Многофакторная оценка двигательного поведения крыс после одностороннего повреждения седалищного нерва

Резюме

Мы предоставляем протокол для оценки двигательного поведения с помощью поведенческой тестовой батареи у крыс после повреждения седалищного нерва.

Аннотация

Индукция повреждения периферического нерва является широко используемым методом в неврологии для оценки механизмов восстановления и боли. Кроме того, в области исследований двигательных расстройств седалищная травма была использована для запуска фенотипа, подобного дистонии, в генетически предрасположенных моделях дистонии грызунов DYT-TOR1A. Для достижения последовательных, воспроизводимых и сопоставимых результатов после повреждения седалищного нерва необходим стандартизированный метод индуцирования нервного раздавливания в дополнение к стандартизированной фенотипической характеристике. Необходимо обратить внимание не только на конкретный ассортимент поведенческих тестов, но и на технические требования, правильное выполнение и последовательный анализ данных. Этот протокол подробно описывает, как выполнить повреждение седалищного нерва, и предоставляет поведенческую тестовую батарею для оценки двигательного дефицита у крыс, которая включает в себя тест в открытом поле, анализ походки CatWalk XT, задачу ходьбы по балке и задачу ходьбы по лестнице.

Введение

Грызуны являются отличными модельными организмами для углубления понимания заболеваний человека^1,2 путем проверки гипотез на нескольких биологических уровнях. Одним из фундаментальных биологических уровней для характеристики моделей грызунов является уровень фенотипа, измеряемый поведенческими оценками. В зависимости от модели животного и вопроса научных исследований, выбор мощной и надежной поведенческой тестовой батареи необходим для охвата широкого спектра поведенческих аспектов, таких как для животных моделей болезни Паркинсона и дистонии^3,4,5,6.

Седалищный нерв является самым большим нервом в организме человека с двигательными, а также сенсорными волокнами. Травмы седалищного нерва могут легко возникнуть в результате различных событий, таких как дорожно-транспортные происшествия и операции^7,8. Поэтому исследовательская деятельность с использованием моделей грызунов с повреждениями седалищного нерва, имеет трансляционно значимое значение. Несмотря на то, что поступательный аспект регенерации нервов от крысы к человеку должен рассматриваться критически^9,повреждение седалищного нерва (аксонотмезис) в моделях грызунов является широко используемым методом анализа процессов дегенерации и регенерации периферических нервов^10,11. При давящении нерв не полностью перекивается. Он повреждает аксон, в результате чего блокируется проводимость непосредственно после повреждения при раздавливания с последующими регенеративными процессами ^4,12,13.

Более того, в исследованиях дистонии одностороннее повреждение седалищного нерва является установленным методом запуска дистонически подобных движений (DLM) в генетически предрасположенных моделях грызунов дистонии, которые не показывают DLM как^{таковой4,14.} Предполагается, что травма периферического нерва нарушает сенсомоторную интеграцию, воздействуя на седалищные нервные волокна, которые отвечают за двигательные и сенсорные функции^15.

Здесь мы приводим подробное описание стандартизированного повреждения седалищного нерва и батарею оценок двигательного поведения, которая состоит из теста в открытом поле (OFT), анализа походки CatWalk XT, задачи ходьбы по балке и задачи ходьбы по лестнице у наивных крыс дикого типа (n = 8-9) и крыс wt через пять недель после одностороннего повреждения седалищного нерва (n = 10). OFT предоставляет информацию об общей двигательной активности, в то время как детальный анализ походки достигается автоматизированной системой анализа походки CatWalk XT. Задача ходьбы по балке используется для оценки координации движений путем оценки времени пересечения луча и количества ошибок размещения стопы. Для анализа производительности походки задача ходьбы по лестничной ступени дает информацию о размещении стопы или лапы и ошибках на горизонтальном аппарате ступеньки лестницы с постоянным, но нерегулярным рисунком ступени.

протокол

Все эксперименты на животных были одобрены местными властями в Regierung von Unterfranken (Вюрцбург, Германия) и проводились в соответствии с применимыми международными, национальными и/ или институциональными руководящими принципами по уходу и использованию животных.

1. Травма седалищного нерва

ПРИМЕЧАНИЕ: Поддерживайте стерильную среду в течение всей хирургической процедуры. Установите хирургический стол с необходимым оборудованием.

1. Глубоко обезболивают крысу в закрытом шкафу изофлураном 3,0% в_О2 (2 л/мин). Выньте крысу из шкафа. Побрей обширную область правой задней конечности.
2. Поместите крысу в анестезионную маску и продолжите глубокую анестезию изофлураном 2,0% в O₂ (2 л/мин). Контролируйте глубину анестезии, зажимая межпальбные поперечинки задних лап. Отсутствие рефлексов отмены свидетельствует об адекватной анестезии.
3. Зафиксируйте туловищ и обе задние конечности крысы скотчем. Поместите обе задние повязки в симметричное и вытянутое положение, повернув лапу плоско на стол для операций.
4. Наносите офтальмологическую мазь на глаза для предотвращения сухости глаз. Продезинфицируйте кожу выбритого участка антисептиком.
5. Поиск седалищной выемки подвздошной кости.
6. Сделайте разрез кожи от седалищной выемки в сторону лапы скальпелем. Разрез кожи должен быть как можно меньше (примерно от 1 до 2 см).
7. Если задние сгибания фиксированы и разрез кожи выполнен правильно, можно увидеть полость в фасциальной плоскости между большой ягодичной мышцей и бицепсовой мышцей бедра, напоминающую «белую линию». Вставьте в полость закрытые сверхтонкие гемостатические щипцы (No5) и распределите щипцы. Фасциальная плоскость должна открываться, не повреждая мышечную ткань.
8. Поместите резиновые ретракторы под мышцы, чтобы разрез кожи был открыт.
9. Осторожно удалите все окружающие ткани и кровеносные сосуды из седалищного нерва, пока нерв не будет полностью обнажен. Важно не растягивать и не тянуть нерв в течение всей процедуры.
10. Раздавите седалищный нерв незазубренным зажимом (ультратонкий гемостат) с постоянным и воспроизводимым давлением. Для этого откройте зажим, поместите нерв на нижнюю челюсть зажима и закройте зажим, зафиксировав его в первом положении на три раза по десять секунд. Положение раздавливания седалищного нерва расположено близко к седалищной выемке, проксимально к месту деления основного пучка седалищного нерва. После травмы раздавливания осторожно откройте зажим. Место раздавливания седалищного нерва выглядит полупрозрачным.
11. Снимите втягивающие резинки.
12. Закройте фасциальный плоский разрез рассасывающимся швом 4-0. Закройте разрез кожи скобами кожи тела.
13. Применять Римадил в соответствии с рекомендациями GV-SOLAS (5 мг/кг массы тела, подкожная инъекция) для послеоперационного обезболивания каждые 24 часа после операции в течение двух дней.
14. Удалите крысу из хирургического вмешательства. Поместите крысу в чистую клетку без подстилки на нагревательной пластине (37 °C) до тех пор, пока крыса не проснется. Переместите крысу обратно в их чистую домашнюю клетку.
15. Удалите скобы кожи тела через четыре-шесть дней после операции.

