Herstellung von Ratten-Skelettmuskelhomogenaten für Nitrat- und Nitritmessungen

Zusammenfassung

Wir präsentieren Protokolle für drei verschiedene Methoden zur Homogenisierung von vier verschiedenen Muskelgruppen von Ratten-Skelettmuskelgewebe, um die Nitrat- und Nitritwerte zu messen und zu vergleichen. Darüber hinaus vergleichen wir verschiedene Probengewichte, um zu untersuchen, ob die Gewebeprobengröße die Ergebnisse der Homogenisierung beeinflusst.

Zusammenfassung

Nitrationen (^NO3-) galten früher als inerte Endprodukte des Stickstoffmonoxid (NO)-Stoffwechsels. Frühere Studien zeigten jedoch, dass Nitrationen bei Säugetieren durch einen zweistufigen Reduktionsmechanismus wieder in NO umgewandelt werden können: Nitrat wird hauptsächlich von oralen kommensalen Bakterien zu Nitrit (_NO2-) reduziert, dann wird Nitrit durch verschiedene Mechanismen, einschließlich über Häm- oder Molybdän-haltige Proteine, zu NO reduziert. Dieser reduktive Nitratweg trägt zur Verbesserung der NO-vermittelten Signalwege bei, insbesondere im Herz-Kreislauf-System und bei Muskeltraining. Der Nitratgehalt im Körper vor einer solchen Verwertung wird durch zwei verschiedene Quellen bestimmt: endogene NO-Oxidation und Nitrataufnahme über die Nahrung, hauptsächlich aus Pflanzen. Um den komplexen NO-Zyklus unter physiologischen Bedingungen aufzuklären, haben wir die Dynamik seiner Metaboliten, Nitrat- und Nitritionen, die im Vergleich zu NO relativ stabil sind, weiter untersucht. In früheren Studien wurde die Skelettmuskulatur als Hauptspeicherorgan für Nitrationen bei Säugetieren sowie als direkte Quelle von NO während des Trainings identifiziert. Daher ist die Etablierung einer zuverlässigen Methodik zur Messung des Nitrat- und Nitritspiegels in der Skelettmuskulatur wichtig und sollte hilfreich sein, um ihre Anwendung auf andere Gewebeproben auszudehnen. Dieser Artikel erläutert ausführlich die Vorbereitung von Skelettmuskelproben mit drei verschiedenen Homogenisierungsmethoden für Nitrat- und Nitritmessungen und diskutiert wichtige Fragen im Zusammenhang mit Homogenisierungsprozessen, einschließlich der Größe der Proben. Nitrat- und Nitritkonzentrationen wurden auch über vier verschiedene Muskelgruppen hinweg verglichen.

Einleitung

Stickstoffmonoxid (NO), ein kleines gasförmiges Signalmolekül, spielt eine entscheidende Rolle bei physiologischen und pathophysiologischen Prozessen¹. NO kann aus L-Arginin durch endogene Enzyme der Familie der Stickstoffmonoxidsynthase (NOS) hergestellt werden, bevor es einer schnellen Oxidation zu Nitrat (_NO3-) und möglicherweise Nitrit (^NO2-) in Blut und Geweben ^2,3 unterzogen wird. Kürzlich wurde gezeigt, dass diese Anionen in Säugetiersystemen wieder zu NO reduziert werden⁴. Nitrat wird in Nitrit umgewandelt, hauptsächlich durch kommensale bakterielle Nitratreduktasen in der Mundhöhle, die auf Ionen wirken, die von den Speicheldrüsen abgesondert und direkt aufgenommen werden ⁵, und in gewissem Maße durch Säugetierenzyme wie Xanthinoxidoreduktase ^6,7. Nitrit kann durch verschiedene Mechanismen, einschließlich Desoxyhämoglobin⁸, Desoxymyoglobin⁹, molybdänhaltige Enzyme 10 und nicht-enzymatische Reduktion in Gegenwart von Protonen^11,12, weiter zu NO reduziert werden.

