Evaluación Multifactorial Del Comportamiento Motor En Ratas Después De La Lesión Unilateral Por Aplastamiento Del Nervio Ciático

Resumen

Proporcionamos un protocolo para la evaluación del comportamiento motor a través de una batería de prueba de comportamiento en ratas después de una lesión por aplastamiento del nervio ciático.

Resumen

La inducción de una lesión del nervio periférico es un método ampliamente utilizado en neurociencia para la evaluación de los mecanismos de reparación y dolor, entre otros. Además, en el campo de la investigación de los desordenes de movimiento, lesión ciática del agobio se ha empleado para accionar un distonía-como fenotipo en modelos genético predispuestos del roedor de DYT-TOR1A de la distonía. Para lograr resultados consistentes, reproducibles y comparables después de una lesión por aplastamiento del nervio ciático, un método estandarizado para inducir el aplastamiento nervioso es esencial, además de una caracterización fenotípica estandarizada. Se debe prestar atención no solo a la variedad específica de pruebas de comportamiento, sino también a los requisitos técnicos, la correcta ejecución y el análisis de datos consecutivos. Este protocolo describe en detalle cómo realizar una lesión por aplastamiento del nervio ciático y proporciona una batería de prueba de comportamiento para la evaluación de los déficits motores en ratas que incluye la prueba de campo abierto, el análisis de la marcha de CatWalk XT, la tarea de caminar por la viga y la tarea de caminar por peldaños de escalera.

Introducción

Los roedores son excelentes organismos modelo para profundizar en la comprensión de las enfermedades humanas^1,2 probando hipótesis en múltiples niveles biológicos. Un nivel biológico fundamental para la caracterización de modelos de roedores es el nivel de fenotipo, medido por evaluaciones de comportamiento. Dependiendo del modelo animal y de la pregunta de investigación científica, la selección de una batería de prueba de comportamiento potente y fiable es esencial para cubrir una amplia gama de aspectos conductuales, como para los modelos animales de la enfermedad de Parkinson y la distonía^3,4,5,6.

El nervio ciático es el nervio más grande del cuerpo humano con fibras motoras y sensoriales. Las lesiones del nervio ciático pueden resultar fácilmente de una variedad de eventos tales como accidentes de tráfico y cirugías^7,8. Por lo tanto, las actividades de investigación que utilizan modelos de roedores con lesiones del nervio ciático, son de valor traslacionalmente relevante. A pesar de que el aspecto traslacional de la regeneración nerviosa de rata a humano tiene que ser considerado críticamente^9,la lesión por aplastamiento del nervio ciático (axonotmesis) en modelos de roedores es un método comúnmente utilizado para analizar los procesos de degeneración y regeneración de los nervios periféricos^10,11. En caso de una lesión por aplastamiento, el nervio no está completamente transectado. Daña el axón, resultando en un bloqueo de conducción directamente después de la lesión por aplastamiento seguido de procesos regenerativos ^4,12,13.

Por otra parte, en la investigación de la distonía, la lesión unilateral por aplastamiento del nervio ciático es un método establecido para desencadenar movimientos similares a la distonía (DLM) en modelos de roedores de distonía genéticamente predispuestos, que no muestran DLM per se^4,14. Se supone que el traumatismo nervioso periférico perturba la integración sensoriomotora al afectar las fibras nerviosas ciáticas, responsables de las funciones motoras y sensoriales¹⁵.

Aquí proporcionamos una descripción detallada para una lesión estandarizada por aplastamiento del nervio ciático y una batería de evaluaciones de comportamiento motor que se compone de la prueba de campo abierto (OFT), análisis de la marcha de CatWalk XT, tarea de caminar por la viga y tarea de caminar peldaños de escalera en ratas de tipo salvaje ingenuo (wt) (n = 8-9) y ratas wt cinco semanas después de la lesión unilateral por aplastamiento del nervio ciático (n = 10). La OFT proporciona información sobre la actividad locomotora general, mientras que un análisis detallado de la marcha se logra mediante el sistema automatizado de análisis de la marcha CatWalk XT. La tarea de caminar por el haz se utiliza para evaluar la coordinación motora mediante la evaluación del tiempo para cruzar el haz y el número de errores de colocación del pie. Para el análisis del rendimiento de la marcha, la tarea de caminar peldaños de escalera proporciona información sobre la colocación de pies o patas y errores en un aparato de peldaños de escalera horizontal con un patrón de peldaños constante pero irregular.

Protocolo

Todos los experimentos con animales fueron aprobados por las autoridades locales en el Regierung von Unterfranken (Würzburg, Alemania) y se realizaron de acuerdo con las directrices internacionales, nacionales y / o institucionales aplicables para el cuidado y uso de animales.

1. Lesión por aplastamiento del nervio ciático

NOTA: Mantenga un ambiente estéril durante todo el procedimiento quirúrgico. Configure la mesa de cirugía con el equipo necesario.

