Valutazione multifattoriale del comportamento motorio nei ratti dopo la lesione unilaterale da schiacciamento del nervo sciatico

Riepilogo

Forniamo un protocollo per la valutazione del comportamento motorio tramite una batteria di test comportamentale nei ratti dopo una lesione da schiacciamento del nervo sciatico.

Abstract

L'induzione di una lesione nervosa periferica è un metodo ampiamente utilizzato nelle neuroscienze per la valutazione dei meccanismi di riparazione e dolore tra gli altri. Inoltre, nel campo della ricerca sui disturbi del movimento, è stata impiegata una lesione da schiacciamento sciatico per innescare un fenotipo simile alla distonia nei modelli di roditori DYT-TOR1A geneticamente predisposti di distonia. Per ottenere risultati coerenti, riproducibili e comparabili dopo una lesione da schiacciamento del nervo sciatico, è essenziale un metodo standardizzato per indurre la schiacciamento nervoso, oltre a una caratterizzazione fenotipica standardizzata. Occorre prestare attenzione non solo allo specifico assortimento di test comportamentali, ma anche ai requisiti tecnici, alla corretta esecuzione e all'analisi consecutiva dei dati. Questo protocollo descrive in dettaglio come eseguire una lesione da schiacciamento del nervo sciatico e fornisce una batteria di prova comportamentale per la valutazione dei deficit motori nei ratti che include il test sul campo aperto, l'analisi dell'andatura CatWalk XT, il compito di camminata del fascio e il compito di camminare a gradini della scala.

Introduzione

I roditori sono eccellenti organismi modello per approfondire la comprensione delle malattie umane^1,2 testando ipotesi su più livelli biologici. Un livello biologico fondamentale per la caratterizzazione dei modelli di roditori è il livello di fenotipo, misurato da valutazioni comportamentali. A seconda del modello animale e della domanda di ricerca scientifica, la selezione di una batteria di test comportamentale potente e affidabile è essenziale per coprire una vasta gamma di aspetti comportamentali come per i modelli animali del morbo di Parkinson e della distonia^3,4,5,6.

Il nervo sciatico è il nervo più grande del corpo umano con fibre motorie e sensoriali. Le lesioni del nervo sciatico possono derivare facilmente da una varietà di eventi come incidenti stradali e interventi^{chirurgici 7,8}. Pertanto, le attività di ricerca che utilizzano modelli di roditori con lesioni nervose sciatiche, hanno un valore traslazionemente rilevante. Anche se l'aspetto traslatore della rigenerazione nervosa dal ratto all'uomo deve^{essere considerato criticamente 9}, la lesione da schiacciamento del nervo sciatico (assonotmesi) nei modelli di roditori è un metodo comunemente usato per analizzare i processi di degenerazione e rigenerazione dei nervi^{periferici 10,11}. In caso di infortunio alla schiacciamento il nervo non è completamente trasetto. Danneggia l'assone, risultando in blocco di conduzione subito dopo lesioni da schiacciamento seguite da processi ^{rigenerativi 4,12,13}.

Inoltre, nella ricerca sulla distonia, la lesione unilaterale della schiacciamento del nervo sciatico è un metodo stabilito per innescare movimenti simili alla distonia (DLM) nei modelli di roditori distonia geneticamente predisposti, che non mostrano DLM di per^{sé 4,14}. Si presume che il trauma nervoso periferico disturbi l'integrazione sensorimotoria influenzando le fibre nervose sciatiche, che sono responsabili delle funzioni motorie e^{sensoriali 15}.

Qui forniamo una descrizione dettagliata per una lesione di schiacciamento standardizzata del nervo sciatico e una batteria di valutazioni del comportamento motorio composta dal test sul campo aperto (OFT), analisi dell'andatura CatWalk XT, compito di camminata del fascio e compito di camminata a gradini in ingenui ratti di tipo selvaggio (wt) (n = 8-9) e ratti wt cinque settimane dopo una lesione unilaterale da schiacciamento del nervo sciatico (n = 10). L'OFT fornisce informazioni sull'attività locomotoria generale, mentre un'analisi dettagliata dell'andatura è ottenuta dal sistema di analisi automatizzata dell'andatura CatWalk XT. Il compito di camminata del fascio viene utilizzato per valutare la coordinazione del motore valutando il tempo di attraversare la trave e il numero di errori di posizionamento del piede. Per l'analisi delle prestazioni dell'andatura, il compito di camminare con gradini a scala fornisce informazioni sul posizionamento del piede o della zampa ed errori su un apparato a gradini orizzontali con un motivo a gradini costante ma irregolare.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dalle autorità locali del Regierung von Unterfranken (Würzburg, Germania) ed eseguiti secondo le linee guida internazionali, nazionali e/o istituzionali applicabili per la cura e l'uso degli animali.

1. Lesione da schiacciamento del nervo sciatico

NOTA: Mantenere un ambiente sterile durante l'intera procedura chirurgica. Impostare il tavolo dell'intervento chirurgico con l'attrezzatura necessaria.

