Preparazione di omogenati muscolari scheletrici di ratto per misurazioni di nitrati e nitriti

Riepilogo

Presentiamo protocolli per tre diversi metodi per l'omogeneizzazione di quattro diversi gruppi muscolari di tessuto muscolare scheletrico di ratto per misurare e confrontare i livelli di nitrati e nitriti. Inoltre, confrontiamo diversi pesi del campione per indagare se la dimensione del campione di tessuto influisce sui risultati dell'omogeneizzazione.

Abstract

Una volta si pensava che gli ioni nitrato (NO₃^-) fossero prodotti finali inerti del metabolismo dell'ossido nitrico (NO). Tuttavia, studi precedenti hanno dimostrato che gli ioni nitrato possono essere riconvertiti in NO nei mammiferi attraverso un meccanismo di riduzione in due fasi: il nitrato viene ridotto a nitrito (NO₂^-) principalmente dai batteri commensali orali, quindi il nitrito viene ridotto a NO da diversi meccanismi, tra cui proteine contenenti eme o molibdeno. Questa via riduttiva dei nitrati contribuisce a migliorare le vie di segnalazione NO-mediate, in particolare nel sistema cardiovascolare e durante l'esercizio muscolare. I livelli di nitrato nell'organismo prima di tale utilizzo sono determinati da due diverse fonti: l'ossidazione endogena di NO e l'assunzione di nitrati nella dieta, principalmente dalle piante. Per chiarire il complesso ciclo dell'NO in circostanze fisiologiche, abbiamo esaminato ulteriormente la dinamica dei suoi metaboliti, nitrati e ioni nitriti, che sono relativamente stabili rispetto a NO. In studi precedenti il muscolo scheletrico è stato identificato come un importante organo di stoccaggio per gli ioni nitrato nei mammiferi, nonché una fonte diretta di NO durante l'esercizio. Pertanto, stabilire una metodologia affidabile per misurare i livelli di nitrati e nitriti nel muscolo scheletrico è importante e dovrebbe essere utile per estenderne l'applicazione ad altri campioni di tessuto. Questo articolo spiega in dettaglio la preparazione di campioni di muscolo scheletrico, utilizzando tre diversi metodi di omogeneizzazione, per misure di nitrati e nitriti e discute importanti questioni relative ai processi di omogeneizzazione, compresa la dimensione dei campioni. Le concentrazioni di nitrati e nitriti sono state confrontate anche in quattro diversi gruppi muscolari.

Introduzione

L'ossido nitrico (NO), una piccola molecola di segnalazione gassosa, svolge un ruolo critico nei processi fisiologici e fisiopatologici¹. L'NO può essere prodotto dalla L-arginina da enzimi endogeni della famiglia delle ossidi nitrici sintasi (NOS) prima di subire una rapida ossidazione a nitrato (NO 3-) e, possibilmente, nitrito (NO 2^-) nel sangue e nei tessuti ^2,3. Recentemente, questi anioni hanno dimostrato di essere ridotti a NO nei sistemi di mammiferi⁴. Il nitrato viene convertito in nitrito, principalmente dalle nitrati reduttasi batteriche commensali nella cavità orale che agiscono sugli ioni secreti dalle ghiandole salivari e ingeriti direttamente ⁵ e, in una certa misura, dagli enzimi dei mammiferi come la xantina ossidoreduttasi ^6,7. Il nitrito può essere ulteriormente ridotto a NO da diversi meccanismi tra cui la deossiemoglobina⁸, la desossimioglobina⁹, gli enzimi contenenti molibdeno 10 e la riduzione non enzimatica in presenza di protoni^11,12.

Questa via nitrato-nitrito-NO è migliorata in condizioni ipossiche in cui l'attività NOS è diminuita perché NOS richiede ossigeno per la generazione di NO⁴. Molti studi recenti hanno riportato effetti benefici del nitrato alimentare sulla regolazione della pressione sanguigna e sulle prestazioni fisiche, suggerendo che i percorsi di riduzione dei nitrati contribuiscono all'aumento della segnalazione NO^13,14,15. Studi precedenti hanno dimostrato che alcuni muscoli scheletrici sono probabilmente i principali luoghi di stoccaggio dei nitrati nel corpo¹⁶. Rispetto al sangue o ad altri organi interni come il fegato, il muscolo scheletrico (gluteus maximus) contiene livelli significativamente più elevati di nitrato e ha una massa sostanziale nel corpo dei mammiferi. L'esercizio del tapis roulant ha dimostrato di migliorare la riduzione dei nitrati a nitriti e a NO nei glutei in un modello di ratto⁷. Questi risultati implicano che alcuni muscoli scheletrici potrebbero essere importanti fonti di NO attraverso percorsi di riduzione dei nitrati in situazioni fisiologiche. Studi più recenti suggeriscono che questi risultati, compresi i cambiamenti nei livelli di nitrati muscolari durante l'esercizio, si verificano anche negli esseri umani¹⁷.