1. Anestesiar profundamente la rata en un gabinete cerrado con isoflurano al 3,0% en_O2 (2 L/min). Retire la rata del gabinete. Afeitarse una extensa zona de la extremidad posterior derecha.
2. Coloque la rata en la máscara de anestesia y continúe la anestesia profunda con isoflurano al 2,0% en_O2 (2 L/min). Controle la profundidad de la anestesia pellizcando las correas interdigitaales de los pies traseros. La ausencia de reflejos de abstinencia indica una anestesia adecuada.
3. Fijar el torso y ambos miembros posteriores de la rata con cinta adhesiva. Coloque ambas extremidades posteriores en una posición simétrica y extendida girando la pata plana sobre la mesa de cirugía.
4. Aplique ungüento oftálmico en los ojos para evitar la sequedad de los ojos. Desinfecte la piel de la zona afeitada con un antiséptico.
5. Busque la muesca ciática del ilion.
6. Haga una incisión en la piel desde la muesca ciática en la dirección de la pata con un bisturí. La incisión de la piel debe ser lo más pequeña posible (aproximadamente 1 a 2 cm).
7. Si las extremidades posteriores están fijas y la incisión de la piel se realiza correctamente, se puede ver una cavidad en el plano fascial entre el músculo glúteo máximo y el músculo bíceps femoral que se asemeja a una "línea blanca". Inserte fórceps hemostáticos súper finos cerrados (No. 5) en la cavidad y extienda el fórceps. El plano fascial debe abrirse sin lesionar ningún tejido muscular.
8. Coloque los retractores de banda elástica debajo de los músculos, para mantener la incisión de la piel abierta.
9. Retire suavemente cualquier tejido circundante y vasos sanguíneos del nervio ciático hasta que el nervio esté completamente expuesto. Es importante no estirar o tirar del nervio durante todo el procedimiento.
10. Aplaste el nervio ciático con una abrazadera no aserrada (hemóstato ultra fino) con presión constante y reproducible. Para esto, abra la abrazadera, coloque el nervio en la mandíbula inferior de la abrazadera y cierre la abrazadera bloqueándola en la primera posición durante tres veces diez segundos. La posición del aplastamiento del nervio ciático se encuentra cerca de la muesca ciática, próxima al sitio de división del haz principal del nervio ciático. Después de la lesión por aplastamiento, vuelva a abrir la abrazadera con cuidado. El sitio del aplastamiento del nervio ciático aparece translúcido.
11. Retire los retractores de banda elástica.
12. Cierre la incisión del plano fascial con la sutura reabsorbible 4-0. Cierre la incisión de la piel con grapas en la piel del cuerpo.
13. Aplique Rimadyl de acuerdo con las pautas de GV-SOLAS (5 mg/kg de peso corporal, inyección subcutánea) para el alivio del dolor postoperatorio cada 24 horas después de la cirugía durante dos días.
14. Retire la rata de la configuración de la cirugía. Coloque la rata en una jaula limpia sin ropa de cama en una placa de calentamiento (37 °C) hasta que la rata esté despierta. Mueva la rata de nuevo en su jaula de casa limpia.
15. Retire las grapas de la piel del cuerpo de cuatro a seis días después de la cirugía.

2. Prueba de campo abierto (OFT)

NOTA: La actividad locomotriz, así como la actividad conductual, pueden ser analizadas por la OFT.

1. arreglo
   1. Configure la OFT (Figura 1A) en un entorno oscuro y silencioso. Consiste en el sistema automatizado de seguimiento de vídeo EthoVision XT (ordenador, software con licencia) y una arena de 58,5 cm (largo) x 58,5 cm (ancho) x 45 cm (alto) con una superficie negra resistente a los arañazos y limpiable. La superficie negra es importante para aumentar el contraste al rastrear animales blancos.
2. evaluación
   1. Coloque la arena y la cámara en la posición correcta. Ajuste la cámara para que se grabe toda la caja de campo abierto con la mejor resolución. Realice el experimento en un entorno oscuro. Si se necesita luz para la configuración, utilice una luz pequeña y difusa para evitar puntos de luz, reflejos y sombras en la arena. Garantice la igualdad de condiciones de luz midiendo la iluminancia con un medidor de lux en diferentes áreas de la arena.
   2. Configure el software EthoVision XT. Las configuraciones más importantes se enumeran a continuación. En Configuración del experimento, elija Seguimiento en vivo para la Fuente de vídeo y La detección de punto central para las Entidades rastreadas. Valide el tamaño de la arena en la configuración de la arena. Establezca la condición de inicio para la adquisición de datos en tres segundos después de que la rata se colocara en el centro de la arena y el tiempo total de ejecución en cinco minutos en Configuración de control de prueba. Elija Resta estática para el Método en Configuración de detección. Marca de verificación Guardar vídeo para Método en Configuración de adquisición.
   3. Coloque la rata suavemente en el centro de la arena de pruebas (Figura 1B).
   4. Pulse el botón Iniciar prueba en el Control de adquisición para iniciar la grabación.
   5. Durante la grabación, manténgase alejado de la configuración de OFT para evitar distraer a la rata.
   6. Después de cada ensayo, retire la rata suavemente de la arena de pruebas y limpie la configuración con ácido acético al 0,1% para evitar la distracción por el olor de la rata previamente registrada.
3. análisis de datos
   1. Para el análisis de datos de la OFT con el software EthoVision XT, vaya a la sección Análisis en la barra lateral izquierda y elija Track Visualization en la pestaña Results (Figura 1C). A continuación, exporte los parámetros necesarios a Excel. Dentro del software, elija una serie de variables de diferentes categorías para el análisis de datos. Las variables importantes para este objetivo científico específico son "Distancia movida" y "Velocidad" bajo la categoría "Distancia y Tiempo". Realizar un análisis estadístico de los parámetros seleccionados (Figura 1D).

3. Análisis de la marcha de CatWalk XT

NOTA: Un análisis de la marcha a través del sistema CatWalk XT puede ayudar a evaluar muchos parámetros diferentes relacionados con las huellas, la postura y la marcha de los modelos animales. Una pasarela de cristal se ilumina con luz verde y la luz dispersada por las huellas de los animales se captura con una cámara de vídeo de alta velocidad, que se encuentra debajo de la pasarela. Las señales se pueden analizar con el software CatWalk XT.

