Avaliação multifatorial do comportamento motor em ratos após lesão unilateral do esmagamento do nervo ciático

Resumo

Fornecemos um protocolo para a avaliação do comportamento motor através de uma bateria de teste comportamental em ratos após lesão de esmagamento do nervo ciático.

Resumo

A indução de uma lesão nervosa periférica é um método amplamente utilizado na neurociência para a avaliação de mecanismos de reparação e dor, entre outros. Além disso, no campo de pesquisa de distúrbios do movimento, a lesão por esmagamento ciático foi empregada para desencadear um fenótipo semelhante à distonia em modelos de roedores DYT-TOR1A geneticamente predispostos de distonia. Para alcançar resultados consistentes, reprodutíveis e comparáveis após uma lesão de esmagamento do nervo ciático, um método padronizado para induzir o esmagamento nervoso é essencial, além de uma caracterização fenotípica padronizada. Deve-se prestar atenção não apenas à variedade específica de testes comportamentais, mas também aos requisitos técnicos, à execução correta e à análise de dados consecutivas. Este protocolo descreve em detalhes como realizar uma lesão de esmagamento do nervo ciático e fornece uma bateria de teste comportamental para a avaliação de déficits motores em ratos que inclui o teste de campo aberto, a análise da marcha CatWalk XT, a tarefa de caminhada do feixe e a tarefa de caminhada de degraus da escada.

Introdução

Os roedores são excelentes organismos modelo para aprofundar a compreensão das doenças humanas^1,2, testando hipóteses em múltiplos níveis biológicos. Um nível biológico fundamental para a caracterização dos modelos de roedores é o nível de fenótipo, medido por avaliações comportamentais. Dependendo do modelo animal e da questão da pesquisa científica, a seleção de uma poderosa e confiável bateria de teste comportamental é essencial para cobrir uma ampla gama de aspectos comportamentais, como para modelos animais da doença de Parkinson e distonia^3,4,5,6.

O nervo ciático é o maior nervo do corpo humano com motor, bem como fibras sensoriais. Lesões do nervo ciático podem resultar facilmente de uma variedade de eventos, como acidentes de trânsito e cirurgias^7,8. Portanto, as atividades de pesquisa utilizando modelos de roedores com lesões no nervo ciática, são de valor traduções relevantes. Embora o aspecto translacional da regeneração nervosa de rato para humano tenha que ser considerado criticamente⁹, a lesão do esmagamento do nervo ciático (axonotmesis) em modelos de roedores é um método comumente usado para analisar processos de degeneração e regeneração dos nervos periféricos^10,11. Em caso de lesão por esmagamento, o nervo não é completamente transcectado. Danifica o axônio, resultando em bloqueio de condução logo após lesão por esmagamento seguido de processos regenerativos ^4,12,13.

Além disso, na pesquisa da distonia, a lesão unilateral do esmagamento do nervo ciático é um método estabelecido para desencadear movimentos semelhantes à distonia (DLM) em modelos de roedores de distonia geneticamente predispostos, que não mostram DLM por se^4,14. Supõe-se que o trauma nervoso periférico perturba a integração sensorial afetando as fibras nervosas ciáticas, responsáveis pelas funções motoras e sensoriais¹⁵.

Nós fornecemos aqui uma descrição detalhada para uma lesão de esmagamento padronizada do nervo ciático e uma bateria de avaliações de comportamento motor que é composta do teste de campo aberto (OFT), análise de marcha CatWalk XT, tarefa de caminhada do feixe e tarefa de caminhada de degrau de escada em ratos selvagens ingênuos (wt) e ratos wt cinco semanas após lesão unilateral do nervo ciático (n= 10). O OFT fornece informações sobre a atividade locomotor geral, enquanto uma análise detalhada da marcha é realizada pelo sistema automatizado de análise de marcha CatWalk XT. A tarefa de caminhada do feixe é usada para avaliar a coordenação motora, avaliando o tempo para atravessar a viga e o número de erros de colocação do pé. Para análise de desempenho de marcha, a tarefa de caminhada de degraus da escada fornece informações sobre a colocação do pé ou da pata e erros em um aparelho de degrau horizontal da escada com um padrão de degrau constante, mas irregular.

Protocolo

Todos os experimentos em animais foram aprovados pelas autoridades locais no Regierung von Unterfranken (Würzburg, Alemanha) e realizados de acordo com as diretrizes internacionais, nacionais e/ou institucionais aplicáveis para o cuidado e o uso dos animais.

1. Lesão por esmagamento do nervo ciático

NOTA: Mantenha um ambiente estéril durante todo o procedimento cirúrgico. Coloque a mesa de cirurgia com o equipamento necessário.