Due degli attuali autori avevano precedentemente stabilito un metodo per misurare i livelli di nitrati e nitriti nel sangue e in altri campioni liquidi¹⁸. Tuttavia, quando i livelli di questi anioni negli omogenati tissutali sono stati inizialmente analizzati, non erano disponibili protocolli dettagliati. Per comprendere le dinamiche nitrati-nitriti-NO in diversi organi, il nostro obiettivo era quello di sviluppare un metodo accurato ed efficiente per misurare i livelli di nitrati e nitriti nei tessuti dei mammiferi, incluso il muscolo scheletrico. In studi precedenti, i tessuti dei roditori sono stati utilizzati per sviluppare processi di omogeneizzazione affidabili e quindi analizzare il contenuto di nitrati e nitriti in quegli omogenati 7,16,19. L'uso di questo metodo di omogeneizzazione è stato esteso ai campioni di biopsia del muscolo scheletrico umano, per cui i valori sono stati confermati e, soprattutto, i valori osservati per il muscolo rispetto al sangue / plasma erano in intervalli e rapporti simili a quelli osservati nei roditori¹⁷. Negli ultimi anni, anche altri gruppi hanno iniziato a misurare i livelli di nitrati e nitriti negli omogenati muscolari scheletrici, riportando valori comparabili a quelli riportati dal nostro gruppo^20,21.

Lo scopo di questo documento protocollare è quello di descrivere in dettaglio la preparazione di omogenati muscolari scheletrici utilizzando tre diversi metodi di omogeneizzazione per la successiva misurazione dei livelli di nitrati e nitriti. Inoltre, sono stati esaminati gli effetti del peso tissutale utilizzato per l'omogeneizzazione sui valori di nitrati e nitriti nei campioni di muscolo scheletrico. Crediamo che questi metodi possano essere facilmente applicati ad altri tipi di tessuti di mammiferi. Recentemente, soprattutto nel campo della fisiologia dell'esercizio, è stata prestata attenzione alle possibili differenze nella fisiologia nitrati/nitriti/NO in base ai gruppi muscolari. Riportiamo anche le quantità di nitrati e nitriti in quattro diversi muscoli dei roditori e troviamo una distribuzione non uniforme di entrambi gli ioni tra questi diversi muscoli; un'osservazione che richiede ulteriori studi.

Protocollo

Il protocollo sugli animali è stato approvato dal NIDDK Animal Care and Use Committee (ASP K049-MMB-20). Gli animali sono stati trattati secondo l'attuale Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio disponibile gratuitamente sul sito web AAALAC.

1. Raccolta del muscolo scheletrico del ratto

1. Mentre un ratto è in anestesia profonda (isoflurano al 5%, confermato dalla reazione assente al pizzico della coda/gamba), iniziare la perfusione con soluzione salina contenente eparina posizionando un ago da 19 G in un apice del ventricolo sinistro e facendo un nick sull'atrio destro. Lasciare penetrare la soluzione salina con eparina attraverso gli organi interni fino a quando almeno 1,5 litri / kg sono fluiti attraverso il tessuto. A questo punto, gli animali sono morti per dissanguamento e le carcasse sono pronte per essere lavorate per la raccolta dei campioni.
   NOTA: Ottenere una buona perfusione è fondamentale, soprattutto per misurazioni accurate del nitrito, perché il nitrito viene ossidato in nitrato da qualsiasi emoglobina residua.
2. Identificare i tessuti muscolari bersaglio e asportarli dalle zampe posteriori²² utilizzando strumenti chirurgici puliti. Rimuovere quanto più grasso e tessuti connettivi dai tessuti muscolari possibile.
3. Posizionare la quantità desiderata di muscolo in un tubo di microcentrifuga e quindi posizionare su ghiaccio secco. Conservare le provette piene di fazzoletto di carta nel congelatore a -80 °C.
   NOTA: In caso di campioni di biopsia umana, asciugarli accuratamente immediatamente dopo la raccolta con una garza pulita per rimuovere il sangue in eccesso.