1. arreglo
   1. Para el análisis de la marcha con la CatWalk XT, utilice el sistema CatWalk y el software correspondiente (ordenador, software con licencia) (Figura 2A).
   2. Realice el experimento en condiciones oscuras, ya que la adquisición de datos depende de la iluminación de la pasarela del sistema CatWalk con luz LED verde. Para facilitar el procedimiento experimental en condiciones oscuras, ilumine la sala experimental con luz roja.
   3. Utilice una pasarela definida que mida 65 cm de largo y 7 cm de ancho; sin embargo, el tamaño de la pasarela depende del tamaño de las ratas. Configure la pasarela lo más grande posible para registrar tantas huellas como sea posible para cada pata.
   4. Captura un número mínimo de tres huellas por pata para cada carrera. Al definir la longitud de la pasarela, considere el cuerpo y la cola de la rata, ya que la señal de inicio o parada podría no detectarse correctamente y las corridas pueden no clasificarse como compatibles, si el cuerpo / cola entra o permanece en la pasarela definida antes o después de la finalización de la carrera.
2. adiestramiento
   NOTA: El entrenamiento de las ratas para el sistema catwalk es necesario para habituar a los animales a la configuración y permitirles aprender a cruzar la pasarela sin ninguna interrupción. El entrenamiento adecuado proporciona las ventajas de ahorrar tiempo durante la evaluación experimental y obtener mejores resultados. Iniciar la adquisición de datos del sistema CatWalk durante las sesiones de entrenamiento permite a las ratas acostumbrarse a las condiciones de evaluación (ruido/luz).
   1. Comience a configurar el sistema CatWalk.
      1. Limpie la pasarela de vidrio con agua destilada y un paño suave sin pelusas. Al principio y al final del experimento, o en el medio si la pasarela de vidrio está sucia, use líquido de limpieza de vidrio y tela suave sin pelusas para limpiar la pasarela de vidrio. Después del uso de líquido de limpieza de vidrio, despeje la pasarela de cualquier residuo del líquido para evitar que distraiga al animal.
      2. Elija los ajustes experimentales. Un parámetro importante es Criterios de ejecución. Establezca los valores adecuados para Duración mínima de ejecución, Duración máxima de ejecucióny Número mínimo de ejecuciones compatibles para adquirir, que son específicos para cada proyecto de investigación. Marque la casilla usar la variación de velocidad máxima permitida y establezca el valor. Los criterios de ejecución se pueden ignorar durante los primeros cuatro a cinco días de entrenamiento.
      3. Coloque la cámara en su posición y ajuste el enfoque. Encuentre la posición óptima de la cámara para lograr una longitud adecuada de la pasarela y la mejor resolución de las patas grabadas simultáneamente. Etiquete la posición de la cámara en el sistema CatWalk para garantizar una colocación idéntica de la cámara entre las grabaciones.
      4. Configure la configuración de detección mediante la detección automática para un nuevo experimento. Asegúrese de que todas las huellas se pueden detectar con un ruido de fondo mínimo. Si es necesario, optimice la configuración de detección manualmente y cambie el Umbral de intensidad verde. Use la misma configuración de detección para todo el experimento.
      5. Configure las paredes del pasillo del sistema CatWalk. Las paredes del corredor deben estar lo más cerca posible de la rata. Asegúrese de que las paredes del pasillo permanezcan paralelas a la pasarela.
      6. Definir la longitud de la pasarela: Haga clic en el icono Definir pasarela. Ajuste el tamaño del rectángulo blanco en longitud y anchura, de acuerdo con el proyecto de investigación específico. Haga clic en Aceptar.
      7. Calibrar la pasarela: Haga clic en el icono Calibrar pasarela. Coloque una hoja de calibración rectangular de 20 x 10 cm en el centro de la pasarela. Adapte el tamaño del rectángulo blanco a la hoja de calibración. Haga clic en Aceptar.
      8. A continuación, tome una imagen de fondo: Compruebe de antemano que la pasarela está limpia y vacía. Haga clic en el botón Ajustar fondo para generar una imagen de fondo.
   2. Entrene a los animales durante al menos ocho días antes de comenzar el experimento real. Se recomienda el entrenamiento en días sucesivos.
      1. Día 1 de entrenamiento: Para que las ratas se acostumtumen al sistema de pasarela, permita que el animal explore libremente la pasarela y la caja de la meta. Deje que las ratas practiquen cruzar la pasarela y entren en la caja de la meta. Recoger la rata al final de la pasarela o en la caja de la meta y traer a la rata de vuelta al punto de partida de la pasarela. Se recomiendan cinco carreras para el primer día de entrenamiento sin necesidad de cumplimiento de los entornos experimentales.
      2. Día 2 de entrenamiento: Las ratas pueden explorar libremente la pasarela y la caja de la meta. Se recomiendan cinco corridas sin el cumplimiento de los ajustes experimentales.
      3. Día 3 de entrenamiento: Se recomiendan ocho carreras sin cumplir con los entornos experimentales.
      4. Día 4 de entrenamiento: Se recomiendan diez carreras sin cumplir con los ajustes experimentales.
      5. Día 5 de entrenamiento: Se recomiendan diez carreras. Los ajustes experimentales deben tenerse en cuenta. Motivar a las ratas a cruzar la pasarela sin ninguna interrupción.
      6. Día 6 de entrenamiento: Se recomiendan diez carreras. Los ajustes experimentales deben tenerse en cuenta. Motivar a las ratas a cruzar la pasarela sin ninguna interrupción.
      7. Día 7 de entrenamiento: Se recomiendan diez carreras. Se debe lograr un mínimo de tres corridas compatibles. Agregue más carreras para los animales, si no pudieron alcanzar esta meta.
      8. Día 8 de entrenamiento: Se recomiendan diez carreras. Se debe lograr un mínimo de tres corridas compatibles. Agregue más carreras para los animales, si no pudieron alcanzar esta meta.
3. evaluación
   1. De acuerdo con los criterios de ejecución definidos, realice tres corridas compatibles por rata para el análisis de datos. Para la evaluación, siga los pasos 3.2.1. - 3.2.1.8. como se describe en la sección de capacitación. Incluso si la rata alcanza tres carreras compatibles dentro de las primeras tres carreras, lleve a cabo un mínimo de seis carreras por sesión / por semana para fines de entrenamiento.
   2. Realice al menos una sesión (de entrenamiento) con seis carreras por semana para un patrón de marcha estable para experimentos con múltiples puntos de tiempo. Los ajustes experimentales y de detección permanecen coherentes durante todo el experimento.
4. análisis de datos
   1. Para el análisis de datos, evalúe solo las ejecuciones compatibles. Eliminar ejecuciones no conformes.
   2. Verifique el Umbral de intensidad verde y aumente o disminuya el umbral de intensidad verde antes de la clasificación de las impresiones de la pata si es necesario. El umbral de intensidad verde debe ser coherente para todos los animales y todas las corridas.
   3. Clasificar las impresiones de patas automáticamente con el software CatWalk XT (Figura 2B).
   4. Revise las etiquetas de impresión de patas manualmente. Corrija las etiquetas de impresión de patas incorrectas, agregue etiquetas de impresiones de patas no detectadas y elimine el ruido y las etiquetas incorrectas manualmente. Mueva el vídeo a una posición, que debe revisarse manualmente. Para corregir las impresiones de patas etiquetadas incorrectas, seleccione el rectángulo de la impresión de pata específica, haga clic en Restablecer, vuelva a seleccionar el mismo rectángulo y asigne la etiqueta correcta de la lista. Para etiquetar las impresiones de patas no detectadas, dibuje un rectángulo alrededor de la pata no detectada, haga clic en Agregar impresión, seleccione el nuevo rectángulo generado y asigne la etiqueta correcta de la lista. En caso de que el software etiquetado como nariz o cuerpo imprima automáticamente, seleccione el rectángulo de la etiqueta específica y haga clic en Quitar impresión.
   5. Revise los resultados numéricos. Los resultados numéricos se muestran en una hoja de Excel, mostrando una serie de parámetros básicos. Elegir parámetros específicos predefinidos, en función del interés de la investigación y realizar análisis estadísticos como de costumbre (Figura 2D).
   6. Para obtener información más detallada sobre cada huella, clasifique los dedos de las patas traseras. Este análisis requiere el módulo Mediciones interactivas de huellas.
      1. Adapte el umbral de intensidad verde para el análisis de mediciones interactivas de huella si es necesario. El umbral de intensidad verde debe ser coherente para todos los animales y todas las corridas.
      2. Establezca los marcadores para el análisis de huella manualmente. Analice cada impresión de pata trasera en las tres corridas compatibles. Dibuje una línea desde el centro del primer dedo del día hasta el centro del quinto dedo del día para medir "Propagación del dedo deldo del día". Dibuje una línea desde el centro del segundo dedo deldo del piso hasta el centro del cuarto dedo del piso para medir la "dispersión intermedia del dedo deldo del piso". Dibuje una línea desde el centro del tercer dedo del pie hasta el talón de la pata trasera para medir la "Longitud de impresión manual" (Figura 2C).
      3. Revise los resultados numéricos de las "Mediciones interactivas de huellas" que se muestran en una hoja separada. Seleccione los parámetros específicos de las "Mediciones interactivas de la huella" y realice el análisis estadístico como de costumbre (Figura 2E).

