれらのイオンのレベルを測定することが不可欠です。血液中のヘモグロビンはNOとその代謝物と反応するため、組織サンプルからできるだけ迅速に血液を除去することも重要です。したがって、動物に生理食塩水を灌流してから骨格筋組織(臀筋、TA、EDL、腓腹筋)を収?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
gentleMACS dissociator	Miltenyi Biotec	130-093-235
gentle MACS M tube	Miltenyi Biotec	130-093-236	Length: 87 mm; Diameter: 30 mm
Heparin Sodium	Hospira	NDC-0409-7620-13
Isoflurane	Baxter	NDC-10019-360-60
Methanol	Sigma	646377
Minilys bead homogenizer	Bertin Instruments	P000673-MLYS0-A
NEM; N-ethylmaleimide	Sigma	4260
Nitric Oxide analyzer	GE	Sievers NOA 280i
NP-40; 4-Nonylphenylpolyethylene glycol	Sigma	74385
Potassium ferricyanide; K3Fe(CN)6	Sigma	702587
Precellys lysing kit	Bertin Instruments	P000911-LYSK0-A	contains 2 mL tubes with 2.8 mm ceramic (zirconium oxide) beads for homogenization
Pulverizer kit	Cellcrusher	Cellcrusher kit