Préparation d’homogénats de muscles squelettiques de rat pour les mesures de nitrates et de nitrites

Résumé

Nous présentons des protocoles pour trois méthodes différentes d’homogénéisation de quatre groupes musculaires différents de tissu musculaire squelettique de rat afin de mesurer et de comparer les niveaux de nitrate et de nitrite. De plus, nous comparons différents poids d’échantillon pour déterminer si la taille de l’échantillon de tissu affecte les résultats de l’homogénéisation.

Résumé

On pensait autrefois que les ions nitrate (NO₃^-) étaient des produits finaux inertes du métabolisme de l’oxyde nitrique (NO). Cependant, des études antérieures ont démontré que les ions nitrate peuvent être reconvertis en NO chez les mammifères par un mécanisme de réduction en deux étapes: le nitrate étant réduit en nitrite (NO₂^-) principalement par des bactéries commensales orales, puis le nitrite étant réduit en NO par plusieurs mécanismes, y compris via des protéines contenant de l’hème ou du molybdène. Cette voie réductrice du nitrate contribue à améliorer les voies de signalisation médiées par le NO, en particulier dans le système cardiovasculaire et pendant l’exercice musculaire. Les niveaux de nitrate dans l’organisme avant cette utilisation sont déterminés par deux sources différentes: l’oxydation endogène du NO et l’apport alimentaire en nitrates, principalement à partir de plantes. Pour élucider le cycle complexe du NO dans des circonstances physiologiques, nous avons examiné plus en détail la dynamique de ses métabolites, les ions nitrate et nitrite, qui sont relativement stables par rapport au NO. Dans des études antérieures, le muscle squelettique a été identifié comme un organe de stockage majeur pour les ions nitrate chez les mammifères, ainsi qu’une source directe de NO pendant l’exercice. Par conséquent, l’établissement d’une méthodologie fiable pour mesurer les niveaux de nitrate et de nitrite dans le muscle squelettique est important et devrait être utile pour étendre son application à d’autres échantillons de tissus. Cet article explique en détail la préparation d’échantillons de muscles squelettiques, à l’aide de trois méthodes d’homogénéisation différentes, pour les mesures de nitrate et de nitrite et aborde des questions importantes liées aux processus d’homogénéisation, y compris la taille des échantillons. Les concentrations de nitrate et de nitrite ont également été comparées dans quatre groupes musculaires différents.

Introduction

L’oxyde nitrique (NO), une petite molécule de signalisation gazeuse, joue un rôle essentiel dans les processus physiologiques et physiopathologiques¹. Le NO peut être produit à partir de la L-arginine par des enzymes endogènes de la famille des oxydes nitriques synthases (NOS) avant de subir une oxydation rapide en nitrate (NO 3-) et, éventuellement, en nitrite (NO 2^-) dans le sang et les tissus ^2,3. Récemment, il a été démontré que ces anions sont réduits à NO dans les systèmes de mammifères⁴. Le nitrate est converti en nitrite, principalement par les nitrates réductases bactériennes commensales dans la cavité buccale agissant sur les ions sécrétés par les glandes salivaires et directement ingérés ⁵, et dans une certaine mesure, par des enzymes de mammifères telles que la xanthine oxydoréductase ^6,7. Le nitrite peut être réduit en NO par plusieurs mécanismes, y compris la désoxyhémoglobine⁸, la désoxymyoglobine⁹, les enzymes contenant du molybdène 10 et la réduction non enzymatique en présence de protons^11,12.

Cette voie nitrate-nitrite-NO est améliorée dans des conditions hypoxiques où l’activité NOS est diminuée parce que NOS a besoin d’oxygène pour la génération^{de NO 4}. De nombreuses études récentes ont rapporté des effets bénéfiques du nitrate alimentaire sur la régulation de la pression artérielle et la performance physique, suggérant que les voies de réduction des nitrates contribuent à l’augmentation de la signalisation du NO^13,14,15. Des études antérieures ont montré que certains muscles squelettiques sont probablement les principaux lieux de stockage des nitrates dans le corps¹⁶. Comparé au sang ou à d’autres organes internes tels que le foie, le muscle squelettique (grand fessier) contient des niveaux significativement plus élevés de nitrate et a une masse substantielle dans le corps des mammifères. Il a été démontré que l’exercice sur tapis roulant améliorait la réduction des nitrates en nitrite et en NO dans les fessiers chez un rat modèle⁷. Ces résultats impliquent que certains muscles squelettiques pourraient être des sources importantes de NO par des voies de réduction des nitrates dans des situations physiologiques. Des études plus récentes suggèrent que ces résultats, y compris les changements dans les niveaux de nitrate musculaire pendant l’exercice, se produisent également chez les humains¹⁷.