4. Tarea de caminar por la viga

NOTA: Los déficits de la marcha se pueden determinar por la tarea de caminar de la viga. El enfoque de la tarea de caminar por el haz en este tema de investigación específico será el análisis de la coordinación motora, definida como la capacidad de coordinar la activación muscular de múltiples partes del cuerpo, y no la evaluación del equilibrio motor, definido como la capacidad de control postural durante los movimientos corporales.

1. arreglo
   1. Para la tarea de caminar por el haz, utilice un haz, espaciador, mesa, fondo uniforme y una videocámara (Figura 3A).
   2. Utilice una viga de madera de 90 cm de largo, 1,7 cm de ancho y 2 cm de alto. Se recomienda una plataforma de 20,5 cm de largo, 15 cm de ancho y 2 cm de alto en ambos extremos de la viga. Utilice el mismo material para las plataformas y la viga, evite cualquier barrera entre las plataformas y la viga.
   3. Haga que la distancia entre la viga y la mesa sea de al menos 44 cm. Un entorno familiar, como una jaula casera, motiva a las ratas a cruzar la viga, que se puede colocar al final de la plataforma de la viga.
2. adiestramiento
   1. Configure la viga con espaciador y jaula casera en la mesa.
   2. Entrene a los animales durante siete días. Se recomienda el entrenamiento en días sucesivos.
      1. Día 1 de entrenamiento
         1. Coloque todas las ratas de una jaula casera en la plataforma de arranque de la viga.
         2. Deje que las ratas exploren el medio ambiente (plataforma / haz).
         3. Sostenga una rata cuidadosamente por la cola y conduzca a la rata a la viga empujando la rata suavemente sobre la viga.
         4. Ayudar a la rata en el cruce de la viga sosteniendo la rata por su cola durante al menos dos carreras.
         5. Deje que la rata atraviese la viga durante tres carreras más sin ayuda. Observe a la rata y proporcione asistencia si es necesario. Si la rata no logra atravesar el haz, interceptar la caída para evitar lesiones y el desarrollo de miedo para atravesar el haz.
         6. Continúe con este procedimiento para todas las ratas.
            NOTA: A veces las ratas se siguen para atravesar el haz, en cuyo caso no se necesita ayuda. Sin embargo, es importante observar las ratas, interceptar las caídas y proporcionar asistencia si es necesario.
      2. Día 2 de entrenamiento
         1. Coloque todas las ratas de una jaula casera en la plataforma de arranque de la viga.
         2. Deje que las ratas atraviesen el haz seis veces.
         3. Si es necesario, proporcione asistencia e intercepte las caídas.
      3. Día 3 de entrenamiento
         1. Coloque una rata en la plataforma de arranque de la viga.
         2. Deje que la rata cruce el haz seis veces.
         3. Si es necesario, proporcione asistencia e intercepte las caídas.
      4. Día 4-7 de entrenamiento
         1. Coloque una rata en la plataforma de arranque de la viga.
         2. Deje que la rata cruce el haz diez veces.
         3. Si es necesario, proporcione asistencia e intercepte las caídas.
         4. Al final del entrenamiento, la rata debe atravesar el haz sin ninguna interrupción durante al menos tres carreras. Es permisible empujar suavemente la rata en la plataforma de arranque para desencadenar el inicio del movimiento.
3. evaluación
   1. Configure la viga con espaciador y jaula casera en la mesa.
   2. Coloque la videocámara en su posición, alineada en paralelo al haz con el animal enfocado. La posición de la videocámara debe estar lo más cerca posible del animal para lograr una resolución óptima de los movimientos grabados. El haz y las partes de ambas plataformas deben ser capturados por la grabación.
   3. Inicie la grabación y primero identifique la sesión y el animal.
   4. Coloque la rata en la plataforma de arranque de la viga.
   5. La rata debe cruzar la viga tres veces sin ninguna interrupción. Incluso si la rata alcanza tres corridas compatibles dentro de las primeras tres corridas, lleve a cabo un mínimo de seis a diez corridas para un rendimiento continuo de la tarea.
   6. Siempre, observe al animal e intercepte las caídas, si es necesario.
   7. Después de la tarea, limpie la viga y la mesa con ácido acético al 0,1% para evitar la distracción por el olor de la rata previamente registrada.
      NOTA: Dentro de las primeras dos semanas después de la lesión por aplastamiento del nervio, las ratas son incapaces de atravesar el haz sin ayuda. Por lo tanto, se debe proporcionar asistencia para seis a ocho carreras en las primeras dos semanas después de la lesión por aplastamiento nervioso. De la semana tres a la semana cinco, cinco carreras se realizan con asistencia y diez carreras más se realizaron sin asistencia.
4. análisis de datos
   1. Utilice el software gratuito de análisis de vídeo Kinovea para el análisis de datos.
   2. Seleccione las secuencias de vídeo de tres corridas compatibles de la grabación. Para ello, elija las tres primeras carreras compatibles que se realizaron sin ayuda por parte del animal. Sea coherente en la selección de ejecución compatible para todas las ratas.
   3. Defina el punto de hora de inicio y el punto de hora de finalización de las tres corridas compatibles seleccionadas (Figura 3D-E). En esta configuración, el punto de inicio fue etiquetado por una línea negra en la viga y la colocación de la primera extremidad posterior detrás de la línea negra definió el punto de tiempo de inicio de la carrera. La colocación de la primera extremidad posterior en la plataforma al final de la viga define el punto de tiempo final.
   4. A continuación, calcule el tiempo necesario para que la rata atraviese el haz. Reportar los datos como tiempo de latencia para cruzar el haz en segundos y realizar análisis estadísticos como de costumbre (Figura 3B).
   5. Puntuar el número de pasos y errores de tres corridas compatibles para ambos miembros por separado mediante el uso de la función de zoom y cámara lenta del software. Los errores incluyen resbalones totales de pies y resbalones de medio pie. Un deslizamiento total del pie se define como una colocación del pie que es seguida por un deslizamiento profundo que causa una pérdida de contacto de la pata afectada con la viga (Figura 3F). Un medio deslizamiento se define como una pata que se desliza fuera de la pared lateral de la viga sin perder el contacto completo con la viga (Figura 3G).
   6. Calcular el porcentaje de deslizamientos de pie en relación con el número de pasos para cruzar la viga ((número de deslizamientos de pie de la extremidad x 100%)/ número de escalones de la misma extremidad). Presentar los datos como porcentaje de deslizamientos de pie y realizar análisis estadísticos como de costumbre (Figura 3C).