1. Anestetizza profondamente il topo in un armadio chiuso con isoflurane 3,0% in O₂ (2 L/min). Rimuovere il topo dall'armadio. Radere una vasta area dell'arto posteriore destro.
2. Posizionare il ratto nella maschera di anestesia e continuare l'anestesia profonda con isoflurane 2,0% in O₂ (2 L/min). Controllare la profondità dell'anestesia pizzicando la fettuccia interdidigitale dei piedi posteriori. L'assenza di riflessi di astinenza indica un'anestesia adeguata.
3. Fissare il busto e entrambi gli arti posteriori del topo con del nastro adesivo. Posizionare entrambi gli arti posteriori in una posizione simmetrica e tesa ruotando la zampa piatta sul tavolo dell'intervento chirurgico.
4. Applicare unguento oftalmico sugli occhi per prevenire gli occhi asciutti. Disinfettare la pelle dell'area rasata con un antisettico.
5. Cerca la tacca sciatica dell'ilio.
6. Fai un'incisione cutanea dalla tacca sciatica nella direzione della zampa con un bisturi. L'incisione cutanea dovrebbe essere il più piccola possibile (circa 1-2 cm).
7. Se gli arti posteriori sono fissi e l'incisione cutanea viene eseguita correttamente, si può vedere una cavità nel piano fasciale tra il muscolo gluteo massimo e il muscolo bicipite femoris che assomiglia a una "linea bianca". Inserire le forcep emostatiche super fini chiuse (n. 5) nella cavità e stendere le forcep. Il piano fasciale dovrebbe aprirsi senza ferire alcun tessuto muscolare.
8. Posizionare i retrattini dell'elastico sotto i muscoli, per mantenere aperta l'incisione cutanea.
9. Rimuovere delicatamente qualsiasi tessuto e vasi sanguigni circostanti dal nervo sciatico fino a quando il nervo non è completamente esposto. È importante non allungare o tirare il nervo durante l'intera procedura.
10. Schiacciare il nervo sciatico con un morsetto non seghettato (emostato ultra-fine) con pressione costante e riproducibile. Per questo, aprire il morsetto, posizionare il nervo sulla mascella inferiore del morsetto e chiudere il morsetto bloccandolo nella prima posizione per tre volte dieci secondi. La posizione della schiacciata del nervo sciatico si trova vicino alla tacca sciatica, prossimale al sito di divisione del fascio principale di nervi sciatici. Dopo la lesione da schiacciamento, riaprire attentamente il morsetto. Il sito di schiacciamento del nervo sciatico appare traslucido.
11. Rimuovere i retrattiri dell'elastico.
12. Chiudere l'incisione del piano fasciale con sutura riassorbibile 4-0. Chiudere l'incisione cutanea con le graffette della pelle del corpo.
13. Applicare Rimadyl secondo le linee guida GV-SOLAS (5 mg/kg di peso corporeo, iniezione sottocutanea) per alleviare il dolore postoperatorio ogni 24 ore dopo l'intervento chirurgico per due giorni.
14. Rimuovere il topo dalla configurazione dell'intervento chirurgico. Posizionare il topo in una gabbia pulita senza lettiera su una piastra riscaldante (37 °C) fino a quando il topo non è sveglio. Riporta il topo nella gabbia pulita di casa.
15. Rimuovere le graffette della pelle del corpo da quattro a sei giorni dopo l'intervento chirurgico.

2. Prova sul campo aperto (OFT)

NOTA: L'attività locomotoria e l'attività comportamentale possono essere analizzate dall'OFT.

1. apparecchio
   1. Impostare l'OFT (Figura 1A) in un ambiente buio e silenzioso. È costituito dal sistema di tracciamento video automatizzato EthoVision XT (computer, software con licenza) e da un'arena che misura 58,5 cm (lunghezza) x 58,5 cm (larghezza) x 45 cm (altezza) con una superficie nera resistente ai graffi e pulibile. La superficie nera è importante per aumentare il contrasto quando si tracciano gli animali bianchi.
2. valutazione
   1. Posizionare l'arena e la fotocamera nella posizione corretta. Regolare la fotocamera in base alla registrazione dell'intera casella di campo aperto con la risoluzione migliore. Eseguire l'esperimento in un ambiente buio. Se la luce è necessaria per la configurazione, utilizzare una luce piccola e diffusa per evitare macchie luminose, riflessi e sfumature nell'arena. Garantire condizioni di luce uguali misurando l'illuminamento con un metro lux in diverse aree dell'arena.
   2. Configurare il software EthoVision XT. Le impostazioni più importanti sono elencate di seguito. In Impostazioni esperimento scegliere Rilevamento live per l'origine video e il rilevamento dei punti di centro per le feature tracciate. Convalida le dimensioni dell'arena nelle impostazioni dell'arena. Impostare la condizione iniziale per l'acquisizione dei dati su tre secondi dopo che il ratto è stato posizionato al centro dell'arena e il tempo di esecuzione totale su cinque minuti in Impostazioni controllo prove. Scegliere Sottrazione statica per il metodo in Impostazioni rilevamento. Segno di spunta Salva video per metodo in Impostazioni acquisizione.
   3. Posizionare delicatamente il topo al centro dell'arena di prova(Figura 1B).
   4. Premere il pulsante Avvia valutazione in Controllo acquisizione per avviare la registrazione.
   5. Durante la registrazione, stare lontano dalla configurazione OFT per evitare di distrarre il topo.
   6. Dopo ogni prova, rimuovere delicatamente il topo dall'arena di prova e pulire la configurazione con acido acetico allo 0,1% per evitare distrazioni dall'odore del ratto precedentemente registrato.
3. analisi dei dati
   1. Per l'analisi dei dati dell'OFT con il software EthoVision XT, passare alla sezione Analisi nella barra laterale sinistra e scegliere Visualizzazione traccia nella scheda Risultati (Figura 1C). Esportare quindi i parametri necessari in Excel. All'interno del software, scegli una serie di variabili di diverse categorie per l'analisi dei dati. Variabili importanti per questo specifico obiettivo scientifico sono "Distanza spostata" e "Velocità" nella categoria "Distanza e tempo". Eseguire un'analisi statistica dei parametri selezionati (Figura 1D).

3. Analisi dell'andatura CatWalk XT

NOTA: Un'analisi dell'andatura tramite il sistema CatWalk XT può aiutare a valutare molti parametri diversi riguardanti le impronte, la posizione e l'andatura dei modelli animali. Una passerella di vetro è illuminata con luce verde e la luce dispersa dalle impronte degli animali viene catturata con una videocamera ad alta velocità, che si trova sotto la passerella. I segnali possono essere analizzati con il software CatWalk XT.