Dieser Nitrat-Nitrit-NO-Weg wird unter hypoxischen Bedingungen verstärkt, wobei die NOS-Aktivität verringert wird, da NOS Sauerstoff für die NO-Erzeugung⁴ benötigt. Viele neuere Studien haben positive Auswirkungen von diätetischem Nitrat auf die Blutdruckregulierung und die Trainingsleistung berichtet, was darauf hindeutet, dass Nitratreduktionswege zur Verstärkung der NO-Signalisierung beitragen^13,14,15. Frühere Studien haben gezeigt, dass einige Skelettmuskeln wahrscheinlich die wichtigsten Nitratspeicher im Körper sind¹⁶. Im Vergleich zu Blut oder anderen inneren Organen wie Leber enthält die Skelettmuskulatur (Gluteus maximus) deutlich höhere Nitratwerte und hat eine erhebliche Masse im Säugetierkörper. Es wurde gezeigt, dass Laufbandübungen die Nitratreduktion zu Nitrit und zu NO im Gesäß in einem Rattenmodell⁷ verstärken. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass einige Skelettmuskeln wichtige Quellen für NO durch Nitratreduktionswege in physiologischen Situationen sein könnten. Neuere Studien deuten darauf hin, dass diese Ergebnisse, einschließlich Veränderungen des Muskelnitratspiegels während des Trainings, auch beim Menschen auftreten¹⁷.

Zwei der aktuellen Autoren hatten zuvor eine Methode zur Messung des Nitrat- und Nitritspiegels in Blut und anderen flüssigen Proben etabliert¹⁸. Als jedoch die Konzentrationen dieser Anionen in Gewebehomogenaten zunächst analysiert wurden, waren detaillierte Protokolle nicht verfügbar. Um die Nitrat-Nitrit-NO-Dynamik in verschiedenen Organen zu verstehen, war es unser Ziel, eine genaue und effiziente Methode zur Messung des Nitrat- und Nitritspiegels in Säugetiergeweben einschließlich der Skelettmuskulatur zu entwickeln. In früheren Studien wurden Nagetiergewebe verwendet, um zuverlässige Homogenisierungsprozesse zu entwickeln und dann den Nitrat- und Nitritgehalt in den Homogenaten 7,16,19 zu analysieren. Die Verwendung dieser Homogenisierungsmethode wurde auf menschliche Skelettmuskelbiopsieproben ausgeweitet, wobei die Werte bestätigt wurden und vor allem die für Muskeln im Vergleich zu Blut / Plasma beobachteten Werte in ähnlichen Bereichen und Verhältnissen lagen wie bei Nagetieren¹⁷. In den letzten Jahren haben auch andere Gruppen begonnen, den Nitrat- und Nitritgehalt in Skelettmuskelhomogenaten zu messen, und berichteten über vergleichbare Werte wie die unserer Gruppe^20,21.

Ziel dieses Protokollpapiers ist es, die Herstellung von Skelettmuskelhomogenaten unter Verwendung von drei verschiedenen Homogenisierungsmethoden zur anschließenden Messung des Nitrat- und Nitritgehalts detailliert zu beschreiben. Zusätzlich wurden die Auswirkungen des zur Homogenisierung verwendeten Gewebegewichts auf die Werte von Nitrat und Nitrit in Skelettmuskelproben untersucht. Wir glauben, dass diese Methoden leicht auf andere Arten von Säugetiergeweben angewendet werden können. In jüngster Zeit wurde vor allem im Bereich der Sportphysiologie auf die möglichen Unterschiede in der Nitrat/Nitrit/NO-Physiologie nach Muskelgruppen geachtet. Wir berichten auch die Mengen an Nitrat und Nitrit in vier verschiedenen Nagetiermuskeln und finden eine ungleichmäßige Verteilung beider Ionen zwischen diesen verschiedenen Muskeln; Eine Beobachtung, die weiterer Untersuchungen bedarf.

Protokoll

Das Tierprotokoll wurde vom NIDDK Animal Care and Use Committee (ASP K049-MMB-20) genehmigt. Die Tiere wurden gemäß dem aktuellen Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren behandelt und behandelt, der auf der AAALAC-Website frei verfügbar ist.