1. Anestesia profundamente o rato em um armário fechado com isoflurane 3,0% em O₂ (2 L/min). Remova o rato do armário. Raspe uma extensa área da perna traseira direita.
2. Posicione o rato na máscara de anestesia e continue anestesia profunda com isoflurano 2,0% em O₂ (2 L/min). Controle a profundidade da anestesia beliscando a teia interdigital dos pés traseiros. A ausência de reflexos de abstinência indica uma anestesia adequada.
3. Conserte o tronco e os dois blocos traseiros do rato com fita. Coloque os dois obstáculos em uma posição simétrica e estendida, virando a pata plana para a mesa de cirurgia.
4. Aplique pomada oftálmica nos olhos para evitar olhos secos. Desinfete a pele da área raspada com um antisséptico.
5. Procure o entalhe ciático do ílio.
6. Faça uma incisão da pele do entalhe ciático na direção da pata com um bisturi. A incisão da pele deve ser o menor possível (aproximadamente 1 a 2 cm).
7. Se os obstáculos forem fixados e a incisão da pele for realizada corretamente, pode-se ver uma cavidade no plano fascial entre o músculo glúteo máximo e o músculo fêmio do bíceps femoris que se assemelha a uma "linha branca". Insira fórceps hemostáticos super finos fechados (nº 5) na cavidade e espalhe os fórceps. O avião fascial deve se abrir sem ferir nenhum tecido muscular.
8. Coloque os retráteis do elástico sob os músculos, para manter a incisão da pele aberta.
9. Remova suavemente qualquer tecido circundante e vasos sanguíneos do nervo ciático até que o nervo esteja completamente exposto. É importante não esticar ou puxar o nervo durante todo o procedimento.
10. Esmague o nervo ciático com um grampo não serrilado (hemostato ultrafina) com pressão constante e reprodutível. Para isso, abra o grampo, coloque o nervo sobre a mandíbula inferior do grampo e feche o grampo trancando-o na primeira posição por três vezes dez segundos. A posição do esmagamento do nervo ciático está localizada perto do entalhe ciático, proximal ao local de divisão do principal feixe de nervo ciático. Após a lesão da queda, reabra o grampo cuidadosamente. O local de esmagamento do nervo ciático parece translúcido.
11. Remova os retratores do elástico.
12. Feche a incisão do avião fascial com sutura 4-0 resorbável. Feche a incisão da pele com grampos de pele corporal.
13. Aplique Rimadyl de acordo com as diretrizes do GV-SOLAS (5 mg/kg de peso corporal, injeção subcutânea) para alívio da dor pós-operatória a cada 24 horas após a cirurgia por dois dias.
14. Remova o rato da configuração da cirurgia. Coloque o rato em uma gaiola limpa sem dormir em uma placa de aquecimento (37 °C) até que o rato esteja acordado. Mova o rato de volta para a gaiola limpa.
15. Remova os grampos da pele do corpo de quatro a seis dias após a cirurgia.

2. Teste de campo aberto (OFT)

NOTA: A atividade locomotor, bem como a atividade comportamental podem ser analisadas pelo OFT.

1. configuração
   1. Configure o OFT (Figura 1A) em um ambiente escuro e silencioso. Consiste no sistema automatizado de rastreamento de vídeo EthoVision XT (computador, software com licença) e uma arena de 58,5 cm (comprimento) x 58,5 cm (largura) x 45 cm (altura) com uma superfície preta resistente a riscos e limpa. A superfície negra é importante para aumentar o contraste ao rastrear animais brancos.
2. avaliação
   1. Coloque a arena e a câmera na posição correta. Ajuste a câmera que toda a caixa de campo aberto com a melhor resolução é gravada. Realize o experimento em um ambiente escuro. Se for necessário luz para a configuração, use uma luz pequena e difusa para evitar pontos de luz, reflexos e sombras na arena. Assegure condições de luz iguais medindo a iluminação com um medidor de lux em diferentes áreas da arena.
   2. Configure o software EthoVision XT. As configurações mais importantes estão listadas no seguinte. Nas Configurações do experimento, escolha o rastreamento ao vivo para a fonte de vídeo e a detecção de ponto central para os recursos rastreados. Validar o tamanho da arena nos Cenários da Arena. Defina a condição de início para aquisição de dados para três segundos após o rato ser colocado no meio da arena e o tempo total de execução para cinco minutos em Configurações de Controle de Tentativa. Escolha subtração estática para o Método em Configurações de Detecção. Marque o vídeo Salvar para método em configurações de aquisição.
   3. Coloque o rato suavemente no meio da arena de testes(Figura 1B).
   4. Pressione o botão Iniciar teste no controle de aquisição para iniciar a gravação.
   5. Durante a gravação, fique longe da configuração OFT para evitar distrair o rato.
   6. Após cada ensaio, remova o rato suavemente da arena de testes e limpe a configuração com ácido acético de 0,1% para evitar distração pelo cheiro do rato previamente gravado.
3. análise de dados
   1. Para a análise de dados do OFT com o software EthoVision XT, vá até a seção Análise na barra lateral esquerda e escolha Acompanhar a visualização na guia Resultados (Figura 1C). Em seguida, exporte os parâmetros necessários para o Excel. Dentro do software, escolha uma série de variáveis de diferentes categorias para análise de dados. Variáveis importantes para este objetivo científico específico são "Distância movida" e "Velocidade" na categoria "Distância e Tempo". Realizar uma análise estatística dos parâmetros selecionados(Figura 1D).

3. Análise da marcha CatWalk XT

NOTA: Uma análise de marcha através do sistema CatWalk XT pode ajudar a avaliar muitos parâmetros diferentes sobre as pegadas, postura e marcha dos modelos animais. Uma passarela de vidro é iluminada com luz verde e a luz espalhada pelas pegadas dos animais é capturada com uma câmera de vídeo de alta velocidade, que está localizada sob a passarela. Os sinais podem ser analisados com o software CatWalk XT.