2. Испытания в открытом грунте (OFT)

ПРИМЕЧАНИЕ: Двигательная активность, а также поведенческая активность могут быть проанализированы OFT.

1. настройка
   1. Настройте OFT(рисунок 1A)в темной и тихой обстановке. Он состоит из автоматизированной системы слежения за видео EthoVision XT (компьютер, программное обеспечение с лицензией) и арены размером 58,5 см (длина) х 58,5 см (ширина) х 45 см (высота) с устойчивой к царапинам, очищаемой черной поверхностью. Черная поверхность важна для увеличения контраста при отслеживании белых животных.
2. оценка
   1. Поместите арену и камеру в правильное положение. Отрегулируйте камеру, чтобы вся открытая поле с наилучшим разрешением записывалась. Провести эксперимент в темной среде. Если для установки необходим свет, используйте небольшой и рассеянный свет, чтобы избежать световых пятен, отражений и оттенков на арене. Обеспечьте равные условия освещения, измерив освещенность с помощью люксметра в разных зонах арены.
   2. Настройте программное обеспечение EthoVision XT. Наиболее важные параметры перечислены ниже. В настройках эксперимента выберите Отслеживание в реальном времени для источника видео и определение центральной точки для отслеживаемых объектов. Проверьте размер арены в настройках арены. Установите начальное условие сбора данных через три секунды после того, как крыса была помещена в середину арены, а общее время выполнения — на пять минут в настройках пробного контроля. Выберите Статическое вычитание для метода в разделе Параметры обнаружения. Установите флажок Сохранять видео для метода в настройках получения.
   3. Аккуратно поместите крысу в середину испытательной арены(рисунок 1B).
   4. Нажмите кнопку Начать пробную версию в управлении приобретением, чтобы начать запись.
   5. Во время записи держитесь подальше от установки OFT, чтобы не отвлекать крысу.
   6. После каждого испытания осторожно убирайте крысу с арены тестирования и очищайте установку 0,1% уксусной кислоты, чтобы избежать отвлечения запаха ранее зарегистрированной крысы.
3. анализ данных
   1. Для анализа данных OFT с помощью программного обеспечения EthoVision XT перейдите в раздел Анализ на левой боковой панели и выберите Track Visualization на вкладке Результаты (рисунок 1C). Затем экспортируйте необходимые параметры в Excel. В программном обеспечении выберите ряд переменных из разных категорий для анализа данных. Важными переменными для этой конкретной научной цели являются «Расстояние перемещения» и «Скорость» в категории «Расстояние и время». Выполните статистический анализ выбранных параметров(рисунок 1D).

3. Анализ походки CatWalk XT

ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ походки с помощью системы CatWalk XT может помочь оценить множество различных параметров, касающихся следов, положения и походки животных моделей. Стеклянная дорожка освещается зеленым светом, а свет, рассеянный следами животных, захватывается высокоскоростной видеокамерой, которая расположена под дорожкой. Сигналы могут быть проанализированы с помощью программного обеспечения CatWalk XT.