5. Tarea de caminar peldaños de escalera

NOTA: La tarea de caminar peldaños de escalera puede evaluar la función motora, la colocación de los primeros y los miembros posteriores, y la coordinación interlimb.

1. arreglo
   1. Utilice un aparato de peldaños de escalera, espaciador, mesa, fondo uniforme y videocámara para esta prueba de comportamiento (Figura 4A). El aparato de peldaños de escalera horizontal consiste en peldaños metálicos y paredes laterales de policarbonato transparente. El aparato tiene una longitud de 119,5 cm y la anchura se ajusta a 7,4 cm. La pasarela a analizar tiene una longitud de 100 cm.
   2. Etiquete el punto inicial y final con una línea negra en la pared lateral. Coloque marcadores de posición para los peldaños en el aparato a intervalos de 1 cm. Coloque un patrón irregular de los peldaños para la pasarela de 100 cm con una distancia entre 1 y 5 cm entre los peldaños. Los primeros 10 cm al principio y los últimos 9,5 cm al final del aparato, que se excluyen del análisis, tienen un patrón regular de los peldaños con una distancia de 1 cm.
   3. Utilice una distancia entre la pasarela y la mesa de aproximadamente 30 cm (Figura 4A-B). Una caja de meta o un entorno familiar al final del aparato, como una jaula doméstica, motiva a las ratas a cruzar el aparato de peldaños de escalera.
2. adiestramiento
   1. Configure el aparato de peldaños de escalera con espaciador y caja de meta en la mesa.
   2. Entrene a los animales durante ocho días. Se recomienda el entrenamiento en días sucesivos.
      1. Día 1 de entrenamiento
         1. Coloque todas las ratas de una jaula casera en el aparato de peldaños de escalera.
         2. Deje que las ratas exploren el medio ambiente (aparato de peldaños de escalera / caja de meta).
         3. Empuje suavemente las ratas en la dirección de la caja de la meta. Ayudar a las ratas en entrar en la caja de la meta. Deje que las ratas exploren la caja de la meta por un tiempo.
         4. Después de todo, las ratas entraron en la caja de la meta. Tome la primera rata de la caja de la meta y coloque la rata en la zona de inicio del aparato de nuevo. Continúe con el mismo procedimiento para todas las ratas de una jaula casera. Empuje suavemente las ratas en la dirección de la caja de la meta y dé ayuda para entrar en la caja de la meta, si es necesario.
         5. Deje que la rata atraviese el aparato cuatro veces.
      2. Día 2 de entrenamiento
         1. Realice el mismo protocolo que se indica para el primer día de entrenamiento.
         2. Deje que la rata atraviese el aparato seis veces.
      3. Día 3 de entrenamiento
         1. Realice el mismo protocolo que se indica para el primer día de entrenamiento.
         2. Deje que la rata atraviese el aparato ocho veces.
      4. Día 4 de entrenamiento
         1. Coloque una rata en el inicio del aparato de peldaños de escalera.
         2. Si la rata no atraviesa el aparato y entra en la caja de la meta voluntariamente, dé ayuda empujando suavemente a la rata por detrás.
         3. Deje que la rata atraviese el aparato ocho veces.
      5. Día 5-8 de entrenamiento
         1. Coloque una rata en el inicio del aparato de peldaños de escalera.
         2. Si la rata no atraviesa el aparato y entra en la caja de la meta voluntariamente, dé ayuda empujando suavemente a la rata por detrás.
         3. Deje que la rata atraviese el aparato diez veces.
         4. Al final del entrenamiento, la rata debe ser capaz de atravesar la pasarela sin ninguna interrupción y asistencia para un mínimo de tres carreras. Es permisible dar a la rata un empuje suave en la zona de inicio para desencadenar la iniciación del movimiento.
3. evaluación
   1. Configure el aparato de peldaños de escalera con espaciador y caja de meta en la mesa.
   2. Coloque la videocámara en su posición, alineada en paralelo al aparato con el animal enfocado. Coloque la videocámara lo más cerca posible del animal para lograr una resolución óptima de los movimientos grabados y asegurarse de que todo el aparato de peldaños de escalera se captura en la grabación.
   3. Inicie la grabación y primero identifique la sesión y el animal.
   4. Coloque la rata en la zona de inicio del aparato de peldaños de escalera.
   5. La rata tiene que atravesar la pasarela de 100 cm del aparato de peldaños de escalera tres veces sin ninguna interrupción para que pueda calificar como una carrera compatible. Incluso si la rata alcanza tres corridas compatibles dentro de las tres primeras corridas, se debe llevar a cabo un mínimo de diez corridas para el rendimiento continuo de la tarea.
   6. Después de la tarea, limpie el aparato y la mesa con ácido acético al 0,1% para evitar la distracción por el olor de la rata previamente registrada.
4. análisis de datos
   1. Utilice el software gratuito de análisis de vídeo Kinovea para el análisis de datos.
   2. Seleccione las secuencias de vídeo de tres corridas compatibles de la grabación. Elija las tres primeras ejecuciones compatibles para el análisis de datos.
   3. Defina el punto de hora de inicio y el punto de hora de finalización de las tres ejecuciones compatibles seleccionadas. La colocación de la primera extremidad posterior detrás de la primera línea negra en la pared lateral del aparato, que etiqueta el punto de tiempo de inicio de la pasarela de 100 cm, define el punto de tiempo de inicio de la carrera. La colocación del primer frontlimb detrás de la segunda línea negra en la pared lateral del aparato, que etiqueta el punto final de la pasarela de 100 cm, define el punto de tiempo final de la carrera.
   4. Identifique el punto de hora inicial y final. A continuación, calcule la duración de la carrera a través de la pasarela. Reportar los datos como tiempo de latencia para atravesar la pasarela en segundos y realizar análisis estadísticos como de costumbre (Figura 4C).
   5. Puntuar las tres corridas compatibles con la escala de 7 categorías de Metz et al. utilizando la cámara lenta o la función fotograma a fotograma del software(Figura 5)^16,17. Determine el número de pasos y el número de errores de acuerdo con las categorías de la escala para cada miembro por separado. La escala distingue entre las siguientes categorías: (0) total miss (1) deslizamiento profundo (2) deslizamiento leve (3) reemplazo (4) corrección (5) colocación parcial y (6) colocación correcta. Solamente el error del miembro de iniciación fue clasificado. No se deben clasificar otros errores, desencadenados por el error inicial.
   6. Calcule los errores/pasos teniendo en cuenta los siguientes requisitos. Las categorías (0) total de error (1) deslizamiento profundo (2) ligero resbalón cuentan como un error. Divida el número de errores por el número de pasos para cada período posterior y cada ejecución por separado. Determinar el valor medio de las tres corridas compatibles para cada animal y cada extremidad posterior por separado y realizar el análisis estadístico como de costumbre (Figura 4D).