1. configuração
   1. Para análise de marcha com o CatWalk XT, use o sistema CatWalk e o software correspondente (computador, software com licença) (Figura 2A).
   2. Realize o experimento em condições escuras, pois a aquisição de dados depende da iluminação da passarela do sistema CatWalk com luz LED verde. Para facilitar o procedimento experimental em condições escuras, ilumine a sala experimental com luz vermelha.
   3. Utilize uma passarela definida que mede 65 cm de comprimento e 7 cm de largura; no entanto, o tamanho da passarela depende do tamanho dos ratos. Configure a passarela o maior possível para gravar o máximo de pegadas possível para cada pata.
   4. Capture um número mínimo de três pegadas por pata para cada corrida. Ao definir o comprimento da passarela, considere o corpo e a cauda do rato, pois o sinal de partida ou parada pode não ser detectado corretamente e as corridas podem não ser classificadas como compatíveis, se o corpo/cauda entrar ou permanecer na passarela definida antes ou após a conclusão da corrida.
2. formação
   NOTA: Treinar os ratos para o sistema CatWalk é necessário para habituar os animais à configuração e permitir que eles aprendam a atravessar a passarela sem qualquer interrupção. O treinamento adequado oferece as vantagens de economizar tempo durante a avaliação experimental e obter melhores resultados. Iniciar a aquisição de dados do sistema CatWalk durante as sessões de treinamento permite que os ratos se acostumem com as condições de avaliação (ruído/luz).
   1. Comece a configurar o sistema CatWalk.
      1. Limpe a passarela de vidro com água destilada e um pano macio sem fiapos. No início e no final do experimento, ou no meio se a passarela de vidro estiver suja, use fluido de limpeza de vidro e pano macio sem fiapos para limpar a passarela de vidro. Após o uso de fluido de limpeza de vidro, limpe a passarela de quaisquer resíduos do fluido para evitar que ele distraia o animal.
      2. Escolha as configurações experimentais. Um parâmetro importante é o Run Criteria. Defina os valores apropriados para duração mínimade execução, duração máximade execução e número mínimo de corridas compatíveis para adquirir,que são específicos para cada projeto de pesquisa. Marque a caixa de uso de variação de velocidade máxima permitida e defina o valor. Os critérios de Run podem ser ignorados nos primeiros quatro a cinco dias de treinamento.
      3. Coloque a câmera em posição e ajuste o foco. Encontre a posição ideal da câmera para obter um comprimento apropriado da passarela e a melhor resolução das patas gravadas simultaneamente. Rotule a posição da câmera no sistema CatWalk para garantir a colocação idêntica da câmera entre as gravações.
      4. Configure as configurações de detecção usando a detecção automática para um novo experimento. Certifique-se de que todas as pegadas podem ser detectadas com ruído de fundo mínimo . Se necessário, otimize as configurações de detecção manualmente e altere o Limiar de Intensidade Verde. Use as mesmas configurações de detecção para todo o experimento.
      5. Coloque as paredes do corredor do sistema CatWalk. As paredes do corredor devem estar o mais perto possível do rato. Certifique-se de que as paredes do corredor permaneçam paralelas à passarela.
      6. Defina o comprimento da passarela: Clique no ícone Definir passarela. Ajuste o tamanho do retângulo branco em comprimento e largura, de acordo com o projeto de pesquisa específico. Clique em OK.
      7. Calibrar a passarela: Clique no ícone Da Passarela Calibrada. Posicione uma folha de calibração retangular medindo 20 x 10 cm no meio da passarela. Adapte o tamanho do retângulo branco à folha de calibração. Clique em OK.
      8. Em seguida, clique uma imagem de fundo: Verifique de antemão que a passarela está limpa e vazia. Clique no botão "Colocar fundo" para gerar uma imagem de fundo.
   2. Treine animais por pelo menos oito dias antes de começar o experimento real. Recomenda-se o treinamento em dias sucessivos.
      1. Primeiro dia de treinamento: Para que os ratos se acostumem com o sistema CatWalk, permita que o animal explore livremente a passarela e a caixa de gol. Deixe os ratos praticarem cruzar a passarela e entrar na caixa de gol. Pegue o rato no final da passarela ou na caixa de gol e traga o rato de volta ao ponto de partida da passarela. Cinco corridas são recomendadas para o primeiro dia de treinamento sem necessidade de conformidade com as configurações experimentais.
      2. Dia 2 de treinamento: Os ratos podem explorar livremente a passarela e a caixa de gol. Cinco corridas são recomendadas sem conformidade com as configurações experimentais.
      3. Dia 3 de treinamento: Oito corridas são recomendadas sem conformidade com as configurações experimentais.
      4. Dia 4 de treinamento: Dez corridas são recomendadas sem conformidade com as configurações experimentais.
      5. Dia 5 de treinamento: Dez corridas são recomendadas. As configurações experimentais devem ser mantidas em mente. Motivar os ratos a atravessar a passarela sem qualquer interrupção.
      6. Dia 6 de treinamento: Dez corridas são recomendadas. As configurações experimentais devem ser mantidas em mente. Motivar os ratos a atravessar a passarela sem qualquer interrupção.
      7. Dia 7 de treinamento: Dez corridas são recomendadas. Um mínimo de três corridas compatíveis deve ser alcançado. Adicione mais corridas para os animais, se eles não foram capazes de alcançar este objetivo.
      8. Dia 8 de treinamento: Dez corridas são recomendadas. Um mínimo de três corridas compatíveis deve ser alcançado. Adicione mais corridas para os animais, se eles não foram capazes de alcançar este objetivo.
3. avaliação
   1. De acordo com os critérios de execução definidos, realize três corridas compatíveis por rato para análise de dados. Para a avaliação, siga as etapas 3.2.1. - 3.2.1.8. como descrito na seção de treinamento. Mesmo que o rato atinja três corridas compatíveis nas três primeiras corridas, realize um mínimo de seis corridas por sessão/semana para fins de treinamento.
   2. Realize pelo menos uma sessão (de treinamento) com seis corridas por semana para um padrão de marcha estável para experimentos com vários pontos de tempo. As configurações experimentais e de detecção permanecem consistentes durante todo o experimento.
4. análise de dados
   1. Para análise de dados, apenas avalie as corridas compatíveis. Exclua as corridas não compatíveis.
   2. Verifique o Limiar de Intensidade Verde e aumente ou diminua o limiar de intensidade verde antes da classificação das impressões da pata, se necessário. O Limiar de Intensidade Verde deve ser consistente para todos os animais e todas as corridas.
   3. Classificar as impressões da pata automaticamente com o software CatWalk XT(Figura 2B).
   4. Revise as etiquetas de impressão da pata manualmente. Corrija as etiquetas de impressão da pata errada, adicione etiquetas de impressões de patas não detectadas e exclua ruídos e etiquetas erradas manualmente. Mova o vídeo para uma posição, que tem que ser revisada manualmente. Para correção de impressões erradas da pata rotulada, selecione o retângulo da impressão específica da pata, clique em Redefinir, selecione o mesmo retângulo novamente e atribua o rótulo correto da lista. Para rotular impressões de pata não detectadas, desenhe um retângulo ao redor da pata não detectada, clique em Adicionar impressão,selecione o novo retângulo gerado e atribua o rótulo correto da lista. Caso o software seja rotulado automaticamente para imprimir o nariz ou o corpo, selecione o retângulo da etiqueta específica e clique em Remover impressão.
   5. Reveja os resultados numéricos. Os resultados numéricos são exibidos em uma folha de excel, mostrando uma série de parâmetros básicos. Escolha parâmetros específicos pré-definidos, dependendo do interesse da pesquisa e realize a análise estatística como de costume(Figura 2D).
   6. Para obter informações mais detalhadas sobre cada pegada, classifique os dedo dos dedo das patas traseiras. Esta análise requer o módulo Interactive Footprint Measurements.
      1. Adapte o Limiar de Intensidade Verde para a análise de medições de pegada interativa, se necessário. O Limiar de Intensidade Verde deve ser consistente para todos os animais e todas as corridas.
      2. Ajuste os marcadores para a análise da pegada manualmente. Analise cada impressão da pata traseira nas três corridas compatíveis. Desenhe uma linha do centro do primeiro dedo do dedo para o centro do quinto dedo do dedo para medir "Dedo Doe Spread". Desenhe uma linha do centro do segundo dedo para o centro do quarto dedo para medir "Intermediário Dedo do Dedo Doe Spread". Desenhe uma linha do centro do terceiro dedo do pé até o calcanhar da pata traseira para medir "Comprimento de impressão manual"(Figura 2C).
      3. Revise os resultados numéricos das "Medidas interativas de pegada" exibidas em uma folha separada. Selecione parâmetros específicos das "Medições interativas de pegada" e realize análises estatísticas como de costume(Figura 2E).