1. Sammlung von Skelettmuskeln der Ratte

1. Während eine Ratte unter tiefer Narkose steht (5% Isofluran, bestätigt durch fehlende Reaktion auf Schwanz- / Beinklemmung), beginnen Sie mit der Perfusion mit Heparin-haltiger Kochsalzlösung, indem Sie eine 19-G-Nadel in eine Spitze des linken Ventrikels einführen und einen Nick im rechten Vorhof machen. Kochsalzlösung mit Heparin durch die inneren Organe durchsickern lassen, bis mindestens 1,5 Liter/kg durch das Gewebe geflossen sind. Zu diesem Zeitpunkt sind die Tiere durch Entblutung tot und die Kadaver sind bereit, für die Probenentnahme verarbeitet zu werden.
   HINWEIS: Eine gute Perfusion ist entscheidend, insbesondere für genaue Messungen von Nitrit, da Nitrit durch das verbleibende Hämoglobin zu Nitrat oxidiert wird.
2. Identifizieren Sie Zielmuskelgewebe und entfernen Sie es aus den Hinterbeinen²² mit sauberen chirurgischen Instrumenten. Entfernen Sie so viel Fett und Bindegewebe wie möglich aus dem Muskelgewebe.
3. Legen Sie die gewünschte Muskelmenge in ein Mikrozentrifugenröhrchen und legen Sie sie dann auf Trockeneis. Bewahren Sie die mit Gewebe gefüllten Röhrchen im -80 °C Gefrierschrank auf.
   HINWEIS: Bei menschlichen Biopsieproben sofort nach der Entnahme gründlich mit sauberer Gaze abtupfen, um überschüssiges Blut zu entfernen.

2. Vorbereitung für die Homogenisierung

1. Herstellung einer nitritkonservierenden Lösung (Stopplösung)
   1. Eine klare gelbe Lösung, die 890 mM Kaliumferricyanid (K₃Fe (CN) 6) und 118 mM NEM (N-Ethylmaleimid_{) enthält}, wird in destilliertem Wasser hergestellt, wobei keine Kristalle zu vermeiden sind. Fügen Sie nichtionisches Tensid (Reinigungsmittel) im Verhältnis 1:9 (v/v, Table of Materials) hinzu und mischen Sie vorsichtig, um Schaumbildung zu vermeiden.
   2. Die Stopplösung wird im Verhältnis 1:9 mit destilliertem Wasser verdünnt. Legen Sie die verdünnte Stopplösung (Verhältnis 1:5 von Muskelgewebe zu verdünnter Stopplösung) in das Homogenisierungsröhrchen.
      HINWEIS: Zwanzig Milligramm Gewebe erfordern 100 μL Stop-Lösung und 200 mg Gewebe erfordern 1000 μL Stop-Lösung in der Röhre. Das Vorhandensein von Reinigungsmittel in der zugesetzten Lösung ist entscheidend für die Störung der Zellmembranen. Jedes nichtionische Reinigungsmittel kann verwendet werden, aber es muss darauf geachtet werden, dass es die Chemilumineszenzmethode nicht stört.
2. Gewebepräparation
   1. Das Gewebe aus dem -80 °C Gefrierschrank nehmen und langsam in Eis auftauen. Entfernen Sie das restliche Fett und Bindegewebe aus der Skelettmuskulatur. Schneiden Sie Stücke der Skelettmuskulatur ab und tupfen Sie sie zum Trocknen auf Gaze.
   2. Wiegen Sie die Menge an Gewebe (20, 50 und 200 mg). Legen Sie den vorgewogenen Skelettmuskel in die Stop-Lösung in den Homogenisierungsröhrchen oder legen Sie das vorgewogene Gewebe zur späteren Verwendung in ein sauberes Mikrozentrifugenröhrchen.