1. настройка
   1. Для анализа походки с помощью CatWalk XT используйте систему CatWalk и соответствующее программное обеспечение (компьютер, программное обеспечение с лицензией)(рисунок 2A).
   2. Провести эксперимент в темных условиях, ведь сбор данных зависит от освещения дорожки системы CatWalk зеленым светодиодом. Чтобы облегчить экспериментальную процедуру в темных условиях, осветить экспериментальную комнату красным светом.
   3. Используйте определенную дорожку длиной 65 см и шириной 7 см; однако размер дорожки зависит от размера крыс. Установите дорожку как можно больше, чтобы записать как можно больше следов для каждой лапы.
   4. Захватите минимальное количество из трех следов на лапу для каждого пробега. При определении длины дорожки учитывайте тело и хвост крысы, так как сигнал старта или остановки может быть обнаружен неправильно, и пробег может быть классифицирован как соответствующий, если тело / хвост входит или остается на определенной дорожке до или после завершения пробега.
2. тренировка
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обучение крыс системе CatWalk необходимо для того, чтобы приучить животных к установке и позволить им научиться пересекать дорожку без каких-либо перерывов. Правильная тренировка обеспечивает преимущества экономии времени во время экспериментальной оценки и получения лучших результатов. Запуск сбора данных системы CatWalk во время тренировок позволяет крысам привыкнуть к условиям оценки (шум/свет).
   1. Начните настраивать систему CatWalk.
      1. Очистите стеклянную дорожку дистиллированной водой и мягкой тканью без ворса. В начале и в конце эксперимента или между ними, если стеклянная дорожка грязная, используйте жидкость для очистки стекла и мягкую ткань без ворса для очистки стеклянной дорожки. После использования жидкости для очистки стекла очистите дорожку от любых остатков жидкости, чтобы она не отвлекала животное.
      2. Выберите экспериментальные настройки. Важным параметром является критерий выполнения. Задайте соответствующие значения для параметров Минимальная продолжительность выполнения, Максимальная продолжительность выполненияи Минимальное количество совместимых запусков,которые необходимо получить, которые специфичны для каждого исследовательского проекта. Установите флажок Использовать максимально допустимое изменение скорости и установите значение. Критерии Run можно игнорировать в течение первых четырех-пяти дней обучения.
      3. Поместите камеру в положение и отрегулируйте фокус. Найдите оптимальное положение камеры для достижения подходящей длины дорожки и наилучшего разрешения записанных лап одновременно. Обозначьте положение камеры в системе CatWalk, чтобы обеспечить одинаковое размещение камеры между записями.
      4. Настройте параметры обнаружения с помощью автоматического обнаружения для нового эксперимента. Убедитесь, что все следы могут быть обнаружены с минимальным фоновым шумом. При необходимости оптимизируйте настройки обнаружения вручную и измените порог интенсивности зеленого цвета. Используйте одни и те же параметры обнаружения для всего эксперимента.
      5. Установите стены коридора системы CatWalk. Стены коридора должны быть как можно ближе к крысе. Убедитесь, что стены коридора остаются параллельными дорожке.
      6. Определите длину дорожки: щелкните значок Определить дорожку. Отрегулируйте размер белого прямоугольника по длине и ширине, в соответствии с конкретным исследовательским проектом. Нажмите кнопку ОК.
      7. Калибровка дорожки: щелкните значок Калибровать дорожку. Поместите прямоугольный калибровочный лист размером 20 x 10 см в середину прохода. Адаптируйте размер белого прямоугольника к калибровочному листу. Нажмите кнопку ОК.
      8. Затем сделайте фоновое изображение: заранее проверьте, что дорожка чистая и пустая. Нажмите кнопку «Привязать фон», чтобы создать фоновое изображение.
   2. Тренируйте животных в течение как минимум восьми дней до начала эксперимента. Рекомендуется обучение в последующие дни.
      1. День 1 обучения: Чтобы крысы привыкли к системе Подиума, позвольте животному свободно исследовать дорожку и стойку ворот. Пусть крысы потренируйтесь пересекать дорожку и войти в поле ворот. Подберите крысу в конце дорожки или в стойке ворот и верните крысу в начальную точку дорожки. В первый день обучения рекомендуется пять пробежек без необходимости соблюдения экспериментальных условий.
      2. День 2 тренировки: Крысы могут свободно исследовать дорожку и стойку ворот. Рекомендуется пять запусков без соблюдения экспериментальных настроек.
      3. День 3 обучения: Рекомендуется восемь пробежек без соблюдения экспериментальных условий.
      4. День 4 обучения: Рекомендуется десять пробежек без соблюдения экспериментальных условий.
      5. День 5 тренировки: Рекомендуется десять пробежек. Следует иметь в виду экспериментальные условия. Мотивируйте крыс пересекать дорожку без каких-либо перерывов.
      6. День 6 тренировки: Рекомендуется десять пробежек. Следует иметь в виду экспериментальные условия. Мотивируйте крыс пересекать дорожку без каких-либо перерывов.
      7. День 7 тренировки: Рекомендуется десять пробежек. Должно быть достигнуто не менее трех совместимых прогонов. Добавьте больше пробежек для животных, если они не смогли достичь этой цели.
      8. День 8 тренировки: Рекомендуется десять пробежек. Должно быть достигнуто не менее трех совместимых прогонов. Добавьте больше пробежек для животных, если они не смогли достичь этой цели.
3. оценка
   1. В соответствии с определенными критериями запуска выполните три совместимых пробега на крысу для анализа данных. Для оценки выполните шаги 3.2.1. - 3.2.1.8. как описано в разделе обучения. Даже если крыса достигает трех соответствующих пробежек в течение первых трех пробежек, выполняйте как минимум шесть пробежек за сеанс / в неделю в целях обучения.
   2. Выполните по крайней мере одну (тренировную) сессию с шестью пробежками в неделю для стабильного рисунка походки для экспериментов с несколькими временными точками. Экспериментальные и детектические настройки остаются неизменными на протяжении всего эксперимента.
4. анализ данных
   1. Для анализа данных оценивайте только совместимые прогоны. Удалите несоответствующие прогоны.
   2. Проверьте порог интенсивности зеленого и увеличьте или уменьшите порог интенсивности зеленого перед классификацией отпечатков лап, если это необходимо. Порог интенсивности зеленого цвета должен быть постоянным для всех животных и всех пробежек.
   3. Автоматическая классификация отпечатков лап с помощью программного обеспечения CatWalk XT(рисунок 2B).
   4. Просматривайте этикетки с отпечатками лап вручную. Исправьте неправильные этикетки для отпечатков лап, добавьте этикетки с необнаженными отпечатками лап и удалите шум и неправильные этикетки вручную. Переместите видео в положение, которое необходимо просмотреть вручную. Чтобы исправить неправильные помеченные отпечатки лап, выберите прямоугольник конкретного отпечатка лапы, нажмите «Сброс»,снова выберите тот же прямоугольник и назначьте правильную метку из списка. Для маркировки необнаруженные отпечатки лап нарисуйте прямоугольник вокруг необнаруженным лапой, нажмите кнопку Добавить печать,выберите новый созданный прямоугольник и назначьте правильную метку из списка. Если программное обеспечение с маркировкой носа или корпуса печатает автоматически, выберите прямоугольник конкретной наклейки и нажмите кнопку «Удалить печать».
   5. Просмотрите числовые результаты. Числовые результаты отображаются на листе Excel, показывающем ряд основных параметров. Выберите заранее определенные конкретные параметры в зависимости от интереса исследования и выполните статистический анализ как обычно(рисунок 2D).
   6. Для получения более подробной информации о каждом следе классифицируйте носики задних лап. Для этого анализа требуется модуль интерактивных измерений занимаемой площади.
      1. При необходимости адаптируйте порог интенсивности зеленого цвета для анализа интерактивных измерений занимаемой площади. Порог интенсивности зеленого цвета должен быть постоянным для всех животных и всех пробежек.
      2. Установите маркеры для анализа занимаемой площади вручную. Проанализируйте каждый отпечаток задней лапы во всех трех совместимых прогонах. Протяните линию от центра первого нося к центру пятого нося, чтобы измерить «Разброс носящего». Протяните линию от центра второго нося к центру четвертого нося, чтобы измерить «Промежуточный спред». Протяни линию от центра третьего носка до пятки задней лапы, чтобы измерить «Длину ручной печати»(рисунок 2C).
      3. Просмотрите числовые результаты «Интерактивных измерений занимаемой площади», отображаемые на отдельном листе. Выберите конкретные параметры «Интерактивных измерений занимаемой площади» и выполните статистический анализ как обычно(рисунок 2E).