1. apparecchio
   1. Per l'analisi dell'andatura con CatWalk XT, utilizzare il sistema CatWalk e il software corrispondente (computer, software con licenza) (Figura 2A).
   2. Eseguire l'esperimento in condizioni di buio, perché l'acquisizione dei dati dipende dall'illuminazione della passerella del sistema CatWalk con luce LED verde. Per facilitare la procedura sperimentale in condizioni di buio, illuminare la stanza sperimentale con luce rossa.
   3. Utilizzare una passerella definita che misura 65 cm di lunghezza e 7 cm di larghezza; tuttavia, la dimensione della passerella dipende dalle dimensioni dei ratti. Imposta la passerella il più grande possibile per registrare quante più impronte possibili per ogni zampa.
   4. Cattura un numero minimo di tre impronte per zampa per ogni corsa. Quando si definisce la lunghezza della passerella, considerare il corpo e la coda del topo, poiché il segnale di inizio o arresto potrebbe non essere rilevato correttamente e le corse potrebbero non essere classificate come conformi, se il corpo / coda entra o rimane sulla passerella definita prima o dopo il completamento della corsa.
2. formazione
   NOTA: L'allenamento dei ratti per il sistema CatWalk è necessario per abituare gli animali alla configurazione e consentire loro di imparare ad attraversare la passerella senza alcuna interruzione. Una formazione adeguata offre i vantaggi di risparmiare tempo durante la valutazione sperimentale e ottenere risultati migliori. L'avvio dell'acquisizione dei dati del sistema CatWalk durante le sessioni di allenamento consente ai ratti di abituarsi alle condizioni di valutazione (rumore/luce).
   1. Inizia a configurare il sistema CatWalk.
      1. Pulire la passerella di vetro con acqua distillata e un panno morbido privo di pelucchi. All'inizio e alla fine dell'esperimento, o nel mezzo se la passerella di vetro è sporca, utilizzare fluido per la pulizia del vetro e panno morbido privo di pelucchi per pulire la passerella di vetro. Dopo l'uso del fluido detergente del vetro, sgombro la passerella da eventuali residui del fluido per evitare che distragga l'animale.
      2. Scegli le impostazioni sperimentali. Un parametro importante è Run Criteria. Impostare i valori appropriati per durata minima di esecuzione, durata massima diesecuzione e numero minimo di esecuzioni conformi da acquisire, specifiche per ogni progetto di ricerca. Selezionare la casella Usa variazione di velocità massima consentita e impostare il valore. I criteri di esecuzione possono essere ignorati per i primi quattro o cinque giorni di allenamento.
      3. Posizionare la fotocamera in posizione e regolare la messa a fuoco. Trova la posizione ottimale della fotocamera per ottenere una lunghezza appropriata della passerella e la migliore risoluzione delle zampe registrate contemporaneamente. Etichettare la posizione della fotocamera sul sistema CatWalk per garantire un posizionamento identico della fotocamera tra le registrazioni.
      4. Impostare le impostazioni di rilevamento utilizzando il rilevamento automatico per un nuovo esperimento. Assicurarsi che tutte le impronte possano essere rilevate con un rumore di fondo minimo. Se necessario, ottimizzare manualmente le impostazioni di rilevamento e modificare la soglia di intensità verde. Utilizzare le stesse impostazioni di rilevamento per l'intero esperimento.
      5. Impostare le pareti del corridoio del sistema CatWalk. Le pareti del corridoio dovrebbero essere il più vicino possibile al topo. Assicurarsi che le pareti del corridoio rimangano parallele alla passerella.
      6. Definire la lunghezza della passerella: fare clic sull'icona Definisci passerella. Regolare le dimensioni del rettangolo bianco in lunghezza e larghezza, in base al progetto di ricerca specifico. Fare clic su OK.
      7. Calibrare la passerella: fare clic sull'icona Calibra passerella. Posizionare una scheda di calibrazione rettangolare di 20 x 10 cm al centro della passerella. Adattare le dimensioni del rettangolo bianco al foglio di calibrazione. Fare clic su OK.
      8. Quindi, scatta un'immagine di sfondo: controlla in anticipo che la passerella sia pulita e vuota. Fare clic sul pulsante Aggancia sfondo per generare un'immagine di sfondo.
   2. Addestrare gli animali per almeno otto giorni prima di iniziare l'esperimento vero e proprio. Si consiglia l'allenamento nei giorni successivi.
      1. Primo giorno di allenamento: per i ratti di abituarsi al sistema CatWalk, consenti all'animale di esplorare liberamente la passerella e la scatola degli obiettivi. Lascia che i topi si pratiino attraversando la passerella ed entrino nella scatola degli obiettivi. Prendi il topo alla fine della passerella o nella scatola degli obiettivi e riporta il topo al punto di partenza della passerella. Cinque corse sono consigliate per il primo giorno di allenamento senza bisogno di conformità alle impostazioni sperimentali.
      2. Giorno 2 di allenamento: I ratti possono esplorare liberamente la passerella e la scatola degli obiettivi. Sono consigliate cinque esecuzioni senza conformità alle impostazioni sperimentali.
      3. Giorno 3 di allenamento: sono consigliate otto esecuzioni senza conformità alle impostazioni sperimentali.
      4. Giorno 4 di allenamento: Dieci esecuzioni sono consigliate senza conformità alle impostazioni sperimentali.
      5. Giorno 5 di allenamento: Si consigliano dieci corse. Le impostazioni sperimentali devono essere tenute a mente. Motiva i ratti ad attraversare la passerella senza alcuna interruzione.
      6. Giorno 6 di allenamento: Si consigliano dieci corse. Le impostazioni sperimentali devono essere tenute a mente. Motiva i ratti ad attraversare la passerella senza alcuna interruzione.
      7. Giorno 7 di allenamento: Si consigliano dieci corse. Dovrebbero essere raggiunte almeno tre esecuzioni conformi. Aggiungi altre corse per gli animali, se non sono stati in grado di raggiungere questo obiettivo.
      8. Giorno 8 di allenamento: Si consigliano dieci corse. Dovrebbero essere raggiunte almeno tre esecuzioni conformi. Aggiungi altre corse per gli animali, se non sono stati in grado di raggiungere questo obiettivo.
3. valutazione
   1. Secondo i criteri di esecuzione definiti, eseguire tre esecuzioni conformi per ratto per l'analisi dei dati. Per la valutazione, seguire i passaggi 3.2.1. - 3.2.1.8. come descritto nella sezione formazione. Anche se il topo raggiunge tre corse conformi entro le prime tre corse, eseguire un minimo di sei corse per sessione / a settimana per scopi di allenamento.
   2. Eseguire almeno una sessione (allenamento) con sei corse a settimana per un modello di andatura stabile per esperimenti con più punti di tempo. Le impostazioni sperimentali e di rilevamento rimangono coerenti per l'intero esperimento.
4. analisi dei dati
   1. Per l'analisi dei dati, valutare solo le esecuzioni conformi. Eliminare esecuzioni non conformi.
   2. Verificare la soglia di intensità verde e aumentare o diminuire la soglia di intensità verde prima che la classificazione della zampa si stampa, se necessario. La soglia di intensità verde deve essere coerente per tutti gli animali e tutte le corse.
   3. Classificare automaticamente le stampe dei pegni con il software CatWalk XT (Figura 2B).
   4. Esaminare manualmente le etichette di stampa dei pegni. Correggere le etichette di stampa errate delle zampe, aggiungere etichette di impronte di zampe non rilevate ed eliminare manualmente il rumore e le etichette errate. Spostare il video in una posizione, che deve essere rivista manualmente. Per correggere le stampe errate delle zampe etichettate, selezionare il rettangolo della stampa paw specifica, fare clic su Reimposta, selezionare nuovamente lo stesso rettangolo e assegnare l'etichetta corretta dall'elenco. Per etichettare le impronte di zampe non rilevate, disegnare un rettangolo attorno al pedone non rilevato, fare clic su Aggiungistampa , selezionare il nuovo rettangolo generato e assegnare l'etichetta corretta dall'elenco. Nel caso in cui il software con etichetta nose o body stampi automaticamente, selezionare il rettangolo dell'etichetta specifica e fare clic su Rimuovi stampa.
   5. Esaminare i risultati numerici. I risultati numerici vengono visualizzati in un foglio di Excel, mostrando una serie di parametri di base. Scegliere parametri specifici predefiniti, a seconda dell'interesse della ricerca ed eseguire analisi statistiche come al solito (Figura 2D).
   6. Per informazioni più dettagliate su ogni impronta, classificare le dita dei piedi delle zampe posteriori. Questa analisi richiede il modulo Misurazioni interattive dell'impronta.
      1. Se necessario, adatta la soglia di intensità verde per l'analisi interattiva delle misurazioni dell'impronta. La soglia di intensità verde deve essere coerente per tutti gli animali e tutte le corse.
      2. Impostare manualmente i marcatori per l'analisi dell'impronta. Analizza ogni stampa della zampa posteriore in tutte e tre le corse conformi. Disegnare una linea dal centro del primo dito del dito del primo al centro del quinto dito del dito per misurare "Toe Spread". Disegnare una linea dal centro del secondo dito del dito del secondo al centro del quarto dito del dito per misurare "Intermedio dito del dito del dito". Disegnare una linea dal centro del terzo dito al tallone della zampa posteriore per misurare "Lunghezza di stampa manuale" (Figura 2C).
      3. Esaminare i risultati numerici delle "Misurazioni interattive dell'impronta" visualizzate in un foglio separato. Selezionare parametri specifici delle "Misurazioni interattive dell'impronta" ed eseguire analisi statistiche come al solito (Figura 2E).