3. Homogenisierung

1. Rotationshomogenisator (Abbildung 1)
   1. Setzen Sie das M-Typ-Röhrchen mit der vorgewogenen Skelettmuskulatur und der vorgemessenen Stopplösung in das Gerät ein. Homogenisieren Sie jede Probe zweimal (Einstellung auf den zerstörerischsten Homogenisierungszyklus) und legen Sie das Röhrchen unmittelbar nach jeder Homogenisierung für 5 min zum Abkühlen auf Eis.
   2. Bei 2.000 × g und 4 °C 5 min kurz zentrifugieren. Legen Sie das volle Röhrchen wieder auf Eis und fügen Sie die entsprechende Menge Methanol hinzu (≥ 99,9 %, 10x des Gewebegewichts). Wirbel gründlich für 15 s.
      HINWEIS: Verwenden Sie für 20 mg Gewebe 200 μL Methanol. Methanol wird verwendet, um Proteine aus Gewebehomogenat auszufällen und stört die Chemilumineszenzmethode nicht. Wenn eine andere Proteinfällungsmethode verwendet wird, testen Sie die Kompatibilität mit Chemilumineszenz.
   3. Noch einmal homogenisieren und 30 min auf Eis inkubieren. Zentrifugieren Sie die Proben für 35 min bei 4 °C und 3.500 × g. Saugen Sie den Überstand ab und messen Sie den Nitrit-/Nitratgehalt oder lagern Sie ihn bei -80 °C für den späteren Gebrauch.
2. Perlenhomogenisator (Abbildung 2)
   1. Legen Sie das Skelettmuskelgewebe in ein perlenhaltiges Röhrchen (Verhältnis 1:5 für Gewebe: verdünnte Stopplösung) und homogenisieren Sie zweimal für 45 s bei der höchsten Geschwindigkeit, die auf dem verwendeten Instrument verfügbar ist. Legen Sie das Röhrchen sofort nach jeder Homogenisierung für 5 min zum Abkühlen auf Eis.
   2. Mit einer kleinen Tischzentrifuge (2.000 x g) 5 Sek. kurz zentrifugieren. Legen Sie das Röhrchen wieder auf Eis und fügen Sie eine entsprechende Menge Methanol hinzu (Reinheit ≥ 99,9 %, 10x des Gewebegewichts). Wirbel gründlich für 15 s.
      ANMERKUNG 1: Verwenden Sie für 20 mg Gewebe 200 μL Methanol.
      ANMERKUNG 2: Methanol wird verwendet, um Proteine aus Gewebehomogenat auszufällen und stört nicht die Chemilumineszenzmethode. Wenn eine andere Proteinfällungsmethode verwendet wird, testen Sie die Kompatibilität mit Chemilumineszenz.
   3. Homogenisieren Sie erneut für 45 s bei der höchsten Geschwindigkeit, die mit dem verwendeten Gerät verfügbar ist. Auf Eis 30 min inkubieren. Zentrifuge bei 17.000 x g, 4 °C, 30 min. Saugen Sie den Überstand ab und messen Sie den Nitrit-/Nitratgehalt oder lagern Sie ihn bei -80 °C für den späteren Gebrauch.
3. Pulverisierer (Abbildung 3)
   1. Bereiten Sie Röhrchen mit verdünnter Stopplösung (5x des Gewebegewichts) vor und wiegen Sie sie. Notieren Sie das Gewicht (Schlauch + Anschlaglösung).
   2. Legen Sie das Flüssigstickstoffpulverwerkzeug auf Trockeneis und warten Sie ca. 30 Minuten, bis es die gewünschte Temperatur erreicht hat.
   3. Mit einer in flüssigem Stickstoff gekühlten Pinzette eine Probe (bereits gemessenes Gewebegewicht) in den Pulverisierer überführen. Fügen Sie einen kleinen Löffel flüssigen Stickstoff hinzu, um sicherzustellen, dass das Gewebe bei flüssiger Stickstofftemperatur ist.
   4. Nachdem 95% des flüssigen Stickstoffs verdampft sind, legen Sie das Zerkleinerungswerkzeug auf das Gewebe und drücken Sie fest. Sie sollten die Probe zerquetschen fühlen. Schlagen Sie mit dem Schlägel 3-5x auf das Brechwerkzeug.
   5. Überprüfen Sie die Probe mit einem in flüssigem Stickstoff gekühlten Löffel auf verbleibende Stücke. Nach dem Abkühlen in flüssigem Stickstoff verwenden Sie ein Stück Seidenpapier, um gefrorenes Wasser abzuwischen, bevor Sie das Gewebe berühren. Wenn ein Stück vorhanden ist, bewegen Sie es in die Mitte und schlagen Sie dann 5-6 weitere Male mit dem Schlägel.
   6. Wenn die gesamte Probe pulverisiert wurde, wird das zerkleinerte Gewebe mit dem mit flüssigem Stickstoff gekühlten Löffel direkt in das vorgewogene Röhrchen mit der verdünnten Stopplösung überführt (Schritt 3.3.1). Stellen Sie sicher, dass Sie diesen Schritt schnell ausführen, denn wenn sich der zerquetschte Skelettmuskel erwärmt, wird er klebrig und schwer zu übertragen.
   7. Wirbel für 15 s. Stellen Sie sicher, dass kein Gewebe an der Oberseite des Röhrchens steckt, indem Sie das Röhrchen öffnen. Wenn ja, versuchen Sie, es zu entfernen und dann wieder zu wirbeln.
   8. Zentrifugieren Sie die Probe für 2-3 s mit einer kleinen Tischzentrifuge. Wiegen Sie das Röhrchen erneut. Berechnen Sie das Gewebegewicht, indem Sie das ursprüngliche Schlauchgewicht (Schritt 3.3.1) von diesem neuen Gewicht abziehen. Legen Sie die Röhre auf Eis.
      HINWEIS: Die genauen Gewichte helfen, das genaue Gewebegewicht zu bestimmen und wie viel Gewebe während der Pulverisierung verloren ging.
   9. Nachdem alle Proben bis Schritt 3.3.8 verarbeitet wurden, wird ein geeignetes Volumen Methanol (≥ 99,9 %, 10x des Gewebegewichts) hinzugefügt. 15 s gründlich durchziehen und 30 min auf Eis inkubieren.
      HINWEIS: Verwenden Sie für 20 mg Gewebe 200 μL Methanol. Methanol wird verwendet, um Proteine aus Gewebehomogenat auszufällen und stört die Chemilumineszenzmethode nicht. Wenn eine andere Proteinfällungsmethode verwendet wird, testen Sie die Kompatibilität mit Chemilumineszenz.
   10. Zentrifuge bei 17.000 × g, 4 °C, 30 min. Saugen Sie den Überstand ab und messen Sie den Nitrit-/Nitratgehalt oder lagern Sie ihn bei -80 °C für die spätere Verwendung.