Resultados

Los resultados representativos de los cinco minutos de OFT muestran que la lesión por aplastamiento nervioso cinco semanas después de la cirugía no tiene ningún efecto sobre la actividad locomotriz (Figura 1).

El análisis de la marcha con el sistema CatWalk XT(Figura 2)genera muchos parámetros diferentes. Los parámetros selectivos se analizaron estadísticamente comparando ratas wt ingenuas con ratas wt lesionadas por los nervios cinco semanas después del aplastamiento nervioso (Figura 2D). Se pudieron detectar alteraciones significativas para la velocidad promedio de carrera, la longitud de la zancada y el área de impresión de la pata trasera (derecha) lesionada por los nervios. Un análisis más detallado de la pata trasera nervio-lesionada fue realizado con el módulo de las "medidas interactivas de la huella". Una reducción significativa de los parámetros de la extensión del dedo del pies, de la extensión intermedia del dedo del pies y de la longitud de la impresión fue observada en ratas nervio-heridas del peso comparadas a las ratas ingenuas del peso. Además, el eje del cuerpo del ángulo de la pata y el vector de movimiento del ángulo de la pata difieren significativamente cuando se comparan las ratas wt lesionadas por los nervios con las ratas wt ingenuas (Figura 2E).

La Figura 3 presenta los datos de coordinación motora obtenidos a través de la evaluación de tareas de marcha de haz. Las ratas wt lesionadas por los nervios mostraron un tiempo de latencia significativamente mayor para cruzar el haz en comparación con las ratas wt ingenuas cinco semanas después de la lesión (Figura 3B). Como lectura adicional de la tarea de caminar de la viga, los resbalones completos y los medios resbalones de la extremidad posterior nervio-lesionada fueron contados y considerados como error para el análisis estadístico. El porcentaje de errores por paso de la extremidad posterior (derecha) nervio-lesión fue aumentado perceptiblemente de ratas nervio-heridas del peso comparadas a las ratas ingenuas del peso.

Los datos representativos de la tarea de caminar peldaño de escalera (Figura 4) no muestran alteraciones significativas en el tiempo de latencia para cruzar la pasarela del aparato de peldaño de escalera (Figura 4C) o en el porcentaje de errores por escalón de la extremidad posterior lesionada por los nervios (derecha) (Figura 4D). El análisis del porcentaje de error por paso de la extremidad posterior lesionada por el nervio consideró sólo la puntuación de 0 a 2 de la escala de 7 categorías de Metz et al. La distribución de todas las categorías de puntuación por paso de la escala de 7 categorías de la extremidad posterior lesionada por los nervios y la extremidad posterior no lesionada por los nervios (izquierda) se ilustra en la Figura 4E.