4. Tarefa de caminhada de vigas

NOTA: Os déficits de marcha podem ser determinados pela tarefa de caminhada do feixe. O foco da tarefa de caminhada do feixe neste tópico específico de pesquisa será a análise da coordenação motora, definida como a capacidade de coordenar a ativação muscular a partir de múltiplas partes do corpo, e não a avaliação do equilíbrio motor, definida como a capacidade de controle postural durante os movimentos do corpo.

1. configuração
   1. Para a tarefa de caminhada do feixe, use um feixe, espaçador, mesa, fundo uniforme e uma filmadora(Figura 3A).
   2. Use um feixe de madeira de 90 cm de comprimento, 1,7 cm de largura e 2 cm de altura. Recomenda-se uma plataforma de 20,5 cm de comprimento, 15 cm de largura e 2 cm de altura em ambas as extremidades do feixe. Use o mesmo material para as plataformas e o feixe, evite quaisquer barreiras entre as plataformas e o feixe.
   3. Tenha a distância entre o feixe e a mesa ser de pelo menos 44 cm. Um ambiente familiar, como uma gaiola doméstica, motiva os ratos a atravessar a viga, que pode ser colocada no final da plataforma de feixe.
2. formação
   1. Coloque a viga com espaçador e gaiola em casa na mesa.
   2. Treine animais por sete dias. Recomenda-se o treinamento em dias sucessivos.
      1. Dia 1 de treinamento
         1. Coloque todos os ratos de uma gaiola na plataforma inicial da viga.
         2. Deixe os ratos explorarem o ambiente (plataforma/feixe).
         3. Segure um rato cuidadosamente pela cauda e leve o rato até o feixe empurrando o rato suavemente para a viga.
         4. Ajude o rato a atravessar a viga segurando o rato pela cauda por pelo menos duas corridas.
         5. Deixe o rato atravessar a viga por mais três corridas sem assistência. Observe o rato e forneça assistência, se necessário. Se o rato não atravessar o feixe, intercepte a queda para evitar ferimentos e o desenvolvimento do medo para atravessar o feixe.
         6. Continue com este procedimento para todos os ratos.
            NOTA: Às vezes, os ratos se seguem para atravessar o feixe, nesse caso não é necessária nenhuma assistência. No entanto, é importante observar os ratos, interceptar quedas e prestar assistência, se necessário.
      2. Dia 2 de treinamento
         1. Coloque todos os ratos de uma gaiola na plataforma inicial da viga.
         2. Deixe os ratos atravessarem o feixe seis vezes.
         3. Se necessário, forneça assistência e intercepte quedas.
      3. Dia 3 de treinamento
         1. Coloque um rato na plataforma inicial da viga.
         2. Deixe o rato atravessar o feixe seis vezes.
         3. Se necessário, forneça assistência e intercepte quedas.
      4. Dia 4-7 de treinamento
         1. Coloque um rato na plataforma inicial da viga.
         2. Deixe o rato atravessar o feixe dez vezes.
         3. Se necessário, forneça assistência e intercepte quedas.
         4. Ao final do treinamento, o rato deve atravessar a viga sem qualquer interrupção por pelo menos três corridas. É permitido empurrar suavemente o rato na plataforma inicial para desencadear o início do movimento.
3. avaliação
   1. Coloque a viga com espaçador e gaiola em casa na mesa.
   2. Coloque a filmadora na posição, alinhada paralelamente ao feixe com o animal em foco. A posição da filmadora deve ser o mais próxima possível do animal para alcançar a resolução ideal dos movimentos registrados. O feixe e partes de ambas as plataformas devem ser capturados pela gravação.
   3. Inicie a gravação e primeiro identifique a sessão e o animal.
   4. Coloque o rato na plataforma inicial da viga.
   5. O rato deve atravessar a viga três vezes sem qualquer interrupção. Mesmo que o rato atinja três corridas compatíveis nas três primeiras corridas, realize um mínimo de seis a dez corridas para desempenho contínuo da tarefa.
   6. Sempre, observe o animal e intercepte quedas, se necessário.
   7. Após a tarefa, limpe o feixe e a mesa com ácido acético de 0,1% para evitar distração pelo cheiro do rato previamente registrado.
      NOTA: Nas duas primeiras semanas após a lesão do esmagamento nervoso, os ratos são incapazes de atravessar o feixe sem assistência. Portanto, a assistência deve ser fornecida para seis a oito corridas nas duas primeiras semanas após lesão de esmagamento nervoso. Da semana três à quinta semana, cinco corridas são realizadas com assistência e outras dez corridas foram realizadas sem assistência.
4. análise de dados
   1. Use o software gratuito de análise de vídeo Kinovea para análise de dados.
   2. Selecione as sequências de vídeo de três corridas compatíveis da gravação. Para isso, escolha as três primeiras corridas compatíveis que foram realizadas sem assistência do animal. Seja consistente na seleção de corrida compatível para todos os ratos.
   3. Defina o ponto de tempo de partida e o ponto de tempo final das três corridas compatíveis selecionadas(Figura 3D-E). Nesta configuração, o ponto de partida foi rotulado por uma linha preta na trave e a colocação do primeiro hindlimb atrás da linha preta definiu o ponto de partida da corrida. A colocação do primeiro bloco traseiro na plataforma no final do feixe define o ponto de tempo final.
   4. Em seguida, calcule o tempo necessário para o rato atravessar a viga. Informe os dados como tempo de latência para cruzar o feixe em segundos e realizar análises estatísticas como de costume(Figura 3B).
   5. Marque o número de etapas e erros de três corridas compatíveis para ambos os blocos traseiros separadamente usando a função zoom e câmera lenta do software. Os erros incluem deslizamentos totais do pé e deslizamentos de meio pé. Um deslizamento total do pé é definido como uma colocação do pé que é seguida por um deslizamento profundo causando uma perda de contato da pata afetada com a viga(Figura 3F). Um meio deslize é definido como uma pata deslizando para fora da parede lateral da viga sem perder contato completo com a viga (Figura 3G).
   6. Calcule a porcentagem de deslizamentos de pé em relação ao número de passos para atravessar o feixe ((número de deslizamentos de pé do membro x 100%)/ número de passos do mesmo membro). Apresentar dados como percentual de deslizamentos de pé e realizar análise estatística como de costume(Figura 3C).