2. Preparazione per l'omogeneizzazione

1. Preparazione della soluzione che preserva i nitriti (soluzione di arresto)
   1. Preparare una soluzione gialla limpida contenente 890 mM di ferricianuro di potassio (K₃Fe(CN)₆) e 118 mM NEM (N-etilmaleimide) in acqua distillata, assicurandosi che non si formino cristalli. Aggiungere tensioattivi non ionici (detergente) in rapporto 1:9 (v/v, tabella dei materiali) e mescolare delicatamente per evitare la formazione di schiuma.
   2. Diluire la soluzione di arresto in un rapporto 1:9 con acqua distillata. Posizionare la soluzione di arresto diluita (rapporto 1:5 tra tessuto muscolare e soluzione di arresto diluita) nel tubo di omogeneizzazione.
      NOTA: Venti milligrammi di tessuto richiederanno 100 μL di soluzione di arresto e 200 mg di tessuto richiederanno 1000 μL di soluzione di arresto nel tubo. La presenza di detergente nella soluzione aggiunta è fondamentale per la rottura delle membrane cellulari. È possibile utilizzare qualsiasi detergente non ionico, ma è necessario prestare attenzione per verificare che non interferisca con il metodo di chemiluminescenza.
2. Preparazione dei tessuti
   1. Estrarre il fazzoletto dal congelatore a -80 °C e scongelarlo lentamente nel ghiaccio. Rimuovere il grasso rimanente e il tessuto connettivo dal muscolo scheletrico. Tagliare pezzi di muscolo scheletrico e asciugare su una garza per asciugare.
   2. Pesare la quantità di tessuto (20, 50 e 200 mg). Posizionare il muscolo scheletrico prepesato nella soluzione di arresto nei tubi di omogeneizzazione o posizionare il tessuto prepesato in una provetta di microcentrifuga pulita per un uso successivo.

3. Omogeneizzazione

1. Omogeneizzatore rotativo (Figura 1)
   1. Inserire nella macchina il tubo di tipo M contenente il muscolo scheletrico prepesato e la soluzione di arresto premisurata. Omogeneizzare ogni campione due volte (impostando il ciclo di omogeneizzazione più distruttivo) e posizionare il tubo sul ghiaccio immediatamente dopo ogni omogeneizzazione per 5 minuti per raffreddare.
   2. Centrifugare brevemente a 2.000 × g e 4 °C per 5 min. Rimettere il tubo pieno sul ghiaccio e aggiungere il volume appropriato di metanolo (≥ 99,9%, 10x del peso del tessuto). Vortice accuratamente per 15 s.
      NOTA: Per 20 mg di tessuto, utilizzare 200 μL di metanolo. Il metanolo viene utilizzato per precipitare le proteine dall'omogenato tissutale e non interferisce con il metodo di chemiluminescenza. Se viene utilizzato un altro metodo di precipitazione proteica, verificarne la compatibilità con la chemiluminescenza.
   3. Omogeneizzare ancora una volta e incubare su ghiaccio per 30 minuti. Centrifugare i campioni per 35 minuti a 4 °C e 3.500 × g. Aspirare il surnatante e misurare i livelli di nitriti/nitrati o conservare a -80 °C per un uso successivo.
2. Omogeneizzatore di perline (Figura 2)
   1. Porre il tessuto muscolare scheletrico in un tubo contenente perline (rapporto 1:5 per la soluzione di arresto diluito del tessuto) e omogeneizzare due volte per 45 s alla massima velocità disponibile sullo strumento utilizzato. Posizionare il tubo sul ghiaccio immediatamente dopo ogni omogeneizzazione per 5 minuti per raffreddare.
   2. Centrifugare brevemente utilizzando una piccola centrifuga da tavolo (2.000 x g) per 5 secondi. Rimettere il tubo sul ghiaccio e aggiungere un volume appropriato di metanolo (purezza ≥ 99,9%, 10x del peso del tessuto). Vortice accuratamente per 15 s.
      NOTA 1: Per 20 mg di tessuto, utilizzare 200 μL di metanolo.
      NOTA 2: Il metanolo viene utilizzato per precipitare le proteine dall'omogenato tissutale e non interferisce con il metodo della chemiluminescenza. Se viene utilizzato un altro metodo di precipitazione proteica, verificarne la compatibilità con la chemiluminescenza.
   3. Omogeneizzare ancora una volta per 45 s alla massima velocità disponibile sullo strumento utilizzato. Incubare su ghiaccio per 30 min. Centrifugare a 17.000 x g, 4 °C, 30 min. Aspirare il surnatante e misurare i livelli di nitriti/nitrati o conservare a -80 °C per un uso successivo.
3. Polverizzatore (Figura 3)
   1. Preparare provette contenenti soluzione di arresto diluita (5x del peso del tessuto) e pesarle. Registrare il peso (tubo + soluzione di arresto).
   2. Posizionare lo strumento polverizzatore di azoto liquido su ghiaccio secco e attendere circa 30 minuti affinché raggiunga la temperatura desiderata.
   3. Utilizzando una pinzetta raffreddata in azoto liquido, trasferire un campione (peso del tessuto già misurato) al polverizzatore. Aggiungere un cucchiaino di azoto liquido per assicurarsi che il tessuto sia alla temperatura dell'azoto liquido.
   4. Dopo che il 95% dell'azoto liquido si è vaporizzato, posizionare lo strumento di frantumazione sopra il tessuto e premere con fermezza. Dovresti sentire la schiacciata del campione. Usando il mazzuolo, colpire lo strumento di frantumazione 3-5x.
   5. Controllare il campione per eventuali pezzi rimanenti usando un cucchiaio raffreddato in azoto liquido. Dopo il raffreddamento in azoto liquido, utilizzare un pezzo di carta velina per rimuovere l'acqua congelata prima di toccare il tessuto. Se è presente un pezzo, spostalo al centro e poi colpisci altre 5-6 volte con il mazzuolo.
   6. Quando l'intero campione è stato polverizzato, utilizzare il cucchiaio liquido raffreddato ad azoto per trasferire direttamente il tessuto frantumato nel tubo prepesato contenente la soluzione di arresto diluita (fase 3.3.1). Assicurati di eseguire rapidamente questo passaggio poiché quando il muscolo scheletrico schiacciato si riscalda, diventa appiccicoso e difficile da trasferire.
   7. Vortice per 15 s. Controllare che nessun tessuto sia bloccato nella parte superiore del tubo aprendo il tubo. Se c'è, prova a spostarlo e poi vortice di nuovo.
   8. Centrifugare il campione per 2-3 s utilizzando una piccola centrifuga desktop. Pesare di nuovo il tubo. Calcolare il peso del tessuto deducendo il peso originale del tubo (fase 3.3.1) da questo nuovo peso. Posizionare il tubo sul ghiaccio.
      NOTA: I pesi esatti aiuteranno a determinare il peso esatto del tessuto e la quantità di tessuto persa durante la polverizzazione.
   9. Una volta che tutti i campioni sono stati trattati fino alla fase 3.3.8, aggiungere un volume appropriato di metanolo (≥ 99,9 %, 10 volte il peso del tessuto). Vortice accuratamente per 15 s e incubare su ghiaccio per 30 minuti.
      NOTA: Per 20 mg di tessuto, utilizzare 200 μL di metanolo. Il metanolo viene utilizzato per precipitare le proteine dall'omogenato tissutale e non interferisce con il metodo di chemiluminescenza. Se viene utilizzato un altro metodo di precipitazione proteica, verificarne la compatibilità con la chemiluminescenza.
   10. Centrifugare a 17.000 × g, 4 °C, 30 min. Aspirare il surnatante e misurare i livelli di nitriti/nitrati o conservare a -80 °C per un uso successivo.