4. Compito di beam walking

NOTA: I deficit di andatura possono essere determinati dal compito di camminata del raggio. Il focus del compito di beam walking in questo specifico argomento di ricerca sarà l'analisi della coordinazione motoria, definita come la capacità di coordinare l'attivazione muscolare da più parti del corpo, e non la valutazione dell'equilibrio motorio, definita come la capacità di controllo posturale durante i movimenti del corpo.

1. apparecchio
   1. Per l'attività di camminata del fascio, utilizzare un fascio, un distanziale, un tavolo, uno sfondo uniforme e una videocamera (Figura 3A).
   2. Utilizzare una trave di legno di 90 cm di lunghezza, 1,7 cm di larghezza e 2 cm di altezza. Si consiglia una piattaforma di 20,5 cm di lunghezza, 15 cm di larghezza e 2 cm di altezza a entrambe le estremità della trave. Utilizzare lo stesso materiale per le piattaforme e la trave, evitare eventuali barriere tra le piattaforme e la trave.
   3. Avere la distanza tra la trave e il tavolo di almeno 44 cm. Un ambiente familiare come una gabbia domestica motiva i ratti ad attraversare la trave, che può essere posizionata alla fine della piattaforma del fascio.
2. formazione
   1. Impostare la trave con distanziale e gabbia domestica sul tavolo.
   2. Addestrare gli animali per sette giorni. Si consiglia l'allenamento nei giorni successivi.
      1. 1° giorno di allenamento
         1. Posizionare tutti i ratti da una gabbia domestica sulla piattaforma iniziale della trave.
         2. Lascia che i ratti esplorino l'ambiente (piattaforma / trave).
         3. Tenere un topo con attenzione vicino alla coda e condurre il topo al fascio spingendo delicatamente il topo sulla trave.
         4. Assistere il topo nell'attraversare la trave tenendo il topo per la coda per almeno due corse.
         5. Lascia che il topo attraversi la trave per altre tre corse senza assistenza. Osservare il ratto e fornire assistenza, se necessario. Se il topo non riesce ad attraversare la trave, intercetta la caduta per evitare lesioni e lo sviluppo della paura di attraversare la trave.
         6. Continuare con questa procedura per tutti i ratti.
            NOTA: A volte i ratti si sus seguono per attraversare la trave, nel qual caso non è necessaria alcuna assistenza. Tuttavia, è importante osservare i ratti, intercettare le cadute e fornire assistenza se necessario.
      2. Giorno 2 della formazione
         1. Posizionare tutti i ratti da una gabbia domestica sulla piattaforma iniziale della trave.
         2. Lascia che i ratti attraversino la trave sei volte.
         3. Se necessario, fornire assistenza e intercettare le cadute.
      3. 3° giorno di allenamento
         1. Posizionare un topo sulla piattaforma iniziale della trave.
         2. Lascia che il topo attraversi la trave sei volte.
         3. Se necessario, fornire assistenza e intercettare le cadute.
      4. Giorno 4-7 di allenamento
         1. Posizionare un topo sulla piattaforma iniziale della trave.
         2. Lascia che il topo attraversi la trave dieci volte.
         3. Se necessario, fornire assistenza e intercettare le cadute.
         4. Al termine dell'allenamento, il ratto dovrebbe attraversare la trave senza alcuna interruzione per almeno tre corse. È consentito spingere delicatamente il topo sulla piattaforma di partenza per innescare l'inizio del movimento.
3. valutazione
   1. Impostare la trave con distanziale e gabbia domestica sul tavolo.
   2. Posizionare la videocamera in posizione, allineata in parallelo al fascio con l'animale a fuoco. La posizione della videocamera deve essere il più vicina possibile all'animale per ottenere una risoluzione ottimale dei movimenti registrati. Il fascio e le parti di entrambe le piattaforme devono essere catturati dalla registrazione.
   3. Avviare la registrazione e identificare prima la sessione e l'animale.
   4. Posizionare il topo sulla piattaforma iniziale della trave.
   5. Il topo dovrebbe attraversare la trave tre volte senza alcuna interruzione. Anche se il topo raggiunge tre corse conformi entro le prime tre esecuzioni, eseguire un minimo di sei-dieci esecuzioni per prestazioni di attività continue.
   6. Osserva sempre l'animale e intercetta le cadute, se necessario.
   7. Dopo il compito, pulire il fascio e il tavolo con acido acetico allo 0,1% per evitare distrazioni dall'odore del ratto precedentemente registrato.
      NOTA: Entro le prime due settimane dopo la lesione da schiacciamento nervoso, i ratti non sono in grado di attraversare la trave senza assistenza. Pertanto, è necessario fornire assistenza per sei-otto corse nelle prime due settimane dopo l'infortunio alla schiacciamento nervoso. Dalla terza alla settimana cinque, cinque corse vengono eseguite con assistenza e altre dieci corse sono state eseguite senza assistenza.
4. analisi dei dati
   1. Utilizza il software di analisi video gratuito Kinovea per l'analisi dei dati.
   2. Selezionare le sequenze video di tre esecuzioni conformi dalla registrazione. Per questo, scegli le prime tre corse conformi che sono state eseguite senza l'assistenza dell'animale. Essere coerenti nella selezione di esecuzione conforme per tutti i ratti.
   3. Definire il punto di ora di inizio e il punto di fine delle tre esecuzioni conformi selezionate (Figura 3D-E). In questa configurazione, il punto iniziale è stato etichettato da una linea nera sulla trave e il posizionamento del primo ostacolo dietro la linea nera ha definito il punto di inizio della corsa. Il posizionamento del primo ostacolo sulla piattaforma alla fine della trave definisce il punto di fine del tempo.
   4. Quindi, calcola il tempo necessario al topo per attraversare la trave. Segnalare i dati come tempo di latenza per attraversare il fascio in pochi secondi ed eseguire analisi statistiche come al solito (Figura 3B).
   5. Ottieni il numero di passaggi ed errori da tre esecuzioni conformi per entrambi gli arti posteriori separatamente utilizzando la funzione zoom e slow motion del software. Gli errori includono scivolamenti totali del piede e scivolamenti di mezzo piede. Uno slittamento totale del piede è definito come un posizionamento del piede seguito da uno scivolo profondo che causa una perdita di contatto della zampa interessata con la trave (Figura 3F). Un mezzo scivolo è definito come una zampa che scivola dalla parete laterale della trave senza perdere il contatto completo con la trave (Figura 3G).
   6. Calcolare la percentuale di scivolamenti del piede in relazione al numero di gradini per attraversare la trave ((numero di scivolamenti del piede dell'arto x 100%)/ numero di gradini dello stesso arto). Presentare i dati come scivolamenti percentuali del piede ed eseguire analisi statistiche come al solito(figura 3C).