Deux des auteurs actuels avaient déjà établi une méthode pour mesurer les niveaux de nitrate et de nitrite dans les échantillons de sang et d’autres liquides¹⁸. Cependant, lorsque les niveaux de ces anions dans les homogénats tissulaires ont été initialement analysés, les protocoles détaillés n’étaient pas disponibles. Pour comprendre la dynamique nitrate-nitrite-NO dans plusieurs organes différents, notre objectif était de développer une méthode précise et efficace pour mesurer les niveaux de nitrate et de nitrite dans les tissus de mammifères, y compris le muscle squelettique. Dans des études antérieures, des tissus de rongeurs ont été utilisés pour développer des processus d’homogénéisation fiables, puis analyser les teneurs en nitrates et nitrites dans ces homogénats 7,16,19. L’utilisation de cette méthode d’homogénéisation a été étendue aux échantillons de biopsie du muscle squelettique humain, où les valeurs ont été confirmées et, surtout, les valeurs observées pour le muscle par rapport au sang / plasma étaient dans des plages et des rapports similaires à ceux observés chez les rongeurs¹⁷. Au cours des dernières années, d’autres groupes ont également commencé à mesurer les niveaux de nitrates et de nitrites dans les homogénats des muscles squelettiques, rapportant des valeurs comparables à celles rapportées par notre groupe^20,21.

Le but de ce document de protocole est de décrire en détail la préparation d’homogénats de muscles squelettiques en utilisant trois méthodes d’homogénéisation différentes pour la mesure ultérieure des niveaux de nitrate et de nitrite. De plus, les effets du poids tissulaire utilisé pour l’homogénéisation sur les valeurs de nitrate et de nitrite dans les échantillons de muscles squelettiques ont été examinés. Nous croyons que ces méthodes peuvent être facilement appliquées à d’autres types de tissus de mammifères. Récemment, en particulier dans le domaine de la physiologie de l’exercice, une attention particulière a été accordée aux différences possibles de physiologie nitrate/nitrite/NO selon les groupes musculaires. Nous rapportons également les quantités de nitrate et de nitrite dans quatre muscles de rongeurs différents et trouvons une distribution non uniforme des deux ions entre ces différents muscles; une observation qui nécessite une étude plus approfondie.

Protocole

Le protocole animal a été approuvé par le Comité de soin et d’utilisation des animaux du NIDDK (ASP K049-MMB-20). Les animaux ont été manipulés et traités conformément au Guide de soin et d’utilisation des animaux de laboratoire disponible gratuitement sur le site Web de l’AAALAC.

1. Collection de muscles squelettiques de rat

1. Pendant qu’un rat est sous anesthésie profonde (isoflurane à 5%, confirmée par l’absence de réaction au pincement de la queue / de la jambe), commencez la perfusion avec une solution saline contenant de l’héparine en plaçant une aiguille de 19 G dans un apex du ventricule gauche et en faisant une entaille sur l’oreillette droite. Laisser une solution saline contenant de l’héparine perfuser à travers les organes internes jusqu’à ce qu’au moins 1,5 litre / kg ait circulé dans les tissus. À ce stade, les animaux sont morts de l’exsanguination et les carcasses sont prêtes à être traitées pour le prélèvement d’échantillons.
   REMARQUE: Il est essentiel d’obtenir une bonne perfusion, en particulier pour des mesures précises du nitrite, car le nitrite est oxydé en nitrate par l’hémoglobine restante.
2. Identifier les tissus musculaires cibles et les exciser des pattes postérieures²² à l’aide d’instruments chirurgicaux propres. Enlevez autant de graisse et de tissus conjonctifs des tissus musculaires que possible.
3. Placez la quantité désirée de muscle dans un tube microcentrifugeux, puis placez-la sur de la glace sèche. Conservez les tubes remplis de tissu dans le congélateur à -80 °C.
   REMARQUE: Dans le cas d’échantillons de biopsie humaine, épongez-les soigneusement immédiatement après le prélèvement avec de la gaze propre pour éliminer l’excès de sang.