5. Tarefa de caminhada de degrau de escada

NOTA: A tarefa de caminhada do degrau da escada pode avaliar a função motora, a colocação de barras dianteiras e de barras traseiras e a coordenação interlimb.

1. configuração
   1. Use um aparelho de degrau de escada, espaçador, mesa, fundo uniforme e filmadora para este teste comportamental(Figura 4A). O aparelho de degrau de escada horizontal consiste em degraus metálicos e paredes laterais de policarbonato claros. O aparelho tem um comprimento de 119,5 cm e a largura é ajustada para 7,4 cm. A passarela a ser analisada tem um comprimento de 100 cm.
   2. Rotule o ponto de partida e final com uma linha preta na parede lateral. Coloque os espaços reservados para os degraus do aparelho em intervalos de 1 cm. Organize um padrão irregular dos degraus para a passarela de 100 cm com uma distância entre 1 e 5 cm entre os degraus. Os primeiros 10 cm no início e os últimos 9,5 cm no final do aparelho, que são excluídos da análise, têm um padrão regular dos degraus com uma distância de 1 cm.
   3. Use uma distância entre a passarela e a mesa de aproximadamente 30 cm (Figura 4A-B). Uma caixa de gol ou um ambiente familiar no final do aparelho, como uma gaiola em casa, motiva os ratos a atravessar o aparelho de degrau da escada.
2. formação
   1. Configure o aparelho de degrau da escada com espaçador e caixa de gol na mesa.
   2. Treine animais por oito dias. Recomenda-se o treinamento em dias sucessivos.
      1. Dia 1 de treinamento
         1. Coloque todos os ratos de uma gaiola no aparelho de degrau da escada.
         2. Deixe que os ratos explorem o ambiente (aparelho de degrau/caixa de gol).
         3. Empurre suavemente os ratos para a direção da caixa de gol. Ajude os ratos a entrar na caixa de gol. Deixe os ratos explorarem a caixa de gols por um tempo.
         4. Afinal, os ratos entraram na caixa de gols. Pegue o primeiro rato da caixa de gol e coloque o rato na zona inicial do aparelho novamente. Continue com o mesmo procedimento para todos os ratos de uma gaiola. Empurre suavemente os ratos para a direção da caixa de gol e dê assistência para entrar na caixa de gol, se necessário.
         5. Deixe o rato atravessar o aparelho quatro vezes.
      2. Dia 2 de treinamento
         1. Realize o mesmo protocolo listado para o primeiro dia de treinamento.
         2. Deixe o rato atravessar o aparelho seis vezes.
      3. Dia 3 de treinamento
         1. Realize o mesmo protocolo listado para o primeiro dia de treinamento.
         2. Deixe o rato atravessar o aparelho oito vezes.
      4. Dia 4 de treinamento
         1. Coloque um rato no início do aparelho de degrau da escada.
         2. Se o rato não atravessar o aparelho e entrar na caixa de gol voluntariamente, dê assistência empurrando suavemente o rato por trás.
         3. Deixe o rato atravessar o aparelho oito vezes.
      5. Dia 5-8 de treinamento
         1. Coloque um rato no início do aparelho de degrau da escada.
         2. Se o rato não atravessar o aparelho e entrar na caixa de gol voluntariamente, dê assistência empurrando suavemente o rato por trás.
         3. Deixe o rato atravessar o aparelho dez vezes.
         4. Ao final do treinamento, o rato deve ser capaz de atravessar a passarela sem qualquer interrupção e assistência para um mínimo de três corridas. É permitido dar ao rato um empurrão suave na zona de partida para desencadear o início do movimento.
3. avaliação
   1. Configure o aparelho de degrau da escada com espaçador e caixa de gol na mesa.
   2. Coloque a filmadora em posição, alinhada paralelamente ao aparelho com o animal em foco. Posicione a filmadora o mais perto possível do animal para obter a resolução ideal dos movimentos gravados e garantir que todo o aparelho de degrau da escada seja capturado na gravação.
   3. Inicie a gravação e primeiro identifique a sessão e o animal.
   4. Coloque o rato na zona de partida do aparelho de degrau da escada.
   5. O rato tem que atravessar a passarela de 100 cm do aparelho de degrau da escada três vezes sem qualquer interrupção para que ele se qualifique como uma corrida compatível. Mesmo que o rato atinja três corridas compatíveis nas três primeiras corridas, um mínimo de dez corridas deve ser realizada para o desempenho contínuo da tarefa.
   6. Após a tarefa, limpe o aparelho e a mesa com ácido acético de 0,1% para evitar distração pelo cheiro do rato previamente registrado.
4. análise de dados
   1. Use o software gratuito de análise de vídeo Kinovea para análise de dados.
   2. Selecione as sequências de vídeo de três corridas compatíveis da gravação. Escolha as três primeiras corridas compatíveis para análise de dados.
   3. Defina o ponto de tempo de partida e o ponto de tempo final das três corridas compatíveis selecionadas. A colocação do primeiro bloco traseiro atrás da primeira linha preta na parede lateral do aparelho, que rotula o ponto de partida da passarela de 100 cm, define o ponto de partida da corrida. A colocação da primeira linha dianteira atrás da segunda linha preta na parede lateral do aparelho, que rotula o ponto final da passarela de 100 cm, define o ponto final da corrida.
   4. Identifique o ponto de tempo de início e fim. Em seguida, calcule a duração da corrida através da passarela. Informe os dados como tempo de latência para atravessar a passarela em segundos e realizar análises estatísticas como de costume(Figura 4C).
   5. Marque as três corridas compatíveis com a escala de 7 categorias de Metz et al. usando a câmera lenta ou a função quadro por quadro do software (Figura 5)^16,17. Determine o número de etapas e o número de erros de acordo com as categorias da escala para cada membro separadamente. A escala distingue entre as seguintes categorias: (0) total falta (1) deslizamento profundo (2) leve deslizamento (3) substituição (4) correção (5) colocação parcial e (6) colocação correta. Apenas o erro do membro iniciado foi classificado. Outros erros, desencadeados pelo erro inicial, não devem ser avaliados.
   6. Calcule os erros/passo considerando os seguintes requisitos. As categorias (0) total de falta (1) deslizamento profundo (2) leve contagem de deslizamento como erro. Divida o número de erros pelo número de etapas para cada etapa e cada execução separadamente. Determine o valor médio das três corridas compatíveis para cada animal e cada posterior de forma separada e realize análise estatística como de costume(Figura 4D).