5. Compito di camminata a gradini a scala

NOTA: Il compito di camminata a gradini della scala può valutare la funzione motoria, il posizionamento sia degli arti anteriori che degli arti posteriori e la coordinazione dell'interlimb.

1. apparecchio
   1. Utilizzare un apparecchio a pioli, un distanziale, un tavolo, uno sfondo uniforme e una videocamera per questo test comportamentale (Figura 4A). L'apparato orizzontale a pioli è costituito da pioli metallici e pareti laterali in policarbonato trasparente. L'apparecchio ha una lunghezza di 119,5 cm e la larghezza è regolata a 7,4 cm. La passerella da analizzare ha una lunghezza di 100 cm.
   2. Etichettare il punto iniziale e finale con una linea nera sulla parete laterale. Posizionare i segnaposto per i rung sull'apparecchio a intervalli di 1 cm. Disporre un modello irregolare dei falesie per la passerella di 100 cm con una distanza compresa tra 1 e 5 cm tra i falesie. I primi 10 cm all'inizio e gli ultimi 9,5 cm alla fine dell'apparecchio, esclusi dall'analisi, hanno un modello regolare dei falesie con una distanza di 1 cm.
   3. Utilizzare una distanza tra la passerella e la tabella di circa 30 cm(figura 4A-B). Una scatola degli obiettivi o un ambiente familiare alla fine dell'apparato, come una gabbia domestica, motiva i ratti ad attraversare l'apparato a pioli.
2. formazione
   1. Impostare l'apparato a pioli con distanziale e scatola porta sul tavolo.
   2. Addestrare gli animali per otto giorni. Si consiglia l'allenamento nei giorni successivi.
      1. 1° giorno di allenamento
         1. Posizionare tutti i ratti da una gabbia domestica sull'apparato a pioli.
         2. Lascia che i ratti esplorino l'ambiente (apparato a gradini/scatola degli obiettivi).
         3. Spingere delicatamente i ratti nella direzione della scatola di porta. Aiuta i topi ad entrare nella scatola dei gol. Lascia che i topi esplorino la scatola degli obiettivi per un po '.
         4. Dopo che tutti i topi sono entrati nella scatola dei gol. Prendere il primo topo dalla scatola degli obiettivi e posizionare di nuovo il topo nella zona iniziale dell'apparato. Continuare con la stessa procedura per tutti i ratti di una gabbia domestica. Spingere delicatamente i ratti nella direzione della porta e dare assistenza per entrare nella scatola di porta, se necessario.
         5. Lascia che il topo attraversi l'apparato quattro volte.
      2. Giorno 2 della formazione
         1. Eseguire lo stesso protocollo elencato per il primo giorno di allenamento.
         2. Lascia che il topo attraversi l'apparato sei volte.
      3. 3° giorno di allenamento
         1. Eseguire lo stesso protocollo elencato per il primo giorno di allenamento.
         2. Lascia che il topo attraversi l'apparato otto volte.
      4. Giorno 4 della formazione
         1. Posizionare un topo all'inizio dell'apparato a pioli.
         2. Se il topo non attraversa l'apparato ed entra volontariamente nella scatola degli obiettivi, dare assistenza spingendo delicatamente il topo da dietro.
         3. Lascia che il topo attraversi l'apparato otto volte.
      5. Giorno 5-8 di allenamento
         1. Posizionare un topo all'inizio dell'apparato a pioli.
         2. Se il topo non attraversa l'apparato ed entra volontariamente nella scatola degli obiettivi, dare assistenza spingendo delicatamente il topo da dietro.
         3. Lascia che il topo attraversi l'apparato dieci volte.
         4. Al termine dell'allenamento, il topo dovrebbe essere in grado di attraversare la passerella senza alcuna interruzione e assistenza per un minimo di tre corse. È consentito dare al topo una leggera spinta nella zona iniziale per innescare l'inizio del movimento.
3. valutazione
   1. Impostare l'apparato a pioli con distanziale e scatola porta sul tavolo.
   2. Posizionare la videocamera in posizione, allineata parallelamente all'apparecchio con l'animale a fuoco. Posizionare il camcorder il più vicino possibile all'animale per ottenere una risoluzione ottimale dei movimenti registrati e assicurarsi che l'intero apparato a pioli sia catturato nella registrazione.
   3. Avviare la registrazione e identificare prima la sessione e l'animale.
   4. Posizionare il topo nella zona iniziale dell'apparato a pioli.
   5. Il ratto deve attraversare la passerella di 100 cm dell'apparato a pioli tre volte senza alcuna interruzione per potersi qualificare come una corsa conforme. Anche se il ratto raggiunge tre corse conformi entro le prime tre esecuzioni, è necessario effettuare almeno dieci esecuzioni per prestazioni continue delle attività.
   6. Dopo il compito, pulire l'apparecchio e il tavolo con lo 0,1% di acido acetico per evitare distrazioni dall'odore del ratto precedentemente registrato.
4. analisi dei dati
   1. Utilizza il software di analisi video gratuito Kinovea per l'analisi dei dati.
   2. Selezionare le sequenze video di tre esecuzioni conformi dalla registrazione. Scegliere le prime tre esecuzioni conformi per l'analisi dei dati.
   3. Definire il punto di ora di inizio e il punto di fine delle tre esecuzioni conformi selezionate. Il posizionamento del primo ostacolo dietro la prima linea nera sulla parete laterale dell'apparato, che etichetta il punto di orario di inizio della passerella di 100 cm, definisce il punto di inizio della corsa. Il posizionamento della prima parte anteriore dietro la seconda linea nera sulla parete laterale dell'apparato, che etichetta il punto finale della passerella di 100 cm, definisce il punto di fine della corsa.
   4. Identificare il punto di ora di inizio e fine. Quindi, calcola la durata della corsa attraverso la passerella. Segnalare i dati come tempo di latenza per attraversare la passerella in pochi secondi ed eseguire analisi statistiche come di consueto (Figura 4C).
   5. Segnare le tre esecuzioni conformi con la scala a 7 categorie da Metz et al. Determinare separatamente il numero di passaggi e il numero di errori in base alle categorie della scala per ogni arto. La scala distingue tra le seguenti categorie: (0) totale miss (1) scivolata profonda (2) leggero slittamento (3) sostituzione (4) correzione (5) posizionamento parziale e (6) posizionamento corretto. È stato valutato solo l'errore dell'arto iniziatore. Ulteriori errori, attivati dall'errore iniziale, non devono essere valutati.
   6. Calcolare gli errori/passaggi considerando i seguenti requisiti. Le categorie (0) totale miss (1) deep slip (2) leggero conteggio degli scivolamenti come errore. Dividere il numero di errori per il numero di passaggi per ogni ostacolo e ciascuno eseguito separatamente. Determinare il valore medio di tutte e tre le esecuzioni conformi per ogni animale e ogni ostacolo separatamente ed eseguire analisi statistiche come al solito (Figura 4D).