4. Задача ходьбы по балке

ПРИМЕЧАНИЕ: Дефицит походки может быть определен по задаче ходьбы по лучу. В центре внимания задачи ходьбы лучом в этой конкретной теме исследования будет анализ двигательной координации, определяемой как способность координировать активацию мышц из нескольких частей тела, а не оценка двигательного баланса, определяемого как способность к постуральному контролю во время движений тела.

1. настройка
   1. Для выполнения задачи ходьбы по лучу используйте луч, распорку, стол, равномерный фон и видеокамеру(рисунок 3А).
   2. Используйте деревянную балку длиной 90 см, шириной 1,7 см и высотой 2 см. Рекомендуется платформа длиной 20,5 см, шириной 15 см и высотой 2 см на обоих концах балки. Используйте один и тот же материал для платформ и балки, избегайте каких-либо барьеров между платформами и балкой.
   3. Расстояние между балкой и столом должно быть не менее 44 см. Знакомая среда, такая как домашняя клетка, мотивирует крыс пересекать балку, которая может быть размещена в конце балочной платформы.
2. тренировка
   1. Установите балку с прокладкой и домашнюю клетку на столе.
   2. Дрессируйте животных в течение семи дней. Рекомендуется обучение в последующие дни.
      1. День 1 тренинга
         1. Поместите всех крыс из одной домашней клетки на стартовую платформу балки.
         2. Пусть крысы исследуют окружающую среду (платформа/балка).
         3. Осторожно держите одну крысу за хвост и ведите крысу к балке, осторожно толкая крысу на балку.
         4. Помогите крысе пересечь балку, держа крысу за хвост в течение как минимум двух пробежек.
         5. Пусть крыса пересечет балку еще три раза без пощещины. Понаблюдайте за крысой и при необходимости оканите помощь. Если крыса не может пересечь балку, перехватите падение, чтобы избежать травм и развития страха пересечь балку.
         6. Продолжайте эту процедуру для всех крыс.
            ПРИМЕЧАНИЕ: Иногда крысы следуют друг за другом, чтобы пересечь балку, и в этом случае помощь не требуется. Однако важно наблюдать за крысами, перехватывать падения и оказывать помощь в случае необходимости.
      2. День 2 обучения
         1. Поместите всех крыс из одной домашней клетки на стартовую платформу балки.
         2. Пусть крысы пересекают балку шесть раз.
         3. При необходимости окажьте помощь и перехватывайте падения.
      3. День 3 обучения
         1. Поместите одну крысу на стартовую платформу балки.
         2. Пусть крыса пересечёт луч шесть раз.
         3. При необходимости окажьте помощь и перехватывайте падения.
      4. День 4-7 обучения
         1. Поместите одну крысу на стартовую платформу балки.
         2. Пусть крыса пересечёт луч десять раз.
         3. При необходимости окажьте помощь и перехватывайте падения.
         4. В конце тренировки крыса должна пройти балку без перерыва как минимум на три пробега. Допустимо осторожно толкать крысу на стартовую платформу, чтобы спровоцировать инициацию движения.
3. оценка
   1. Установите балку с прокладкой и домашнюю клетку на столе.
   2. Поместите видеокамеру в положение, выровненное параллельно лучу с животным в фокусе. Положение видеокамеры должно быть максимально приближено к животному для достижения оптимального разрешения записывалось движений. Луч и части обеих платформ должны быть захвачены записью.
   3. Начните запись и сначала определите сеанс и животное.
   4. Поместите крысу на стартовую платформу балки.
   5. Крыса должна пересечь балку три раза без каких-либо перерывов. Даже если крыса достигает трех совместимых пробежек в течение первых трех запусков, выполняйте минимум шесть-десять запусков для непрерывного выполнения задач.
   6. Всегда наблюдайте за животным и перехватывайте падения, если это необходимо.
   7. После выполнения задания очистите балку и стол 0,1% уксусной кислоты, чтобы не отвлекаться на запах ранее зарегистрированной крысы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В течение первых двух недель после повреждения нерва крысы не могут пройти луч без постороньности. Поэтому помощь должна быть оказана для шести-восьми пробежек в первые две недели после травмы нерва. С третьей по пятую неделю пять пробежек выполняются с помощью и еще десять пробежек были выполнены без помощи.
4. анализ данных
   1. Используйте бесплатное программное обеспечение для анализа видео Kinovea для анализа данных.
   2. Выберите видеоряды из трех совместимых прогонов из записи. Для этого выберите первые три соответствующих прогоны, которые были выполнены без посочета со стороны животного. Будьте последовательны в выборе соответствующего пробега для всех крыс.
   3. Определите начальную и конечную точки времени выбранных трех совместимых запусков(рисунок 3D-E). В этой установке начальная точка была обозначена черной линией на луче, а размещение первого заднего конечного конечного заграждения за черной линией определяло начальную точку времени пробега. Размещение первого заднего накладки на платформе в конце балки определяет конечную точку времени.
   4. Затем рассчитайте время, необходимое крысе, чтобы пересечь балку. Сообщайте данные в виде времени задержки, чтобы пересечь луч в секундах и выполнить статистический анализ как обычно(рисунок 3B).
   5. Оцените количество шагов и ошибок из трех совместимых прогонов для обеих задних конечностей отдельно с помощью функции масштабирования и замедленной съемки программного обеспечения. Ошибки включают в себя полные скольжения ног и скольжения на полфуты. Полное скольжение стопы определяется как размещение ноги, за которым следует глубокое скольжение, вызывающее потерю контакта пораженной лапы с балкой(рисунок 3F). Полускользяние определяется как скольжение лапы с боковины балки без потери полного контакта с балкой(рисунок 3G).
   6. Рассчитайте процент скольжения стопы по отношению к количеству шагов для пересечения балки ((количество скольжений стопы конечности х 100%)/ количество шагов одной и той же конечности). Представьте данные в процентах скольжения ног и выполните статистический анализ как обычно(рисунок 3C).