Resultados

Os resultados representativos dos cinco minutos de OFT mostram que a lesão por esmagamento nervoso de cinco semanas após a cirurgia não tem efeito sobre a atividade locomotor(Figura 1).

A análise da marcha com o sistema CatWalk XT(Figura 2)gera muitos parâmetros diferentes. Os parâmetros seletivos foram estatisticamente analisados comparando-se ratos ingênuos wt com ratos wt feridos pelo nervo cinco semanas após o esmagamento do nervo(Figura 2D). Alterações significativas podem ser detectadas para a velocidade média de corrida, o comprimento do passo e a área de impressão da pata traseira lesionada (direita). Uma análise mais detalhada da pata traseira lesionada pelo nervo foi realizada com o módulo "Medidas interativas de pegada". Uma redução significativa dos parâmetros de propagação do dedo do dedo, propagação intermediária do dedo do dedo e comprimento de impressão foram observados em ratos wt feridos nervosos em comparação com ratos ingênuos wt. Além disso, o eixo do corpo do ângulo da pata e o vetor de movimento do ângulo da pata diferem significativamente quando comparamos ratos wt feridos pelo nervo com ratos ingênuos wt(Figura 2E).

A Figura 3 apresenta dados de coordenação motora obtidos através da avaliação da tarefa de caminhada do feixe. Ratos wt feridos por nervos mostraram um tempo de latência significativamente aumentado para atravessar o feixe em comparação com ratos ingênuos wt cinco semanas após lesão(Figura 3B). Como uma leitura adicional da tarefa de caminhada do feixe, foram contados deslizes completos e meio deslizes da barra traseira lesionada pelo nervo e considerados como um erro para análise estatística. A porcentagem de erros por passo da escalada de posteriores (direita) lesionada pelos nervos foi significativamente aumentada em ratos wt feridos pelo nervo em comparação com ratos ingênuos wt.

Os dados representativos da tarefa de caminhada do degrau da escada (Figura 4) não mostram alterações significativas no tempo de latência para atravessar a passarela do aparelho de degrau da escada (Figura 4C) ou na porcentagem de erros por passo do posterior de lesão nervosa (direita)(Figura 4D). A análise do percentual de erro por etapa do posterior lesado por nervo considerou apenas o escore de 0 a 2 da escala de 7 categorias de Metz et al. A distribuição de todas as categorias de pontuação por passo da escala de 7 categorias do hindlimb lesionado nervoso e do posterior lesionado não-nervoso (esquerda) é ilustrada na Figura 4E.