2. Préparation à l’homogénéisation

1. Préparation d’une solution préservant les nitrites (solution stop)
   1. Préparer une solution jaune clair contenant 890 mM de ferricyanure de potassium (K₃Fe(CN)₆) et 118 mM NEM (N-éthylmaléimide) dans de l’eau distillée, en veillant à ce qu’il n’y ait pas de cristaux. Ajouter un tensioactif non ionique (détergent) dans un rapport de 1:9 (v/v, Tableau des matériaux) et mélanger doucement pour éviter la formation de mousse.
   2. Diluer la solution stop dans un rapport de 1:9 avec de l’eau distillée. Placer la solution d’arrêt diluée (rapport 1:5 entre le tissu musculaire et la solution d’arrêt diluée) dans le tube d’homogénéisation.
      REMARQUE: Vingt milligrammes de tissu nécessiteront 100 μL de solution d’arrêt et 200 mg de tissu nécessiteront 1000 μL de solution d’arrêt dans le tube. La présence de détergent dans la solution ajoutée est essentielle pour la perturbation des membranes cellulaires. Tout détergent non ionique peut être utilisé, mais il faut veiller à ce qu’il n’interfère pas avec la méthode de chimiluminescence.
2. Préparation des tissus
   1. Sortez le mouchoir du congélateur à -80 °C et décongelez-le lentement dans la glace. Retirez le reste de la graisse et du tissu conjonctif du muscle squelettique. Couper des morceaux de muscle squelettique et éponger sur de la gaze pour sécher.
   2. Pesez la quantité de tissu (20, 50 et 200 mg). Placez le muscle squelettique prépesé dans la solution d’arrêt dans les tubes d’homogénéisation ou placez le tissu prépesé dans un tube microcentrifuge propre pour une utilisation ultérieure.

3. Homogénéisation

1. Homogénéisateur rotatif (Figure 1)
   1. Placez le tube de type M contenant le muscle squelettique prépesé et la solution d’arrêt pré-mesurée dans la machine. Homogénéiser chaque échantillon deux fois (en fonction du cycle d’homogénéisation le plus destructeur) et placer le tube sur de la glace immédiatement après chaque homogénéisation pendant 5 minutes pour refroidir.
   2. Centrifuger brièvement à 2 000 × g et 4 °C pendant 5 min. Replacez le tube complet sur de la glace et ajoutez le volume approprié de méthanol (≥ 99,9 %, 10 fois le poids du tissu). Vortex à fond pendant 15 s.
      NOTE: Pour 20 mg de tissu, utilisez 200 μL de méthanol. Le méthanol est utilisé pour précipiter les protéines de l’homogénat tissulaire et n’interfère pas avec la méthode de chimiluminescence. Si une autre méthode de précipitation des protéines est utilisée, tester sa compatibilité avec la chimiluminescence.
   3. Homogénéiser une fois de plus et incuber sur la glace pendant 30 min. Centrifuger les échantillons pendant 35 min à 4 °C et 3 500 × g. Aspirer le surnageant et mesurer les niveaux de nitrite/nitrate, ou stocker à -80 °C pour une utilisation ultérieure.
2. Homogénéisateur de billes (Figure 2)
   1. Placer le tissu musculaire squelettique dans un tube contenant des billes (rapport 1:5 pour la solution tissu/butée diluée) et homogénéiser deux fois pendant 45 s à la vitesse la plus élevée disponible sur l’instrument utilisé. Placer le tube sur de la glace immédiatement après chaque homogénéisation pendant 5 minutes pour refroidir.
   2. Centrifuger brièvement à l’aide d’une petite centrifugeuse de bureau (2 000 x g) pendant 5 secondes. Replacez le tube sur de la glace et ajoutez un volume approprié de méthanol (pureté ≥ 99,9 %, 10 fois le poids du tissu). Vortex à fond pendant 15 s.
      NOTE 1: Pour 20 mg de tissu, utiliser 200 μL de méthanol.
      NOTA 2: Le méthanol est utilisé pour précipiter les protéines de l’homogénat tissulaire et n’interfère pas avec la méthode de chimiluminescence. Si une autre méthode de précipitation des protéines est utilisée, tester sa compatibilité avec la chimiluminescence.
   3. Homogénéiser à nouveau pendant 45 s à la vitesse la plus élevée disponible sur l’instrument utilisé. Incuber sur la glace pendant 30 min. Centrifugeuse à 17 000 x g, 4 °C, 30 min. Aspirer le surnageant et mesurer les niveaux de nitrite/nitrate, ou stocker à -80 °C pour une utilisation ultérieure.
3. Pulvérisateur (Figure 3)
   1. Préparer des tubes contenant une solution d’arrêt diluée (5x le poids du tissu) et les peser. Noter le poids (tube + solution d’arrêt).
   2. Placez l’outil pulvérisateur d’azote liquide sur de la glace sèche et attendez environ 30 minutes pour qu’il atteigne la température désirée.
   3. À l’aide d’une pince à épiler refroidie dans de l’azote liquide, transférer un échantillon (poids du tissu déjà mesuré) dans le pulvérisateur. Ajoutez une petite cuillerée d’azote liquide pour vous assurer que le tissu est à la température de l’azote liquide.
   4. Une fois que 95% de l’azote liquide s’est vaporisé, placez l’outil de broyage sur le tissu et appuyez fermement. Vous devriez sentir l’écrasement de l’échantillon. À l’aide du maillet, frappez l’outil de concassage 3-5x.
   5. Vérifiez l’échantillon pour tout morceau restant à l’aide d’une cuillère refroidie à l’azote liquide. Après refroidissement dans de l’azote liquide, utilisez un morceau de papier de soie pour essuyer toute eau gelée avant de toucher le tissu. Si un morceau est présent, déplacez-le au centre, puis frappez 5 à 6 fois de plus avec le maillet.
   6. Lorsque l’échantillon entier a été pulvérisé, utiliser la cuillère refroidie à l’azote liquide pour transférer directement le tissu broyé dans le tube prépesé contenant la solution d’arrêt diluée (étape 3.3.1). Assurez-vous d’effectuer cette étape rapidement car lorsque le muscle squelettique écrasé se réchauffe, il devient collant et difficile à transférer.
   7. Vortex pendant 15 s. Vérifiez qu’aucun tissu n’est collé au sommet du tube en ouvrant le tube. S’il y en a, essayez de le déloger, puis de vortex à nouveau.
   8. Centrifuger l’échantillon pendant 2-3 s à l’aide d’une petite centrifugeuse de bureau. Pesez à nouveau le tube. Calculer le poids du tissu en déduisant le poids initial du tube (étape 3.3.1) de ce nouveau poids. Placez le tube sur de la glace.
      REMARQUE: Les poids exacts aideront à déterminer le poids exact des tissus et la quantité de tissu perdue lors de la pulvérisation.
   9. Une fois que tous les échantillons ont été traités jusqu’à l’étape 3.3.8, ajouter un volume approprié de méthanol (≥ 99,9 %, 10 fois le poids du tissu). Bien vorter pendant 15 s et incuber sur de la glace pendant 30 min.
      NOTE: Pour 20 mg de tissu, utilisez 200 μL de méthanol. Le méthanol est utilisé pour précipiter les protéines de l’homogénat tissulaire et n’interfère pas avec la méthode de chimiluminescence. Si une autre méthode de précipitation des protéines est utilisée, tester sa compatibilité avec la chimiluminescence.
   10. Centrifugeuse à 17 000 × g, 4 °C, 30 min. Aspirer le surnageant et mesurer les niveaux de nitrite/nitrate, ou conserver à -80 °C pour une utilisation ultérieure.