5. Лестничная ступенька ходьбы

ПРИМЕЧАНИЕ: Задача ходьбы по лестнице может оценить двигательную функцию, размещение как передних, так и задних конечности, а также координацию междугибов.

1. настройка
   1. Используйте лестничный аппарат, распорку, стол, однородный фон и видеокамеру для этого поведенческого теста(рисунок 4А). Горизонтальный лестничный ступень состоит из металлических ступеней и прозрачных поликарбонатных боковых стебок. Аппарат имеет длину 119,5 см и ширину дорегулирован до 7,4 см. Проходимая дорожка имеет длину 100 см.
   2. Обозначьте начальную и конечную точку черной линией на боковине. Размещает заполнители ступеней на аппарате с интервалом 1 см. Расположите неправильный рисунок ступеней для дорожки 100 см с расстоянием от 1 до 5 см между ступенями. Первые 10 см в начале и последние 9,5 см в конце аппарата, которые исключены из анализа, имеют правильный рисунок ступеней с расстоянием 1 см.
   3. Используйте расстояние между дорожкой и столом приблизительно 30 см(рисунок 4A-B). Коробка для ворот или знакомая среда в конце аппарата, например, домашняя клетка, мотивирует крыс пересекать лестницу.
2. тренировка
   1. Установите на столе лестницу ступеньку аппарата с проставкой и коробкой для ворот.
   2. Дрессируйте животных в течение восьми дней. Рекомендуется обучение в последующие дни.
      1. День 1 тренинга
         1. Поместите всех крыс из одной домашней клетки на ступеньку лестницы.
         2. Пусть крысы исследуют окружающую среду (лестничный аппарат/ворота).
         3. Осторожно толкайте крыс в сторону ворот. Помогите крысам войти в штрафную. Пусть крысы некоторое время исследуют коробку ворот.
         4. Ведь крысы вошли в штрафную ворот. Возьмите первую крысу из коробки ворот и снова поместите крысу в стартовую зону аппарата. Продолжайте одну и ту же процедуру для всех крыс одной домашней клетки. Осторожно толкайте крыс в направлении коробки ворот и при необходимости дайте помощь войти в коробку ворот.
         5. Пусть крыса пройдет через аппарат четыре раза.
      2. День 2 обучения
         1. Выполните тот же протокол, что и в первый день обучения.
         2. Пусть крыса пройдет через аппарат шесть раз.
      3. День 3 обучения
         1. Выполните тот же протокол, что и в первый день обучения.
         2. Пусть крыса пройдет через аппарат восемь раз.
      4. 4 день обучения
         1. Поместите одну крысу на начало лестницы ступеньки аппарата.
         2. Если крыса не пересекает аппарат и входит в ящик для целей добровольно, окажите помощь, осторожно толкнув крысу сзади.
         3. Пусть крыса пройдет через аппарат восемь раз.
      5. День 5-8 обучения
         1. Поместите одну крысу на начало лестницы ступеньки аппарата.
         2. Если крыса не пересекает аппарат и входит в ящик для целей добровольно, окажите помощь, осторожно толкнув крысу сзади.
         3. Пусть крыса пройдет через аппарат десять раз.
         4. В конце обучения крыса должна быть в состоянии пересечь дорожку без каких-либо перерывов и помощи в течение как минимум трех пробежек. Допустимо дать крысе легкий толчок в стартовой зоне, чтобы спровоцировать инициацию движения.
3. оценка
   1. Установите на столе лестницу ступеньку аппарата с проставкой и коробкой для ворот.
   2. Поместите видеокамеру в положение, выровненное параллельно аппарату с животным в фокусе. Расположите видеокамеру как можно ближе к животному, чтобы достичь оптимального разрешения записанных движений и обеспечить захват всего устройства лестничной ступени в записи.
   3. Начните запись и сначала определите сеанс и животное.
   4. Поместите крысу в стартовую зону лестничного ступеньного аппарата.
   5. Крыса должна пересечь 100-сантиметровую дорожку лестницы три раза без каких-либо перерывов, чтобы она квалифицировалась как соответствующий бег. Даже если крыса достигает трех совместимых пробежек в течение первых трех запусков, для непрерывного выполнения задач должно быть выполнено не менее десяти запусков.
   6. После выполнения задания очистите аппарат и стол 0,1% уксусной кислоты, чтобы не отвлекаться на запах ранее зарегистрированной крысы.
4. анализ данных
   1. Используйте бесплатное программное обеспечение для анализа видео Kinovea для анализа данных.
   2. Выберите видеоряды из трех совместимых прогонов из записи. Выберите первые три совместимых запуска для анализа данных.
   3. Определите начальную и конечную точки выбранных трех совместимых запусков. Размещение первого заднего сгиба за первой черной линией на боковой стенке аппарата, которая обмещает точку начала времени прохождения 100 см, определяет точку начала пробега. Размещение первого переднего лима за второй черной линией на боковине аппарата, которая маркирует конечную точку 100-сантиметрового прохода, определяет конечную точку времени пробега.
   4. Определите начальную и конечную точки времени. Далее рассчитайте продолжительность пробега по дорожке. Сообщайте данные в виде времени задержки, чтобы пересечь дорожку за считанные секунды и выполнить статистический анализ, как обычно(рисунок 4C).
   5. Оцените три совместимых прогоня по 7-категорийной шкале от Metz et al. с помощью замедленного движения или покадровой функции программного обеспечения(рисунок 5)^16,17. Определите количество шагов и количество ошибок в соответствии с категориями шкалы для каждой конечности отдельно. Шкала различает следующие категории: (0) общий промах (1) глубокое скольжение (2) небольшое скольжение (3), замена (4) исправление (5) частичное размещение и (6) правильное размещение. Оценивалась только погрешность инициирующей конечности. Дальнейшие ошибки, вызванные первоначальной ошибкой, не должны оцениваться.
   6. Рассчитайте ошибки/шаг, учитывая следующие требования. Категории (0) общий промах (1) глубокое скольжение (2) незначительное скольжение засчитываются как ошибка. Разделите количество ошибок на количество шагов для каждого заднего слайма и каждого запуска отдельно. Определите среднее значение всех трех совместимых прогонов для каждого животного и каждого заднего конечного сгиба в отдельности и выполните статистический анализ, как обычно(рисунок 4D).