Figura 1:Evaluación de la actividad locomotriz durante la prueba de campo abierto. (A) Imagen de la configuración de la prueba de campo abierto. Imagen seleccionada restada de un video grabado durante la prueba de campo abierto que muestra una rata en la arena de campo abierto sin (B) y con (C) seguimiento. (d) La velocidad durante una grabación de prueba de campo abierto de cinco minutos se investigó en ratas y ratas wt ingenuas wt cinco semanas después de lesión por aplastamiento nervioso. Los datos se muestran como media ± SEM. El análisis estadístico se realizó utilizando la prueba t no emparejada de los datos distribuidos normalmente. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figura 2:Análisis de la marcha con el sistema CatWalk XT. (A) Imagen del aparato CatWalk XT. (B) Ejemplos de la vista de impresión que muestra las huellas de patas etiquetadas en modo de color falso y ejemplos de la vista de temporización que muestra el diagrama de marcha basado en el tiempo de ratas y ratas wt ingenuas wt cinco semanas después de la lesión por aplastamiento nervioso. (C) Ejemplos de la clasificación del dedo del pie que muestra la extensión del dedo del pie (TS), la extensión intermedia del dedo del pie (ITS) y la longitud de impresión (PL), así como ejemplos de la vista del eje del cuerpo que muestra el eje del cuerpo (línea blanca) y el vector de movimiento (línea roja) de las ratas wt ingenuas y las ratas wt cinco semanas después de la lesión por aplastamiento nervioso. (D) Datos de parámetros seleccionados de la clasificación "estándar" que compara ratas noïve del peso y ratas del peso cinco semanas después de lesión del aplastamiento del nervio. (E) Datos de parámetros seleccionados del "módulo de mediciones interactivas de la huella" que comparan ratas noïve wt y ratas wt cinco semanas después de la lesión por aplastamiento nervioso. Los datos se muestran como media ± SEM. El análisis estadístico se realizó utilizando la prueba t no emparejada de los datos distribuidos normalmente, la prueba t no emparejada con la corrección de Welch de los datos normalmente distribuidos con varianza desigual y la prueba U de Mann-Whitney de los datos distribuidos no normales. El valor p < 0,05 se definió como estadísticamente significativo etiquetado como *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figura 3: Análisis de la marcha con la tarea de caminar por el haz. (A) Imagen y dibujos esquemáticos de la configuración de la tarea de caminar por el haz. El tiempo del estado latente de cruzar la viga (b) y los errores del resbalón del pie del porcentaje por el paso de la extremidad posterior nervio-lesión durante la tarea que caminaba de la viga (c) eran analizados en ratas ingenuas del peso y ratas del peso cinco semanas después de lesión del agolpamiento del nervio. Imagen representativa para la posición de la hora de inicio (D) y la posición de la hora de finalización (E) de la tarea de caminar por el haz. Secuencia de imagen representativa de un error de deslizamiento completo (F) y un error de deslizamiento medio (G) de la tarea de caminar por el haz. Los datos se muestran como media ± sem. El análisis estadístico se realizó utilizando la prueba U de Mann-Whitney de los datos distribuidos no normales. El valor p < 0,05 se definió como estadísticamente significativo etiquetado como *p < 0,05, **p < 0,01. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figura 4: Análisis de la marcha utilizando la tarea de caminar peldaños de escalera. Imagen (A) y dibujos esquemáticos (B) de la configuración de la tarea de caminar peldaños de escalera. La época del estado latente de atravesar el aparato del peldaño de la escalera (c) y los errores del resbalón del pie del porcentaje por el paso de la extremidad posterior nervio-lesión durante la tarea que caminaba del peldaño de la escalera (d) fueron evaluados en ratas ingenuas del peso y ratas del peso cinco semanas después de lesión del agolpamiento del nervio. (E) La distribución porcentual de la categoría de puntuación por paso según la escala de 7 categorías de Metz et al. para el hindlimb izquierdo y derecho de las ratas ingenuas del peso y de las ratas del peso cinco semanas después de lesión del agobio del nervio. Los datos se muestran como media ± SEM. El análisis estadístico se realizó utilizando la prueba t no emparejada de los datos distribuidos normalmente y la prueba U de Mann-Whitney de los datos distribuidos no normales. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figura 5: Representación ejemplar de cada categoría según la escala de 7 categorías de Metz et al. durante la tarea de caminar peldaños de escalera. Secuencia de imagen representativa de la extremidad posterior derecha de la categoría 0 - falta total, categoría 1 - deslizamiento profundo, categoría 2 - ligero deslizamiento, categoría 3 - reemplazo, categoría 4 - corrección, durante la tarea de caminar peldaños de escalera. Imágenes representativas para la categoría 5 - colocación parcial y categoría 6 - colocación correcta. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Discusión

Este protocolo de evaluación del comportamiento proporciona una visión general de las ventajas y desventajas, así como las posibles lecturas de la batería de prueba de comportamiento seleccionada en un modelo de roedor después de la lesión por aplastamiento del nervio ciático.

Para obtener un resultado comparativo de lesión del agobiamiento del nervio ciático, una técnica constante del agobio es obligatoria. El uso de una abrazadera no aserrada (Ultra Fine Hemostat) en lugar de fórceps puede mejorar la consistencia del aplastamiento. Utilice la misma abrazadera, así como la misma posición de aplastamiento para garantizar la misma compresión nerviosa. El uso exclusivo de la abrazadera para la lesión por aplastamiento y la manipulación de la abrazadera con cuidado mejora la consistencia. Además, realice el procedimiento de la lesión por aplastamiento con cuidado. Daño adicional al nervio durante la cirugía, como la tracción no deseada del nervio puede conducir a efectos secundarios no deseados como la automutilación. Por lo tanto, se recomienda una preparación cuidadosa del nervio, así como una administración de un analgésico durante un mínimo de dos días.

La evaluación multifactorial del comportamiento del motor puede caracterizar el fenotipo después de lesión del agobio del nervio en ratas en los varios niveles. Utilizamos la OFT, el análisis de la marcha de la pasarela XT, la tarea de caminar por la viga y la tarea de caminar por el peldaños de la escalera. Un procedimiento experimental cegado y el análisis de datos a los grupos experimentales es esencial para estos experimentos. Antes de la evaluación del comportamiento, los animales se aclimataron en la sala de pruebas en condiciones de prueba durante al menos 30 minutos. Todas las pruebas de comportamiento aplicadas en este documento tienen la ventaja de que no se requiere privación de alimentos o agua. El mismo grupo de animales se utilizó en todas las pruebas de comportamiento descritas. Se realizó un máximo de dos pruebas de comportamiento diferentes por día para cada animal. Si las pruebas de comportamiento se realizan a intervalos regulares, preste atención a un procedimiento comparable, como realizar la prueba en el mismo orden animal y a la misma hora del día. Otro aspecto importante para el análisis del comportamiento es el ciclo día-noche de las ratas. Considere un ciclo día-noche invertido para obtener niveles más naturales y más altos de actividad en el ciclo diurnos (ciclo oscuro). Esto tiene que ser considerado especialmente para la medición del comportamiento espontáneo, como la OFT. En este experimento, no se pudo implementar un ciclo día-noche invertido, pero se garantizó una aclimatación adecuada a las condiciones de prueba. Una iluminación perfecta es esencial para los videos de alta resolución para la tarea de caminar por el haz y la tarea de caminar por el peldaños de la escalera. Esta alta calidad de vídeo no se puede alcanzar cuando se realizan experimentos en la oscuridad.