4. Mesure des nitrites/nitrates avec un analyseur d’oxyde nitrique (NOA)

1. Préparer tous les échantillons par l’une des trois méthodes d’homogénéisation décrites ci-dessus et les injecter dans un avis d’approbation pour la mesure des nitrates et des nitrites.
   REMARQUE : Des protocoles détaillés pour l’utilisation de l’ANO ont été publiés précédemment¹⁹.

Résultats

Pour obtenir des résultats représentatifs, des tissus musculaires squelettiques de 8 rats Wistar (mâles et femelles, poids 250 ± 50 g) ont été utilisés. Les homogénats de muscles squelettiques de rat (50 mg de muscle grand fessier pour chaque méthode) ont été préparés par trois outils d’homogénéisation différents (homogénéisateur rotatif, homogénéisateur de billes et pulvérisateur). Les teneurs en nitrates et nitrites de ces homogénats ont ensuite été déterminées à l’aide d’un analyseur d...

Discussion

Pour surveiller l’évolution des métabolites du NO, nitrate et nitrite, en fonction des interventions physiologiques, il est impératif de mesurer les niveaux de ces ions dans les différents organes critiques dans leur métabolisme. Comme l’hémoglobine dans le sang réagit avec le NO et ses métabolites, il est également important de prélever le sang rapidement des échantillons de tissus autant que possible. Ainsi, les animaux ont été perfusés avec une solution saline avant de recueillir les tissus musculair...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
gentleMACS dissociator	Miltenyi Biotec	130-093-235
gentle MACS M tube	Miltenyi Biotec	130-093-236	Length: 87 mm; Diameter: 30 mm
Heparin Sodium	Hospira	NDC-0409-7620-13
Isoflurane	Baxter	NDC-10019-360-60
Methanol	Sigma	646377
Minilys bead homogenizer	Bertin Instruments	P000673-MLYS0-A
NEM; N-ethylmaleimide	Sigma	4260
Nitric Oxide analyzer	GE	Sievers NOA 280i
NP-40; 4-Nonylphenylpolyethylene glycol	Sigma	74385
Potassium ferricyanide; K3Fe(CN)6	Sigma	702587
Precellys lysing kit	Bertin Instruments	P000911-LYSK0-A	contains 2 mL tubes with 2.8 mm ceramic (zirconium oxide) beads for homogenization
Pulverizer kit	Cellcrusher	Cellcrusher kit