Результаты

Репрезентативные результаты пятиминутного OFT показывают, что повреждение нерва через пять недель после операции не оказывает влияния на двигательную активность(рисунок 1).

Анализ походки с помощью системы CatWalk XT(рисунок 2)генерирует множество различных параметров. Селективные параметры были статистически проанализированы путем сравнения наивных крыс с поврежденными нервами крысами через пять недель после нервного раздавливания(рисунок 2D). Значительные изменения могут быть обнаружены для средней скорости бега, длины шага и области печати травмированной нервом (правой) задней лапы. Более детальный анализ травмированной нервом задней лапы был выполнен с помощью модуля «Интерактивные измерения следа». Значительное снижение параметров распространения на носке, промежуточного распространения носа и длины отпечатка наблюдалось у крыс с поврежденным нервом по сравнению с наивными крысами. Кроме того, ось тела угла лапы и вектор движения угла лапы существенно отличаются при сравнении поврежденных нервами крыс с наивными крысами(рисунок 2E).

На рисунке 3 представлены данные о координации движений, полученные при оценке задачи ходьбы по лучу. Крысы с повреждением нервов показали значительно увеличенное время задержки для пересечения луча по сравнению с наивными крысами через пять недель после травмы(рисунок 3B). В качестве дополнительного считывания задачи ходьбы по лучу полные скольжения и полускользящие повреждения нерва задним повязом были подсчитаны и рассмотрены как ошибка для статистического анализа. Процент ошибок на шаг поврежденного нервом (правого) заднего салима был значительно увеличен у крыс с поврежденным нервом по сравнению с наивными крысами.

Репрезентативные данные задачи ходьбы по лестничной ступени(рисунок 4)не показывают существенных изменений во времени задержки при пересечении дорожки лестничного ступеньного аппарата(рисунок 4С)или в проценте ошибок на ступень поврежденного нервом (правого) заднего налима(рисунок 4D). При анализе процента ошибок на шаг травмированного нерва заднего сгиба учитывалась только оценка от 0 до 2 по 7-категорийной шкале от Metz et al. Распределение всех оценок на шаг по шкале 7 категорий травмированной нерва задней конечности и нерезинерального (левого) заднего сгибания проиллюстрировано на рисунке 4E.