Risultati

I risultati rappresentativi dell'OFT di cinque minuti mostrano che la lesione da schiacciamento nervoso cinque settimane dopo l'intervento chirurgico non ha alcun effetto sull'attività locomotoria (Figura 1).

L'analisi dell'andatura con il sistema CatWalk XT (Figura 2) genera molti parametri diversi. I parametri selettivi sono stati analizzati statisticamente confrontando i ratti ingenui con ratti wt feriti dai nervi cinque settimane dopo la schiacciamento nervoso (Figura 2D). Potrebbero essere rilevate alterazioni significative per la velocità media di corsa, la lunghezza del passo e l'area di stampa della zampa posteriore ferita dal nervo (destra). Un'analisi più dettagliata della zampa posteriore ferita dal nervo è stata eseguita con il modulo "Misurazioni interattive dell'impronta". Nei ratti wt feriti dai nervi è stata osservata una significativa riduzione dei parametri di diffusione, diffusione intermedia delle dita dei piedi e lunghezza della stampa rispetto ai ratti ingenui. Inoltre, l'asse del corpo dell'angolo della zampa e il vettore di movimento dell'angolo della zampa differiscono significativamente quando si confrontano i ratti wt feriti dal nervo con i ratti ingenui wt (Figura 2E).

La figura 3 presenta i dati della coordinazione motoria ottenuti attraverso la valutazione del compito di camminata del fascio. I ratti wt feriti dai nervi hanno mostrato un tempo di latenza significativamente aumentato per attraversare il fascio rispetto ai ratti ingenui cinque settimane dopo l'infortunio (Figura 3B). Come ulteriore lettura del compito di camminare con il fascio, sono stati conteggiati e considerati come un errore per l'analisi statistica gli scivolamenti completi e i semiscivoloni dell'arto posteriore ferito dal nervo. La percentuale di errori per passo dell'arto posteriore (destro) ferito dal nervo è stata significativamente aumentata nei ratti wt feriti dai nervi rispetto ai ratti ingenui.

I dati rappresentativi del compito di camminare a pioli(figura 4) non mostrano alterazioni significative nel tempo di latenza per attraversare la passerella dell'apparato a pioli (Figura 4C) o nella percentuale di errori per passo dell'arto posteriore leso dal nervo (adestra) (figura 4D). L'analisi della percentuale di errore per passo dell'arto posteriore ferito dal nervo ha considerato solo il punteggio da 0 a 2 della scala di 7 categorie da Metz et al. La distribuzione di tutte le categorie di punteggio per passo dalla scala a 7 categorie dell'arto posteriore nevralgico e dell'arto posteriore non nervino (sinistro) è illustrata nella figura 4E.