4. Nitrit/Nitrat-Messung mit Stickstoffmonoxid-Analysator (NOA)

1. Bereiten Sie alle Proben mit einer der drei verschiedenen oben beschriebenen Homogenisierungsmethoden vor und injizieren Sie sie in eine NOA für die Nitrat- und Nitritmessung.
   HINWEIS: Detaillierte Protokolle für die NOA-Verwendung wurden zuvor^{veröffentlicht 19}.

Ergebnisse

Um repräsentative Ergebnisse zu erhalten, wurde Skelettmuskelgewebe von 8 Wistar-Ratten (Männchen und Weibchen, Gewicht 250 ± 50 g) verwendet. Ratten-Skelettmuskelhomogenate (50 mg Musculus gluteus maximus für jede Methode) wurden mit drei verschiedenen Homogenisierungswerkzeugen (rotierender Homogenisator, Perlenhomogenisator und Pulverisierer) hergestellt. Die Nitrat- und Nitritgehalte dieser Homogenate wurden dann mit einem Stickstoffmonoxid-Analysator (NOA) bestimmt (Abbildung 4). Di...

Diskussion

Um Veränderungen der NO-Metaboliten, Nitrat und Nitrit, in Abhängigkeit von physiologischen Eingriffen zu überwachen, ist es unerlässlich, die Spiegel dieser Ionen in den verschiedenen Organen zu messen, die für ihren Stoffwechsel entscheidend sind. Da Hämoglobin im Blut mit NO und seinen Metaboliten reagiert, ist es auch wichtig, Blut so schnell wie möglich aus Gewebeproben zu entfernen. So wurden die Tiere mit Kochsalzlösung perfundiert, bevor sie Skelettmuskelgewebe (Gesäß, TA, EDL, Gastrocnemius-Muskel) sam...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
gentleMACS dissociator	Miltenyi Biotec	130-093-235
gentle MACS M tube	Miltenyi Biotec	130-093-236	Length: 87 mm; Diameter: 30 mm
Heparin Sodium	Hospira	NDC-0409-7620-13
Isoflurane	Baxter	NDC-10019-360-60
Methanol	Sigma	646377
Minilys bead homogenizer	Bertin Instruments	P000673-MLYS0-A
NEM; N-ethylmaleimide	Sigma	4260
Nitric Oxide analyzer	GE	Sievers NOA 280i
NP-40; 4-Nonylphenylpolyethylene glycol	Sigma	74385
Potassium ferricyanide; K3Fe(CN)6	Sigma	702587
Precellys lysing kit	Bertin Instruments	P000911-LYSK0-A	contains 2 mL tubes with 2.8 mm ceramic (zirconium oxide) beads for homogenization
Pulverizer kit	Cellcrusher	Cellcrusher kit