Рисунок 1:Оценка двигательной активности при испытании в открытом грунте. (A) Изображение установки для испытаний в открытом поле. Выбранное изображение, вычитаемое из записанного видео во время испытания в открытом поле, показывающее крысу на арене открытого поля без (B) и с отслеживанием (C). (D) Скорость в течение пяти минут в открытом поле была исследована на наивных крысах и крысах через пять недель после повреждения нерва. Данные показаны как среднее ± SEM. Статистический анализ проводился с использованием непарного t-теста нормально распределенных данных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2:Анализ походки с помощью системы CatWalk XT. (A) Изображение аппарата CatWalk XT. (B) Примеры печатного вида, показывающего помеченные отпечатки лап в ложном цветовом режиме, и примеры временного представления, показывающего диаграмму походки на основе времени наивных крыс и крыс wt через пять недель после повреждения нерва. (C) Примеры классификации ноготья, показывающие разброс носка (TS), промежуточный разброс на ноготь (ITS) и длину отпечатка (PL), а также примеры вида оси тела, показывающие ось тела (белая линия) и вектор движения (красная линия) наивных крыс и крыс wt через пять недель после повреждения нерва. (D) Данные о выбранных параметрах из «стандартной» классификации, сравнивающих наивных крыс и крыс через пять недель после повреждения нервного раздавливания. (E) Данные о выбранных параметрах из "Интерактивного модуля измерения следов", сравнивающих наивных крыс и крыс через пять недель после повреждения нерва. Статистический анализ проводил ±ся с использованием непарного t-теста нормально распределенных данных, непарного t-теста с коррекцией Уэлча нормально распределенных данных и теста Манна-Уитни U ненормальных распределенных данных. P-значение < 0,05 определялось как статистически значимое, обозначенное как *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3:Анализ походки с задачей ходьбы луча. (A) Рисунок и схематические чертежи установки задачи шага по балке. Латентное время пересечения луча (B) и процент ошибок скольжения ноги на шаг поврежденного нервом заднего конечного скольжения во время выполнения задачи ходьбы лучом (C) были проанализированы у наивных крыс и крыс wt через пять недель после повреждения нервного раздавливания. Репрезентативная картинка для положения времени начала (D) и положения конечного времени (E) задачи ходьбы луча. Репрезентативная последовательность изображений ошибки полного скольжения (F) и ошибки полукольжения (G) задачи ходьбы по лучу. Данные показаны как среднее ± SEM. Статистический анализ проводился с использованием теста Манна-Уитни U ненормально распределенных данных. P-значение < 0,05 было определено как статистически значимое, обозначенное как *p < 0,05, **p < 0,01. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4:Анализ походки с использованием лестничной ступени. Рисунок (А) и схематические чертежи (В) установки задачи ходьбы по ступенькам лестницы. Время задержки при прохождении аппарата ступеньки лестницы (C) и процент ошибок скольжения ноги на ступень поврежденного нервом заднего скольжения во время выполнения задачи ходьбы по ступеньке лестницы (D) оценивались у наивных крыс и крыс через пять недель после повреждения нервного раздавливания. (E) Процентное распределение категории баллов по ступеням в соответствии с 7-категорийной шкалой от Metz et al. для левой и правой задней конечности наивных крыс и крыс через пять недель после повреждения нерва. Статистический анализ проводил ±ся с использованием непарного t-теста нормально распределенных данных и теста Манна-Уитни U ненормированных распределенных данных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5:Примерное представление каждой категории по шкале 7 категорий от Metz et al. во время лестничной ступени ходьбы задание. Репрезентативная последовательность изображений с правой задней конечности категории 0 - полный промах, категории 1 - глубокое скольжение, категория 2 - незначительное скольжение, категория 3 - замена, категория 4 - коррекция, во время лестничной ступени ходьбы. Репрезентативные фотографии для категории 5 - частичное размещение и категории 6 - правильное размещение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Обсуждение

Этот протокол поведенческой оценки предоставляет обзор преимуществ и недостатков, а также возможные показания выбранной батареи поведенческого теста в модели грызуна после повреждения седалищного нерва.

Для получения сравнительного исхода повреждения седалищного нерва обязательна последовательная техника раздавливания. Использование незазубрённый зажим (Ultra Fine Hemostat) вместо щипцов может улучшить консистенцию дробления. Используйте тот же зажим, а также то же положение раздавливания, чтобы гарантировать равное сжатие нерва. Исключительное использование зажима для травмы раздавливания и бережное обращение с зажимом улучшает консистенцию. Также выполняйте процедуру давяной травмы с осторожностью. Дополнительное повреждение нерва во время операции, такое как нежелательное вытяжение нерва, может привести к нежелательным побочным эффектам, таким как аутокоутилечение. Поэтому рекомендуется тщательная нервная подготовка, а также введение обезболивающего в течение как минимум двух дней.

Многофакторная оценка двигательного поведения может охарактеризовать фенотип после повреждения нервного раздавливания у крыс на различных уровнях. Мы использовали OFT, анализ походки CatWalk XT, задачу ходьбы по балке и задачу ходьбы по ступеньке лестницы. Слепая экспериментальная процедура и анализ данных экспериментальных групп необходимы для этих экспериментов. Перед оценкой поведения животных акклиматизировали в испытательной комнате в условиях тестирования в течение не менее 30 минут. Все поведенческие тесты, применяемые здесь, имеют то преимущество, что лишение пищи или воды не требуется. Один и тот же групповой набор животных использовался во всех описанных поведенческих тестах. Максимум два различных поведенческих теста в день проводились для каждого животного. Если поведенческие тесты проводятся через равные промежутки времени, обратите внимание на сопоставимую процедуру, например, выполнение теста в том же порядке животных и в одно и то же время суток. Еще одним важным аспектом поведенческого анализа является цикл день-ночь крыс. Рассмотрим обратный цикл день-ночь, чтобы получить более естественный и более высокий уровень активности в дневном цикле (темный цикл). Это должно быть рассмотрено особенно для измерения спонтанного поведения, такого как OFT. В этом эксперименте обратный цикл день-ночь не мог быть реализован, но была обеспечена адекватная акклиматизация к условиям тестирования. Идеальное освещение имеет важное значение для видео с высоким разрешением для задачи ходьбы по лучу и ходьбы по лестнице. Это высокое качество видео не может быть достигнуто при проведении экспериментов в темноте.