Figura 1: Valutazione dell'attività locomotoria durante la prova in campo aperto. (A) Immagine dell'impostazione del test a campo aperto. Immagine selezionata sottratta da un video registrato durante il test a campo aperto che mostra un topo nell'arena a campo aperto senza (B) e con tracciamento (C). (D) La velocità durante una registrazione di cinque minuti di prova in campo aperto è stata studiata nei ratti ingenui e nei ratti wt cinque settimane dopo la lesione da schiacciamento nervoso. I dati sono indicati come ± SEM. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Analisi dell'andatura con il sistema CatWalk XT. (A) Immagine dell'apparato CatWalk XT. (B) Esempi della vista di stampa che mostra le impronte delle zampe etichettate in modalità falso colore ed esempi della vista di temporizzazione che mostrano il diagramma dell'andatura basato sul tempo dei ratti ingenui e dei ratti wt cinque settimane dopo la lesione da schiacciamento nervoso. (C) Esempi della classificazione delle dita dei dita dei dati che mostrano la diffusione delle dita dei piede (TS), la diffusione intermedia delle dita dei dita dei piede (ITS) e la lunghezza di stampa (PL), nonché esempi della vista dell'asse del corpo che mostra l'asse del corpo (linea bianca) e il vettore di movimento (linea rossa) dei ratti ingenui e dei ratti wt cinque settimane dopo la lesione da schiacciamento nervoso. (D) Dati di parametri selezionati della classificazione "standard" che confrontano ratti ingenui e ratti wt cinque settimane dopo la lesione da schiacciamento nervoso. (E) Dati di parametri selezionati dal "modulo Misurazioni interattive dell'impronta" confrontando ratti ingenui e ratti wt cinque settimane dopo la lesione da schiacciamento nervoso. I dati sono mostrati come media ± SEM. L'analisi statistica è stata eseguita utilizzando il test t non accoppiato dei dati normalmente distribuiti, il test t non accoppiato con la correzione di Welch di dati normalmente distribuiti con varianza disuguale e il test Mann-Whitney U dei dati distribuiti non normali. Il valore P < 0,05 è stato definito come statisticamente significativo etichettato come *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Analisi dell'andatura con il compito di camminare con il fascio. (A) Disegni immagine e schematici della configurazione del compito di camminata del fascio. Il tempo di latenza per attraversare il fascio (B) e la percentuale di errori di scivolamento del piede per passo dell'arto posteriore nevralgico durante il compito di camminata del fascio (C) è stato analizzato nei ratti ingenui e nei ratti wt cinque settimane dopo la lesione da schiacciamento nervoso. Immagine rappresentativa per la posizione dell'ora di inizio (D) e la posizione dell'ora di fine (E) dell'attività di camminata del fascio. Sequenza di immagini rappresentativa di un errore di slittamento completo (F) e di un errore di mezzo slittamento (G) del compito di camminata del fascio. I dati sono mostrati come ± sem. Il valore P < 0,05 è stato definito come statisticamente significativo etichettato come *p < 0,05, **p < 0,01. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Analisi dell'andatura mediante il compito di camminata a pioli. Immagine (A) e disegni schematici (B) della scala che cammina nell'impostazione del compito. Il tempo di latenza di attraversamento dell'apparato del gradino a scala (C) e la percentuale di errori di scivolamento del piede per gradino dell'arto posteriore nevralgico durante il compito di camminare a gradini (D) sono stati valutati nei ratti ingenui e nei ratti wt cinque settimane dopo la lesione da schiacciamento nervoso. (E) La distribuzione percentuale della categoria di punteggio per passaggio in base alla scala delle 7 categorie da Metz et al. per l'arto posteriore sinistro e destro dei ratti ingenui wt e dei ratti wt cinque settimane dopo la lesione da schiacciamento nervoso. I dati sono mostrati come ± SEM. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Rappresentazione esemplare di ciascuna categoria secondo la scala delle 7 categorie di Metz et al. durante il compito di camminare a gradini scala. Sequenza di immagini rappresentativa dall'arto posteriore destro della categoria 0 - miss totale, categoria 1 - scivolo profondo, categoria 2 - leggero slittamento, categoria 3 - sostituzione, categoria 4 - correzione, durante il compito di camminata a gradini della scala. Immagini rappresentative per la categoria 5 - posizionamento parziale e categoria 6 - posizionamento corretto. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Questo protocollo di valutazione comportamentale fornisce una panoramica di vantaggi e svantaggi, nonché possibili letture della batteria di prova comportamentale selezionata in un modello di roditore dopo una lesione da schiacciamento del nervo sciatico.

Per ottenere un risultato comparativo della lesione da schiacciamento del nervo sciatico, è obbligatoria una tecnica di schiacciamento coerente. L'uso di un morsetto non seghettato (Ultra Fine Hemostat) al posto delle pinze può migliorare la consistenza della frantumazione. Utilizzare lo stesso morsetto e la stessa posizione di schiacciamento per garantire la stessa compressione nervosa. L'uso esclusivo del morsetto per la lesione da schiacciamento e la movimentazione del morsetto con cura migliora la consistenza. Inoltre, eseguire la procedura della lesione da schiacciamento con cura. Ulteriori danni al nervo durante l'intervento chirurgico come la trazione indesiderata del nervo possono portare a effetti collaterali indesiderati come l'automutilazione. Pertanto, si raccomanda un'attenta preparazione nervosa e la somministrazione di un antidolorifico per un minimo di due giorni.

La valutazione multifattoriale del comportamento motorio può caratterizzare il fenotipo dopo la lesione da schiacciamento nervoso nei ratti a vari livelli. Abbiamo utilizzato l'analisi dell'andatura OFT, CatWalk XT, il compito di beam walking e il compito di camminare con gradini a scala. Per questi esperimenti è essenziale una procedura sperimentale cieca e un'analisi dei dati per i gruppi sperimentali. Prima della valutazione del comportamento, gli animali sono stati acclimatati nella sala prove in condizioni di test per almeno 30 minuti. Tutti i test comportamentali applicati nel presente documento hanno il vantaggio che la privazione di cibo o acqua non è richiesta. Lo stesso gruppo di animali è stato utilizzato in tutti i test comportamentali descritti. Per ogni animale sono stati eseguiti al massimo due diversi test comportamentali al giorno. Se i test comportamentali vengono eseguiti a intervalli regolari, prestare attenzione a una procedura comparabile, come eseguire il test nello stesso ordine animale e allo stesso momento della giornata. Un altro aspetto importante per l'analisi comportamentale è il ciclo giorno-notte dei ratti. Si consideri un ciclo giorno-notte invertito per ottenere livelli di attività più naturali e più elevati durante il ciclo diurno (ciclo scuro). Questo deve essere considerato soprattutto per la misurazione del comportamento spontaneo, come l'OFT. In questo esperimento non è stato possibile attuare un ciclo invertito giorno-notte, ma è stata garantita un'adeguata acclimatazione alle condizioni di prova. Un'illuminazione perfetta è essenziale per i video ad alta risoluzione per il compito di camminare con il fascio e il compito di camminare con gradini a scala. Questa alta qualità video non può essere raggiunta quando si eseguono esperimenti al buio.