Figura 1: Avaliação da atividade locomotor durante o teste de campo aberto. (A) Imagem da configuração do teste de campo aberto. Imagem selecionada subtraída de um vídeo gravado durante o teste de campo aberto mostrando um rato na arena de campo aberto sem (B) e com (C) rastreamento. (D) A velocidade durante uma gravação de teste de campo aberto de cinco minutos foi investigada em ratos ingênuos e ratos wt cinco semanas após lesão de esmagamento nervoso. Os dados são apresentados como média ± SEM. A análise estatística foi realizada utilizando-se o teste t não pago dos dados normalmente distribuídos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Análise de marcha com o sistema CatWalk XT. (A) Imagem do aparelho CatWalk XT. (B) Exemplos da visualização de impressão mostrando as impressões da pata rotulada no modo de cor falsa e exemplos da visualização de tempo mostrando o diagrama de marcha baseado no tempo de ratos ingênuos e ratos wt cinco semanas após a lesão do esmagamento do nervo. (C) Exemplos da classificação do dedo do pé mostrando o spread do dedo do pé (TS), a propagação intermediária do dedo do pé (ITS) e o comprimento da impressão (PL), bem como exemplos da visão do eixo do corpo mostrando o eixo do corpo (linha branca) e o vetor de movimento (linha vermelha) de ratos ingênuos wt e ratos wt cinco semanas após lesão de esmagamento nervoso. (D) Dados dos parâmetros selecionados da classificação "padrão" comparando ratos ingênuos e ratos wt cinco semanas após lesão por esmagamento nervoso. (E) Dados dos parâmetros selecionados do "Módulo de Medição de Pegada Interativa" comparando ratos ingênuos e ratos wt cinco semanas após a lesão do esmagamento nervoso. Os dados são mostrados como médias ± SEM. A análise estatística foi realizada utilizando-se o teste t não pago dos dados normalmente distribuídos, teste t não pago com a correção de Welch de dados normalmente distribuídos com variância desigual e teste Mann-Whitney U dos dados distribuídos não normais. O valor P < 0,05 foi definido como estatisticamente significativo rotulado como *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Análise de marcha com a tarefa de caminhada do feixe. (A) Desenhos de imagem e esquema da configuração da tarefa de caminhada do feixe. O tempo de latência para atravessar o feixe (B) e os erros percentuais de deslizamento do pé por passo da lesão traseira lesionada pelo nervo durante a tarefa de caminhada do feixe (C) foi analisado em ratos ingênuos e ratos wt cinco semanas após lesão de esmagamento nervoso. Imagem representativa para a posição de tempo de partida (D) e a posição de tempo final (E) da tarefa de caminhada do feixe. Sequência de imagem representativa de um erro de deslizamento completo (F) e um erro de deslizamento de meio (G) da tarefa de caminhada do feixe. Os dados são mostrados como ± médias A análise estatística foi realizada utilizando-se o teste Mann-Whitney U dos dados distribuídos não normais. O valor P < 0,05 foi definido como estatisticamente significativo rotulado como *p < 0,05, **p < 0,01. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Análise de marcha usando a tarefa de caminhada do degrau da escada. Desenho (A) e desenhos esquemáticos (B) da configuração da tarefa de caminhada do degrau da escada. O tempo de latência de atravessar o aparelho de degrau da escada (C) e os erros percentuais de deslizamento do pé por passo do traseiro ferido pelo nervo durante a tarefa de caminhada da escada (D) foi avaliado em ratos ingênuos e ratos wt cinco semanas após lesão de esmagamento nervoso. (E) A distribuição percentual da categoria de pontuação por etapa de acordo com a escala de 7 categorias de Metz et al. para a escalada traseira esquerda e direita de ratos ingênuos e ratos wt cinco semanas após lesão de esmagamento nervoso. Os dados são mostrados como ± médias DA SEM. A análise estatística foi realizada utilizando-se o teste t não pago dos dados normalmente distribuídos e o teste de Mann-Whitney U dos dados distribuídos não normais. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Representação exemplar de cada categoria de acordo com a escala de 7 categorias de Metz et al. durante a tarefa de caminhada degrau da escada. Sequência de imagem representativa da divisão traseira direita da categoria 0 - erro total, categoria 1 - deslizamento profundo, categoria 2 - leve deslizamento, categoria 3 - substituição, categoria 4 - correção, durante a tarefa de caminhada de degrau de escada. Fotos representativas para categoria 5 - colocação parcial e categoria 6 - colocação correta. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Este protocolo de avaliação comportamental fornece uma visão geral das vantagens e desvantagens, bem como possíveis leituras da bateria de teste comportamental selecionada em um modelo de roedor após lesão de esmagamento do nervo ciático.

Para obter um resultado comparativo da lesão do esmagamento do nervo ciático, uma técnica consistente de esmagamento é obrigatória. O uso de um grampo não serrilado (Hemostat Ultra Fino) em vez de fórceps pode melhorar a consistência do esmagamento. Use o mesmo grampo, bem como a mesma posição de esmagamento para garantir a igual compressão do nervo. O uso exclusivo do grampo para a lesão do esmagamento e manuseio do grampo com cuidado melhora a consistência. Além disso, realize o procedimento da lesão do esmagamento com cuidado. Danos adicionais ao nervo durante a cirurgia, como a tração indesejada do nervo, podem levar a efeitos colaterais indesejados, como a automutilação. Portanto, recomenda-se uma preparação cuidadosa do nervo, bem como uma administração de um analgésico por um mínimo de dois dias.

A avaliação multifatorial do comportamento motor pode caracterizar o fenótipo após lesão de esmagamento nervoso em ratos em vários níveis. Usamos a análise de marcha OFT, CatWalk XT, tarefa de caminhada de feixe e tarefa de caminhada de degraus de escada. Um procedimento experimental cego e a análise de dados para grupos experimentais são essenciais para esses experimentos. Antes da avaliação do comportamento, os animais foram aclimatados na sala de testes em condições de teste por pelo menos 30 minutos. Todos os testes comportamentais aqui aplicados têm a vantagem de que a privação de alimentos ou água não é necessária. O mesmo grupo de animais foi utilizado em todos os testes comportamentais descritos. Foram realizados no máximo dois testes comportamentais diferentes por dia para cada animal. Se os testes comportamentais forem realizados em intervalos regulares, preste atenção a um procedimento comparável, como a realização do teste na mesma ordem animal e na mesma hora do dia. Outro aspecto importante para a análise comportamental é o ciclo diurno dos ratos. Considere um ciclo diurno invertido para obter níveis mais naturais e mais altos de atividade no ciclo diurno (ciclo escuro). Isso deve ser considerado especialmente para a medição do comportamento espontâneo, como o OFT. Neste experimento, não foi possível implementar um ciclo diurno invertido, mas foi assegurada uma aclimatação adequada às condições de teste. Uma iluminação perfeita é essencial para vídeos de alta resolução para a tarefa de caminhada do feixe e a tarefa de caminhada da escada. Essa alta qualidade de vídeo não pode ser alcançada ao realizar experimentos no escuro.