La evaluación de la marcha requiere un rendimiento continuo de la tarea. El primer aspecto importante de una tarea continua es convencer a los animales para que crucen la configuración. Para aumentar la motivación, coloque pequeños pellets de alimentos (45 mg) al final de la configuración. Para que los animales se familiaricen con los pellets de alimentos, los pellets deben alimentarse con ellos antes de la prueba. Además, un cuadro de meta al final de la configuración puede ser útil. La configuración de la Pasarela ya incluye una caja de meta, pero las ratas a veces dudan en entrar en la caja de la meta. Alternativamente, puede agregar una jaula pequeña en la caja de la meta, pero la jaula casera de las ratas no cabe en la caja de la meta. Deje que la rata habitúe en la jaula durante unos minutos antes de la adquisición. Además, otra rata de la misma jaula de casa se puede colocar en la caja de la meta o en la jaula dentro de la caja de la meta. Asegúrese de que la segunda rata permanece en la caja y no bloquea la entrada a la caja de la meta. Además, también es posible quitar la caja de meta del sistema CatWalk y colocar la jaula de la casa de la rata al final de la pasarela, lo que permite a la rata entrar en su "territorio de origen" después de cada carrera. Para la configuración de la tarea de caminar por la viga y la tarea de caminar peldaños de escalera, recomendamos agregar una caja de meta o la jaula de inicio al final de la configuración. Para garantizar la consistencia, la pasarela, la tarea de caminar por la viga y la tarea de caminar por el peldaños de la escalera deben realizarse al menos una vez a la semana con seis a diez carreras.

Aunque no todos los análisis arrojaron diferencias significativas en este estudio, considere que una inclusión de animales modificados genéticamente o grupos de tratamiento podría producir datos valiosos que puedan distinguir entre grupos de las mismas pruebas de comportamiento.

Lesión del agobio del nervio no tenía ningún efecto sobre la actividad locomotriz de la rata, que fue medida en cinco minutos OFT. El análisis de la marcha de la pasarela XT es una herramienta más objetiva y sensible para analizar la colocación de la marcha, la pata y el dedo deldo del pies. Después de un entrenamiento intensivo, las ratas aprenden a cruzar la pasarela del aparato CatWalk XT a la configuración predeterminada. La lesión nerviosa no reduce la capacidad de las ratas para cruzar la pasarela. El cómputo automático de varios parámetros presenta los datos objetivamente. Se puede obtener información adicional mediante el uso del módulo "Mediciones interactivas de la huella" y, de hecho, estos análisis arrojaron diferencias significativas en varios parámetros de la dispersión del dedo del pie, la longitud de impresión y el ángulo de la pata con el eje del cuerpo comparando ratas con y sin lesión nerviosa.

Las ratas se pueden entrenar fácilmente para la tarea de caminar por la viga. Las diferencias en el tiempo de latencia para cruzar la viga y en el número de resbalones del pie por paso de la extremidad posterior lesionada por nervio se detectaron comparando ratas ingenuas con ratas aplastadas. Una desventaja de analizar ratas lesionadas por los nervios con la tarea de caminar por el haz es el tamaño del haz. Dentro de las primeras dos semanas después de la lesión por aplastamiento del nervio ciático, las ratas necesitan ayuda para cruzar el haz a medida que su equilibrio se deteriora. Aunque algunas ratas pueden ser capaces de cruzar el haz, el riesgo de lesiones causadas por una caída es alto. Por lo tanto, se debe ayudar a los animales aplastados por los nervios a cruzar el haz durante las dos primeras semanas después de la lesión por aplastamiento del nervio ciático o más tiempo, si es necesario. Sin embargo, es difícil comparar las carreras con y sin ayuda. Además, el equilibrio motor es un parámetro importante evaluado por la tarea de caminar por el haz. Considerábamo este parámetro para no ser relevante a nuestro modelo de la rata del aplastamiento del nervio. Por lo tanto, las puntuaciones descritas por Ohwatashi et al. y Johansson &ohlsson no pudieron ser utilizadas y las corridas con un recorrido de haz incompleto fueron excluidas para el análisis de los datos^18,19.

La escala de 7 categorías de Metz et al. puede analizar tanto las extremidades anteriores como las posteriores y distinguir entre los diferentes niveles de gravedad de los errores de todas las extremidades durante la tarea de caminar por el peldaños de la escalera^16,17. Analizando los errores más prominentes, que incluyen las categorías a partir de la 0 a 2, ningunas diferencias de errores por el paso se podrían detectar en el hindlimb al comparar las ratas nervio-heridas del peso con las ratas ingenuas del peso. Además, el tiempo de latencia de atravesar el aparato de peldaños de escalera no difirió entre las ratas wt lesionadas por el nervio y las ratas ingenuas wt. Los modelos de aprendizaje profundo podrían mejorar y acelerar el análisis de datos de la tarea de caminar por el peldaños de la escalera a través de un enfoque automatizado.

Es importante mencionar que la lesión por aplastamiento nervioso, así como todas las pruebas de comportamiento descritas, se pueden traducir fácilmente a los ratones, adaptando los ajustes y tamaños de las configuraciones. El uso de ratones como organismo modelo tiene el efecto beneficioso que existen modelos transgénicos para muchas enfermedades humanas.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid, ≥99.8%	Sigma-Aldrich	33209-1L
Appose ULC skin stapler 35W	Covidien	8886803712
Beam	self made
Bepanthen eye cream	Bayer Vital GmbH	81552983
Box for OFT	self made
Camcorder GC-PX100	JVC
Catwalk XT	Noldus		setup and software
Chamber for isofluran	GT-Labortechnik		custom made
Disposable scalpel No. 11	Feather	20.001.30.011
Dräger Vapor 19.3 isoflurane system	Dr. Wilfried Müller GmbH
Dumont #2 - laminectomy forceps	Fine Science Tools	11223-20
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools	11251-30	super-fine
Dustless precision pellets 45 mg	Bio-Serv	F0021
EthoVision XT	Noldus		setup and software
Forceps 160 mm	Hartenstein	PZ09
Gas anesthesia mask, rat	Dr. Wilfried Müller GmbH
Goal box for ladder rung walking task apparatus	self made
Hair clipper Magnum 5000	Wahl GmbH
Hardened fine scissors	Fine Science Tools	14090-11
Heating table	MEDAX	13801
Isofluran CP 1ml/ml, 250 ml	cp-pharma	1214	prescription needed
Kinovea	www.kinovea.org
Ladder rung walking task apparatus	self made
Needleholder	KLS Martin	20-526-14-07
Octeniderm	Schülke	118211
Rimadyl 50 mg/ml, injectable	Zoetis		Carprofen, prescription needed
Rubber band retractors	self made
Spacer for beam	self made
Spacer for ladder rung walking task apparatus	self made
Suture Silkam 4/0 DS 19	B. Braun	C0762202
Ultra fine hemostats (non-serrated clamp)	Fine Science Tools	13020-12