La valutazione dell'andatura richiede una prestazione di attività continua. Il primo aspetto importante di una continua prestazione di attività è convincere gli animali ad attraversare la configurazione. Per aumentare la motivazione, posizionare piccoli pellet alimentari (45 mg) alla fine della configurazione. Affinché gli animali conoscano i pellet alimentari, i pellet devono essere alimentati prima del test. Inoltre, una casella di obiettivo alla fine della configurazione può essere utile. La configurazione della Passerella include già una casella di porta, ma i ratti a volte esitano a entrare nella casella di porta. In alternativa, puoi aggiungere una piccola gabbia nella scatola degli obiettivi, ma la gabbia di casa dei ratti non si adatta alla scatola degli obiettivi. Lascia che il topo si assueti nella gabbia per alcuni minuti prima dell'acquisizione. Inoltre, un altro topo della stessa gabbia di casa può essere inserito nella scatola dei gol o nella gabbia all'interno della scatola porta. Assicurarsi che il secondo topo rimanga nella scatola e non blocchi l'ingresso alla scatola degli obiettivi. Inoltre, è anche possibile rimuovere la scatola degli obiettivi dal sistema CatWalk e posizionare la gabbia domestica del topo alla fine della passerella, che consente al topo di entrare nel proprio "territorio di casa" dopo ogni corsa. Per la configurazione del compito di camminata del fascio e del compito di camminata a gradini della scala, si consiglia di aggiungere una scatola porta o la gabbia di casa alla fine della configurazione. Per garantire la coerenza, la passerella, il compito di camminare con la trave e il compito di camminare con gradini a scala devono essere eseguiti almeno una volta alla settimana con da sei a dieci corse.

Sebbene non tutte le analisi producano differenze significative in questo studio, considera che l'inclusione di animali o gruppi di trattamento geneticamente modificati potrebbe produrre dati preziosi in grado di distinguere tra gruppi dagli stessi test comportamentali.

La lesione da schiacciamento nervoso non ha avuto alcun effetto sull'attività locomotoria del ratto, che è stata misurata in cinque minuti di OFT. L'analisi dell'andatura Catwalk XT è uno strumento più oggettivo e sensibile per analizzare il posizionamento di andature, zampe e dita dei dita dei dita dei dati. Dopo un intenso allenamento, i ratti imparano ad attraversare la passerella dell'apparato CatWalk XT fino alle impostazioni predefinite. La lesione nervosa non riduce la capacità dei ratti di attraversare la passerella. Il calcolo automatico di vari parametri presenta i dati in modo oggettivo. Ulteriori informazioni possono essere ottenute utilizzando il modulo "Misurazioni interattive dell'impronta" e, in effetti, queste analisi hanno prodotto differenze significative in vari parametri di diffusione delle dita dei dita dei dati, lunghezza di stampa e angolo della zampa rispetto all'asse del corpo confrontando i ratti con e senza lesioni nervose.

I ratti possono essere addestrati facilmente per il compito di camminare con il raggio. Le differenze nel tempo di latenza per attraversare la trave e nel numero di scivolamenti del piede per passo dell'arto posteriore nevralgico sono state rilevate confrontando ingenuamente con ratti feriti dalla schiacciamento. Uno svantaggio dell'analisi dei ratti feriti dai nervi con il compito di camminare con il fascio è la dimensione del fascio. Entro le prime due settimane dopo la lesione da schiacciamento del nervo sciatico, i ratti hanno bisogno di assistenza per attraversare la trave poiché il loro equilibrio è compromesso. Sebbene alcuni ratti possano essere in grado di attraversare la trave, il rischio di lesioni causate da una caduta è elevato. Gli animali schiacciati dai nervi dovrebbero quindi essere assistiti ad attraversare il raggio per le prime due settimane dopo la lesione da schiacciamento del nervo sciatico o più a lungo, se necessario. Tuttavia, è difficile confrontare le corse con e senza assistenza. Inoltre, il bilanciamento del motore è un parametro importante valutato dal compito di camminata del fascio. Abbiamo ritenuto che questo parametro non fosse rilevante per il nostro modello di ratto di schiacciamento nervoso. Pertanto, i punteggi descritti da Ohwatashi e altri e Johansson & Ohlsson non hanno potuto essere utilizzati e le corse con un traverso di travi incompleto sono state escluse per^{l'analisi dei dati 18,19}.

La scala a 7 categorie di Metz et al. Analizzando gli errori più importanti, che includono le categorie da 0 a 2, non è stato possibile rilevare differenze di errori per passo nell'ostacolo quando si confrontano ratti wt feriti dai nervi con ratti wt ingenui. Inoltre, il tempo di latenza di attraversamento dell'apparato a pioli non differiva tra ratti wt feriti dai nervi e ratti ingenui. I modelli di deep learning potrebbero migliorare e accelerare l'analisi dei dati del compito di camminata a pioli attraverso un approccio automatizzato.

È importante menzionare che la lesione da schiacciamento nervoso e tutti i test comportamentali descritti possono facilmente essere tradotti nei topi, adattando le impostazioni e le dimensioni delle configurazioni. L'uso dei topi come organismo modello ha l'effetto benefico che esistono modelli transgenici per molte malattie umane.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid, ≥99.8%	Sigma-Aldrich	33209-1L
Appose ULC skin stapler 35W	Covidien	8886803712
Beam	self made
Bepanthen eye cream	Bayer Vital GmbH	81552983
Box for OFT	self made
Camcorder GC-PX100	JVC
Catwalk XT	Noldus		setup and software
Chamber for isofluran	GT-Labortechnik		custom made
Disposable scalpel No. 11	Feather	20.001.30.011
Dräger Vapor 19.3 isoflurane system	Dr. Wilfried Müller GmbH
Dumont #2 - laminectomy forceps	Fine Science Tools	11223-20
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools	11251-30	super-fine
Dustless precision pellets 45 mg	Bio-Serv	F0021
EthoVision XT	Noldus		setup and software
Forceps 160 mm	Hartenstein	PZ09
Gas anesthesia mask, rat	Dr. Wilfried Müller GmbH
Goal box for ladder rung walking task apparatus	self made
Hair clipper Magnum 5000	Wahl GmbH
Hardened fine scissors	Fine Science Tools	14090-11
Heating table	MEDAX	13801
Isofluran CP 1ml/ml, 250 ml	cp-pharma	1214	prescription needed
Kinovea	www.kinovea.org
Ladder rung walking task apparatus	self made
Needleholder	KLS Martin	20-526-14-07
Octeniderm	Schülke	118211
Rimadyl 50 mg/ml, injectable	Zoetis		Carprofen, prescription needed
Rubber band retractors	self made
Spacer for beam	self made
Spacer for ladder rung walking task apparatus	self made
Suture Silkam 4/0 DS 19	B. Braun	C0762202
Ultra fine hemostats (non-serrated clamp)	Fine Science Tools	13020-12