A avaliação da marcha requer um desempenho contínuo da tarefa. O primeiro aspecto importante de um desempenho contínuo da tarefa é convencer os animais a atravessar a configuração. Para aumentar a motivação, coloque pequenas pelotas de alimentos (45 mg) no final da configuração. Para que os animais se familiarizem com as pelotas de alimentos, as pelotas devem ser alimentadas com eles antes dos testes. Além disso, uma caixa de gol no final da configuração pode ser útil. A configuração do CatWalk já inclui uma caixa de gol, mas os ratos às vezes hesitam em entrar na caixa de gol. Alternativamente, você pode adicionar uma pequena gaiola na caixa de gol, mas a gaiola de casa de ratos não cabe na caixa de gol. Deixe o rato habituar na gaiola por alguns minutos antes da aquisição. Além disso, outro rato da mesma gaiola doméstica pode ser colocado na caixa de gol ou na gaiola dentro da caixa de gol. Certifique-se de que o segundo rato permaneça na caixa e não bloqueie a entrada da caixa de gol. Além disso, também é possível remover a caixa de gol do sistema CatWalk e colocar a gaiola de rato no final da passarela, o que permite que o rato entre em seu "território de origem" após cada corrida. Para a configuração da tarefa de caminhada do feixe e da tarefa de caminhada do degrau da escada, recomendamos adicionar uma caixa de gol ou a gaiola doméstica no final da configuração. Para garantir a consistência, o CatWalk, a tarefa de caminhada do feixe e a tarefa de caminhada do degrau da escada devem ser realizados pelo menos uma vez por semana com seis a dez corridas.

Embora nem todas as análises tenham apresentado diferenças significativas neste estudo, considere que a inclusão de animais geneticamente modificados ou grupos de tratamento poderia produzir dados valiosos que possam distinguir entre grupos dos mesmos testes comportamentais.

A lesão por esmagamento nervoso não teve efeito na atividade locomotor do rato, que foi medida em cinco minutos de OFT. A análise da marcha da passarela XT é uma ferramenta mais objetiva e sensível para analisar a colocação da marcha, pata e dedo do dedo do dedo. Após um treinamento intensivo, os ratos aprendem a atravessar a passarela do aparelho CatWalk XT para as configurações padrão. A lesão nervosa não reduz a capacidade dos ratos de atravessar a passarela. A computação automática de vários parâmetros apresenta os dados objetivamente. Informações adicionais podem ser obtidas usando o módulo "Medidas interativas de pegada" e, de fato, essas análises produziram diferenças significativas em vários parâmetros de propagação do dedo do pé, comprimento de impressão e ângulo da pata ao eixo corporal comparando ratos com e sem lesão nervosa.

Ratos podem ser treinados facilmente para a tarefa de andar de feixe. Diferenças no tempo de latência para atravessar o feixe e no número de deslizamentos de pé por passo da perna traseira lesionada pelo nervo foram detectadas comparando-se ingênuas com ratos feridos por esmagamento. Uma desvantagem de analisar ratos feridos pelo nervo com a tarefa de andar de viga é o tamanho da viga. Nas duas primeiras semanas após a lesão do nervo ciático, os ratos precisam de assistência para atravessar a trave, pois seu equilíbrio é prejudicado. Embora alguns ratos possam ser capazes de atravessar a viga, o risco de ferimentos causados por uma queda é alto. Os animais esmagados pelos nervos devem, portanto, ser auxiliados a atravessar o feixe durante as duas primeiras semanas após lesão de esmagamento do nervo ciático ou mais, se necessário. No entanto, é difícil comparar corridas com e sem assistência. Além disso, o equilíbrio motor é um parâmetro importante avaliado pela tarefa de caminhada do feixe. Consideramos este parâmetro não relevante para o nosso modelo de rato de esmagamento nervoso. Portanto, pontuações descritas por Ohwatashi et al. e Johansson & Ohlsson não puderam ser utilizadas e corridas com uma travessia de feixe incompleta foram excluídas para análise de dados^18,19.

A escala de 7 categorias de Metz et al. pode analisar os preços dos antees e traseiros e distinguir entre diferentes níveis de gravidade de erros de todos os membros durante a tarefa de caminhada do degrau da escada^16,17. Analisando os erros mais proeminentes, que incluem as categorias de 0 a 2, não foram detectadas diferenças de erros por etapa na etapa traseira ao comparar ratos wt feridos pelo nervo com ratos ingênuos. Além disso, o tempo de latência de atravessar o aparelho de degrau da escada não difere entre ratos wt feridos pelo nervo e ratos ingênuos. Modelos de aprendizagem profunda podem melhorar e acelerar a análise de dados da tarefa de caminhada de degraus de escada através de uma abordagem automatizada.

É importante mencionar que a lesão por esmagamento nervoso, bem como todos os testes comportamentais descritos podem facilmente traduzir para camundongos, adaptando as configurações e tamanhos das configurações. O uso de camundongos como organismo modelo tem o efeito benéfico de que existem modelos transgênicos para muitas doenças humanas.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid, ≥99.8%	Sigma-Aldrich	33209-1L
Appose ULC skin stapler 35W	Covidien	8886803712
Beam	self made
Bepanthen eye cream	Bayer Vital GmbH	81552983
Box for OFT	self made
Camcorder GC-PX100	JVC
Catwalk XT	Noldus		setup and software
Chamber for isofluran	GT-Labortechnik		custom made
Disposable scalpel No. 11	Feather	20.001.30.011
Dräger Vapor 19.3 isoflurane system	Dr. Wilfried Müller GmbH
Dumont #2 - laminectomy forceps	Fine Science Tools	11223-20
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools	11251-30	super-fine
Dustless precision pellets 45 mg	Bio-Serv	F0021
EthoVision XT	Noldus		setup and software
Forceps 160 mm	Hartenstein	PZ09
Gas anesthesia mask, rat	Dr. Wilfried Müller GmbH
Goal box for ladder rung walking task apparatus	self made
Hair clipper Magnum 5000	Wahl GmbH
Hardened fine scissors	Fine Science Tools	14090-11
Heating table	MEDAX	13801
Isofluran CP 1ml/ml, 250 ml	cp-pharma	1214	prescription needed
Kinovea	www.kinovea.org
Ladder rung walking task apparatus	self made
Needleholder	KLS Martin	20-526-14-07
Octeniderm	Schülke	118211
Rimadyl 50 mg/ml, injectable	Zoetis		Carprofen, prescription needed
Rubber band retractors	self made
Spacer for beam	self made
Spacer for ladder rung walking task apparatus	self made
Suture Silkam 4/0 DS 19	B. Braun	C0762202
Ultra fine hemostats (non-serrated clamp)	Fine Science Tools	13020-12