Оценка походки требует непрерывного выполнения задачи. Первым важным аспектом непрерывного выполнения задачи является убеждение животных пересечь установку. Чтобы повысить мотивацию, поместите небольшие пищевые гранулы (45 мг) в конце установки. Для того, чтобы животные ознакомились с пищевыми гранулами, гранулы должны быть скормлены им до тестирования. Кроме того, поле для ворот в конце настройки может быть полезным. Установка Подиума уже включает в себя коробку для ворот, но крысы иногда не решаются войти в коробку ворот. Как вариант, можно добавить в коробку ворот небольшую клетку, но домашняя клетка из крыс не помещается в коробку ворот. Дайте крысе привыкнуть в клетке за несколько минут до приобретения. Кроме того, другая крыса из той же домашней клетки может быть помещена в коробку для ворот или в клетку внутри коробки ворот. Следите за тем, чтобы вторая крыса оставалось в коробке и не блокировала вход в стойку ворот. Кроме того, также можно удалить стойку ворот из системы CatWalk и разместить домашнюю клетку крысы в конце дорожки, что позволяет крысе входить на свою «домашнюю территорию» после каждого пробега. Для настройки задачи ходьбы по балке и задачи ходьбы по ступеньке лестницы мы рекомендуем добавить коробку для ворот или домашнюю клетку в конце установки. Чтобы обеспечить согласованность, подиум, задача ходьбы по балке и задача ходьбы по лестничной ступени должны выполняться не реже одного раза в неделю с шестью-десятью пробежками.

Хотя не каждый анализ дал существенные различия в этом исследовании, учтите, что включение генетически модифицированных животных или групп лечения может дать ценные данные, которые могут различать группы из одних и тех же поведенческих тестов.

Повреждение нерва не повлияло на двигательную активность крысы, которая измерялась за пять минут OFT. Анализ походки Catwalk XT является более объективным и чувствительным инструментом для анализа расположения походки, лап и пальца. После интенсивной тренировки крысы учатся переходить дорожку аппарата CatWalk XT к настройкам по умолчанию. Повреждение нерва не снижает способность крыс пересекать дорожку. Автоматическое вычисление различных параметров представляет данные объективно. Дополнительную информацию можно получить с помощью модуля «Интерактивные измерения следа», и действительно, эти анализы дали значительные различия в различных параметрах распространения на носках, длины отпечатка и угла лапы к оси тела, сравнивая крыс с повреждением нервов и без него.

Крыс можно легко обучить для выполнения задачи ходьбы по балке. Различия во времени задержки при пересечении луча и в количестве скольжений ног на шаг поврежденной нервом задней конечности были обнаружены путем сравнения наивных с поврежденными раздавливанием крыс. Недостатком анализа травмированных нервов крыс с задачей ходьбы лучом является размер пучка. В течение первых двух недель после повреждения седалищного нерва крысы нуждаются в помощи, чтобы пересечь луч, поскольку их баланс нарушен. Хотя некоторые крысы могут быть способны пересекать балку, риск травм, вызванных падением, высок. Поэтому животным, раздавленным нервами, следует помогать пересекать луч в течение первых двух недель после повреждения седалищного нерва или дольше, если это необходимо. Тем не менее, трудно сравнивать пробеги с помощью и без нее. Кроме того, двигательный баланс является важным параметром, оцениваемым задачей ходьбы по балке. Мы посчитали, что этот параметр не имеет отношения к нашей модели крысы, раздавливаемой нервами. Поэтому оценки, описанные Ohwatashi et al. и Johansson & Ohlsson, не могли быть использованы, а трассы с неполным траверсом балки были исключены для анализа данных^18,19.

Шкала 7 категорий от Metz et al. может анализировать как перецевые, так и задние конечности и различать различные уровни тяжести ошибок всех конечностей во время лестничной ступени ходьбы задачи^16,17. Анализируя наиболее заметные ошибки, которые включают категории от 0 до 2, не удалось обнаружить различий ошибок на шаг при сравнении крыс с поврежденным нервом с наивными крысами. Кроме того, латентное время прохождения лестничного аппарата не различало между крысами с поврежденным нервом и наивными крысами. Модели глубокого обучения могут улучшить и ускорить анализ данных о задаче ходьбы по лестнице с помощью автоматизированного подхода.

Важно отметить, что повреждение нерва, а также все описанные поведенческие тесты могут быть легко переведены на мышей, адаптируя настройки и размеры установок. Использование мышей в качестве модельного организма оказывает благотворное влияние на то, что существуют трансгенные модели для многих заболеваний человека.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid, ≥99.8%	Sigma-Aldrich	33209-1L
Appose ULC skin stapler 35W	Covidien	8886803712
Beam	self made
Bepanthen eye cream	Bayer Vital GmbH	81552983
Box for OFT	self made
Camcorder GC-PX100	JVC
Catwalk XT	Noldus		setup and software
Chamber for isofluran	GT-Labortechnik		custom made
Disposable scalpel No. 11	Feather	20.001.30.011
Dräger Vapor 19.3 isoflurane system	Dr. Wilfried Müller GmbH
Dumont #2 - laminectomy forceps	Fine Science Tools	11223-20
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools	11251-30	super-fine
Dustless precision pellets 45 mg	Bio-Serv	F0021
EthoVision XT	Noldus		setup and software
Forceps 160 mm	Hartenstein	PZ09
Gas anesthesia mask, rat	Dr. Wilfried Müller GmbH
Goal box for ladder rung walking task apparatus	self made
Hair clipper Magnum 5000	Wahl GmbH
Hardened fine scissors	Fine Science Tools	14090-11
Heating table	MEDAX	13801
Isofluran CP 1ml/ml, 250 ml	cp-pharma	1214	prescription needed
Kinovea	www.kinovea.org
Ladder rung walking task apparatus	self made
Needleholder	KLS Martin	20-526-14-07
Octeniderm	Schülke	118211
Rimadyl 50 mg/ml, injectable	Zoetis		Carprofen, prescription needed
Rubber band retractors	self made
Spacer for beam	self made
Spacer for ladder rung walking task apparatus	self made
Suture Silkam 4/0 DS 19	B. Braun	C0762202
Ultra fine hemostats (non-serrated clamp)	Fine Science Tools	13020-12