4. Misurazione di nitriti/nitrati con analizzatore di ossido nitrico (NOA)

1. Preparare tutti i campioni con uno dei tre diversi metodi di omogeneizzazione sopra descritti e iniettarli in un NOA per la misurazione di nitrati e nitriti.
   NOTA: I protocolli dettagliati per l'uso di NOA sono stati pubblicati in precedenza¹⁹.

Risultati

Per ottenere risultati rappresentativi, sono stati utilizzati tessuti muscolari scheletrici di 8 ratti Wistar (maschi e femmine, peso 250 ± 50 g). Gli omogenati del muscolo scheletrico del ratto (50 mg di muscolo gluteo massimo per ciascun metodo) sono stati preparati da tre diversi strumenti di omogeneizzazione (omogeneizzatore rotante, omogeneizzatore di perline e polverizzatore). Il contenuto di nitrati e nitriti di questi omogenati è stato quindi determinato utilizzando un analizzatore di ossido nitrico (NOA) (

Discussione

Per monitorare i cambiamenti nei metaboliti di NO, nitrati e nitriti, in funzione degli interventi fisiologici, è imperativo misurare i livelli di questi ioni nei diversi organi che sono critici nel loro metabolismo. Poiché l'emoglobina nel sangue reagisce con NO e i suoi metaboliti, è anche importante rimuovere rapidamente il sangue dai campioni di tessuto il più possibile. Così gli animali sono stati perfusi con soluzione salina prima di raccogliere i tessuti muscolari scheletrici (glutei, TA, EDL, muscolo gastroc...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
gentleMACS dissociator	Miltenyi Biotec	130-093-235
gentle MACS M tube	Miltenyi Biotec	130-093-236	Length: 87 mm; Diameter: 30 mm
Heparin Sodium	Hospira	NDC-0409-7620-13
Isoflurane	Baxter	NDC-10019-360-60
Methanol	Sigma	646377
Minilys bead homogenizer	Bertin Instruments	P000673-MLYS0-A
NEM; N-ethylmaleimide	Sigma	4260
Nitric Oxide analyzer	GE	Sievers NOA 280i
NP-40; 4-Nonylphenylpolyethylene glycol	Sigma	74385
Potassium ferricyanide; K3Fe(CN)6	Sigma	702587
Precellys lysing kit	Bertin Instruments	P000911-LYSK0-A	contains 2 mL tubes with 2.8 mm ceramic (zirconium oxide) beads for homogenization
Pulverizer kit	Cellcrusher	Cellcrusher kit